單克隆抗體制備技術的研究現狀

摘要：單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）作為一種有效的生物制劑，廣泛應用于疾病的診斷和防治中。為解決傳統的mAb制備技術存在制備周期長抗體親和力低等弊端，科研人員在傳統雜交瘤技術基礎上研發了抗體展示技術、嵌合抗體技術和轉基因小鼠技術及單個B細胞技術等抗體制備新策略，從而使mAb制備技術得到較快發展。從應用廣泛的mAb制備新技術研究進展出發，對這些技術的原理、優缺點及其在新發和重大傳染病防治中的應用現狀和前景進行概述，旨在為mAb制備技術研究和疫病防控提供理論參考。

關鍵詞：單克隆抗體；新技術；應用現狀

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0725

中圖分類號：S85 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）11021015

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）是由單一B細胞克隆受到抗原刺激分化形成的漿細胞分泌的結構均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，因其具有特異性強、純度高、均一性好等優點，廣泛應用于疾病的診斷和防治。1975年，K?hler等[1]將能分泌抗綿羊紅細胞抗體的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，使對靶抗原具有高特異性和親和力的mAb有望成為臨床治療的生物制劑，從而開啟了mAb 研發的新紀元[23]。mAb 作為一種生物研究工具[4]，在生物科學研究及醫學領域中發揮著重要作用[56]，如在細菌性疾病（如炭疽）和病毒性疾?。ㄈ绨滩。┲杏袕V泛應用[7-9]。繼傳統雜交瘤技術之后，科研人員已經開發和完善了多種mAb制備新技術，如噬菌體展示技術、單個B細胞抗體制備技術，在延長B細胞壽命、提高B細胞和骨髓瘤細胞的融合率、克服人抗小鼠抗體反應、構建優良的抗體文庫等方面優化mAb性能[10-12]，以滿足其應用需求。根據mAb制備技術的特點，將其分為抗體展示技術、單個B細胞抗體制備技術和其他抗體制備技術。本文對上述技術的研究現狀進行概述和總結，以期為mAb制備技術的發展提供理論借鑒。

1 抗體展示技術

雜交瘤技術雖然為mAb研發及應用提供了有效、簡便的支撐技術，然而其制備周期長，且產生的抗體存在免疫原性高和半衰期短等缺陷，研究人員相繼開發了噬菌體展示技術、酵母展示技術和核糖體展示技術，以獲得優良mAb。

1.1 噬菌體展示技術

自100多年前發現噬菌體以來，其結構和功能陸續被解析，并被作為克隆載體應用到基因工程中。1985年，Smith[13]將噬菌體作為載體，借助基因工程手段將編碼57個氨基酸多肽的外源基因插入絲狀噬菌體衣殼蛋白pⅢ基因中，隨著子代噬菌體形成而重新組裝，該外源蛋白質或多肽與噬菌體的衣殼蛋白pⅢ融合表達在噬菌體表面，即為噬菌體展示技術。噬菌體展示技術是一種用于篩選和分離靶標特異性肽的有效技術，即在噬菌體基因組中插入編碼相應多肽的基因，在噬菌體表面展示外源肽或抗體[14-16]。在此技術中主要用到3類噬菌體，分別為裂解性噬菌體（T4）、溫和性噬菌體（λ）和溶原性噬菌體（M13）[17]。其中，M13常用于多功能分析平臺，其各種功能區域進行功能傳導而不會相互干擾，且獨特的絲狀結構和柔韌性提高了靶向多肽親和力，被廣泛應用于mAb制備過程[18]。為了在噬菌體上展示外源多肽，將所需DNA 序列插入M13噬菌體pⅢ或pⅧ蛋白的基因中。使用主要衣殼蛋白pⅧ的方法提供了多價展示，只有含6～7個氨基酸的短肽可以在衣殼蛋白pⅧ基因上展示[19]。因此，大多數組合文庫（如抗體或蛋白質）都使用衣殼蛋白pⅧ展示。自1990年Mccafferty等[20]在絲狀噬菌體上成功展示了人類單鏈抗體（single-chain fragment，scFv）以來，該技術在制備人類和其他動物抗體方面得到較快發展。2002年，利用噬菌體展示生產的首個獲批的單抗adalimumab 可用于治療類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）；2011 年治療系統性紅斑狼瘡的belimumab 在美國上市；2012年治療吸入性炭疽的raxibacumab上市[2122]。Meyer等[23]成功制備了靶向鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白D（outer membrane protein D，OmpD）的特異性scFv，且可用于競爭性酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）中檢測鼠傷寒抗原。Henning等[24]成功研發了治療炭疽的抗體obiltoxaximab 并于2020 年獲批上市。Hülseweh 等[25] 用西部馬腦炎病毒（western equineencephalitis virus，WEEV）免疫獼猴，經噬菌體展示篩選到WEEV 的中和抗體ToR69-3A。Bertoglio等[26]和Roth等[27]用噬菌體展示技術篩選抗SARSCoV-2 的抗體COR-101，且該抗體正處于臨床驗證階段。

噬菌體展示技術因具有高通量、篩選周期短、操作簡單、不受免疫程序和機體內環境影響等優點，常被用于展示不同類型蛋白，因此在藥物研發和抗體篩選方面具有廣泛應用前景[28]（表1）。然而該技術也存在不足之處，如不能進行真核表達、氨基酸的改造受宿主限制等仍是噬菌體技術在應用中亟待解決的問題[39]。

1.2 酵母展示技術

酵母展示技術（yeast display technology，YSD）是一種基于真核表達系統的抗體制備技術，可在一定程度上彌補噬菌體展示技術不能高效地對展示抗體進行翻譯后修飾的缺陷[40]。YSD原理是將外源蛋白與酵母衣殼蛋白融合從而將外源蛋白展示在酵母表面。自1997 年YSD 初次用于制備mAb以來，已成功篩選到靶向程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1， PD-1）的全人源化sintilimab等單抗，在篩選和構建抗原結合片段（antigen-binding fragment， Fab）庫、scFv庫和免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）庫等抗體工程中發揮重要作用[41-46]。YSD用真核系統表達宿主蛋白質，可在內質網和高爾基體中更準確地翻譯蛋白質，且能使蛋白質進行更好地折疊、修飾。此外，YSD 在熒光激活細胞分選（fluorescenceactivatedcell sorting，FACS）時可實時進行參數分析，并準確地區分表現不同特性（如親和力或穩定性）的突變體，是制備工程抗體的有力技術，酵母雜交已用于生成抗體庫以提高其轉化效率[47]。迄今為止，YSD在蛋白質?蛋白質相互作用、抗體設計、疫苗和抗生素開發、生物傳感器生產、免疫動物中篩選抗體庫中的應用已被報道[48]。此外，YSD還可應用于篩選非常規抗體[49]。YSD是一項有應用前景的技術，但需在生物技術應用方面進行優化，如其篩選的抗體庫容量只有109，比基于噬菌體和細菌展示技術獲得的抗體庫容量（分別為1011～1012、1011）低了2～3個數量級[50]。因此，提高抗體庫容量及展示效率是應用YSD需關注的問題。Ferrara等[51]將噬菌體展示和酵母展示相結合來篩選抗體，彌補了YSD篩選抗體庫容量小的不足；Kova?evi? 等[52] 利用綠色熒光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）提高酵母展示對葡萄糖氧化酶的高通量篩選的性能。由于酵母表面存在多個支架蛋白，在篩選抗體時可能會出現多種隨機的寡聚蛋白結合，應盡量避免此類現象的發生，保證篩選抗體的結合力。近年來，研究者在啟動子、信號肽、靶標、借助多種酶進行表達、選擇不同酵母菌株（更換細胞壁蛋白質組成以獲得合適的展示環境）、酵母細胞壁修飾和修飾分泌通路等方面對酵母展示技術進行優化，使其更好地應用于篩選mAb[53]。

1.3 核糖體展示技術

核糖體是細胞內的重要細胞器，承擔著合成蛋白質的任務。在生物學研究中，核糖體展示技術逐漸成為一種熱門的mAb制備技術。1997年，Hanes 等[54] 成功地將核糖體展示技術（ribosomedisplay technology，RDT）用于創建多肽庫，挖掘了該技術在抗體制備中的潛力。RDT利用PCR 擴增能分泌目的抗體的B細胞的cDNA，然后將擴增的目的片段轉移至核糖體進行5個循環的轉錄、翻譯、抗原親和力篩選等過程，獲得正確折疊和修飾的scFv或蛋白質。皮爾斯病（Pierce’s disease，PD）是由木質部難養菌引起的一種葡萄養殖業常見細菌病，Azizi 等[55]和Kunamneni 等[56]利用兔真核網狀組織在體外合成抗體核糖體展示文庫中篩選到靶向木質部難養菌外膜蛋白MopB 的重組scFv，為篩選PD治療抗體提供了一種簡單而穩定的展示技術。在翻譯的過程中，因為mRNA 3’末端缺失終止密碼子，發生mRNA-蛋白質結合在核糖體表面的現象，出現蛋白質（抗體）?核糖體-mRNA（protein-ribosome-mRNA，PRM）三元復合物，將單個抗體片段與其相應的mRNA連接起來。PRM復合物是mRNA移除末端終止密碼子而形成的，導致翻譯時核糖體在mRNA末端停滯，新生的多肽不能釋放。蛋白質-mRNA連接的同時通過具有相似親和力的相應配體分離mRNA及所需蛋白質（抗體）。與配體緊密結合的蛋白質-mRNA復合物經逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）恢復編碼蛋白質的DNA序列，并在PCR中擴增生成可用于進一步加工和表達蛋白質的模板，或再進行3～5個循環的轉錄、翻譯以獲得特異性強、庫容量大和親和力高的抗體庫[57]。

RDT是一種高效的體外無細胞系統，在體外產生蛋白質-mRNA復合物，克服了基于細胞方法的許多局限性[58]。與雜交瘤技術相比，RDT有許多優點。首先，該方法無需細胞，通過真核系統提高轉化效率、選擇高親和力結合位點且能夠進行翻譯后修飾，在篩選大型文庫時不會影響文庫大小，且篩選效率更高。其次，該技術通過RT-PCR技術易于構建大量點突變體文庫。此外，由于不涉及細胞培養，故制備mAb過程更快速，所以RDT已廣泛用于真核生物和原核生物翻譯系統[59]。RDT在生物學研究中具有廣泛的應用場景（表2）。首先，RDT可用于篩選特定的抗體或抗原，在研究機體免疫、有效治療疾病方面有重要作用。其次，RDT可用于研究蛋白質的結構和功能，從而揭示其在生物過程中的作用機制。此外，RDT還可用于尋找新的藥物靶點和開發新的藥物，為藥物研發提供新的思路和方法。RDT的出現為生物學研究帶來了新的機遇，同時也存在一定的挑戰，該技術存在一個明顯不足之處，即篩選文庫時功能性核糖體含量取決于該文庫的大小。同時，如何進一步增強體系的穩定性，并使其抗體復合物保持穩定的狀態也是亟待解決的問題[65]。

2 單個B 細胞抗體制備技術

單個B細胞抗體制備技術可以通過識別和提取特異性B細胞抗原，并將特異性B細胞基因進行擴增，再經過表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體等步驟，最終篩選出有效的目的抗體。該技術可以在僅有少量B 細胞的情況下快速地完成mAb的制備，同時還能保留抗體輕重鏈可變區，具有高效率、多樣性等優勢，是強有力的mAb 制備技術[66]。

2.1 鑒定和分離單個B 細胞

抗體主要來源于外周血的漿細胞、單個記憶B細胞及從正常的骨髓中分離前B細胞[67]。因研究目的不同，抗體基因的來源有所差異。當外周血充足時，可采用濃度梯度方法或采用流式分選等方法從外周血液中初步分離B細胞，利用酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）技術對抗原特異性細胞的豐度進行評估，篩選出抗原特異性抗體含量高的血液樣本，以獲得更高含量的特異性抗體[68]。ELISA技術是一種實驗室常見的檢測抗體的方法，Gilbert等[69]借助以細胞為試驗材料的ELISA技術（cell-based ELISA）可以檢測血液樣本中的抗腫瘤抗體水平，表明可以使用ELISA法對不同供血者的血樣中的特異性抗體含量進行直接比較。通過隨機或特異地分離抗原特異性B細胞可以有效地提取血清中的抗原特異性抗體，前者操作簡單，僅需分離B細胞，可用于血清中抗原特異性抗體含量高的免疫人員或病人，可最大限度地減少后續抗體特異性鑒定的工作量。而對于特異抗體比較少的患者，需分離抗腫瘤抗體、自身免疫抗體，則需要使用后者來分離抗原特異性B細胞，雖操作繁瑣，但有利于分選抗原特異性B細胞。

熒光激活細胞分選法（FACS）、激光捕獲顯微切割法（laser capture microdissection，LCM）和顯微操作法（micromanipulation）等是主要的隨機B 細胞分選方法（圖1）。顯微操作法作為一種分離B細胞的經典方法，可用于從早期胚胎或未培養的微生物中取出細胞，在顯微鏡引導下，通過手動操作顯微操作器，從而人工分離B細胞于含特異性培養液的培養基中，該方法不需要復雜的操作和特殊的儀器設備，但存在耗時較長、分離效率低和分離細胞種類有限以及吞吐量低的缺陷[70]。1986年，Monajembashi等首次提出激光微束顯微切割技術，使用激光微束對人染色體進行顯微解剖；1996年，Emmert-Buck等開發了一種基于免疫組庫的激光捕獲顯微切割法（immune repertoirelasercapture microdissection， IR-LCM）來分離靶細胞與組織，該系統需要通過組織化學和免疫熒光技術對樣品進行染色，再利用顯微激光切割系統對細胞形態和染色結果進行觀察，從而可以獲得單細胞群或單細胞的詳細信息[71]。LCM可以通過顯微鏡及熒光劑來實現可視化，一步即可從樣品中特異挑選同類細胞或單一細胞，且能準確定位、操作簡便；但該技術成本高、需要組織學的專業知識、不能在短時間內獲得大量單個B細胞，同時由于沒有蓋玻片易導致樣品脫水，解剖組織的質量可能無法達到進一步處理樣品所需的標準。FACS可用于分選血細胞、骨髓細胞、腫瘤細胞等多種類型的細胞，該方法基于熒光試劑與細胞分選儀，采用激光束來激發與抗體偶聯的熒光素產生熒光信號，從而自動地分選或分析細胞。該技術雖然對儀器和樣品的要求嚴苛、操作繁瑣，但其能靈活地分離多種細胞、分辨率率高、可操作性強且實現了自動化，已成為當前常用的隨機分離B細胞方法。

為分離出抗原特異性單個B細胞，當前廣泛應用的方法有熒光標記抗原多參數細胞分選法、抗原標記磁珠分選法、微雕法/細胞微陣列芯片法及酶聯免疫斑點微陣列芯片法（immunospot arrayassay on a chip，ISAAC）[7273]。表3為單個B細胞分離方法的優缺點。熒光標記抗原多參數細胞分選法是在FACS的基礎上，用帶有熒光的靶抗原與B細胞表面的膜抗體相結合，可有效地分離出抗原特異性B細胞，這種新興的分離B細胞的方法不僅可以迅速、精準、有效地從上萬個細胞中分選出抗原特異性B細胞，且具備對單個B細胞的多種參數的檢測功能，該技術不僅有助于提升篩查的精度，還能收集大量的B細胞的相關資料，并將其廣泛地應用到各種研究領域?？乖瓨擞洿胖榉诌x法的基本原理是目標抗原連接的磁珠能特異性將目標抗原與細胞表面目標抗原特異性抗體相結合，使能形成特異性抗原抗體復合物的B細胞吸附在磁場內，而未能連接磁珠的細胞則不能留在磁場中，從而高效、準確地分離目的細胞；盡管該方法的操作相對復雜，但其可在數分鐘內從復雜的細胞混合物中分離出高純度的目的細胞，因而已被用于從腫瘤樣本中分離單個細胞。微雕法根據靶細胞的大小表面抗原等特性在芯片上分離靶細胞，該方法是以微陣列芯片識別、軟光刻（softlithography）為基礎，將能產生抗原特異性抗體的B細胞進行恢復和克隆，獲得能夠產生特異性抗體的B細胞并誘導B細胞產生抗體，然后將產生的抗體依次置于芯片孔內，再將芯片轉移至相應蛋白芯片，從而實現對目標抗原的特異性識別，進而將攜帶目標抗原特異性抗體的B細胞轉移到培養皿中，進行下一步克隆[73]；該方法不僅能夠節省大量的時間和資金，還能迅速、準確地獲取大量克隆B細胞，同時也能準確地識別和檢測到抗體的分泌。ISAAC通過在芯片上包被抗免疫球蛋白抗體實現對B細胞的快速捕獲，并利用生物素標記的靶抗原實現對B細胞的快速、精準分選，這一技術在生產流感病毒抗體時發揮了重要作用。與微雕法相比，ISAAC法可以在同一芯片上同時篩選出多個靶標的抗體，從而大大提高了B細胞分選的效率，是微陣列芯片法的延伸和完善，在分選B細胞中具有良好廣闊的應用前景。

2.2 擴增和克隆抗體基因

在進行細胞分選時，一般需要把B細胞放入合適的容器（如96孔板），其中含有一定數量的細胞溶解液、RNA酶抑制劑以及PCR反應試劑。因為單細胞RNA的含量低，所以選擇合適的容器有利于進行大量操作，避免樣本丟失、防止交叉污染。B細胞的抗體表達水平因其基因轉錄本的數目而變化，這些基因轉錄本的數目比其他基因轉錄本的數目多得多，表明它們具有更強的免疫反應能力。為獲取更多的免疫反應信息，可以使用套式或半套式逆轉錄PCR（nested or semi-nestedRT-PCR）來檢測B細胞內的免疫反應基因，這一過程非常復雜，因為既考慮了檢測的準確度，又考慮了檢測的速度。因而，使用正確的引物序列和選擇合適的核酸擴增方法非常重要。在Smart常用的mRNA全長擴增技術中，SMARTScribe RT逆轉錄酶在poly-T堿基的下游引物處開始逆轉錄的第1步。然后，在轉錄結束時加入幾個超過模板的C堿基，之后可以使用具有3個G堿基的上游引物進一步擴增轉錄的cDNA，以增加捕獲RNA數量。這種技術不穩定，低表達的轉錄本可能會丟失。單細胞標記逆轉錄（single-cell taggedreverse transcription， STRT）技術使用生物素將cDNA固定在磁珠上并引入讀取標記進一步擴增環化的cDNA。然而，具有發夾結構的寡聚脫氧核苷酸被用作基于PCR的半隨機引物mRNA轉錄組擴增技術的引物，不能保證其擴增產物的完整性，且不能有效地防止插入、缺失及突變的發生[76]。

2.3 表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體

原核系統作為最早的基因表達系統，在表達抗體基因中較常用，為鑒定抗體的抗原特異性及生物活性提供了保障[77]。與之相比，通過使用真核表達技術，尤其是哺乳動物細胞表達技術能夠輕松地將抗體加工成具備高度穩定的結構和功能的產品，常見的有CHO、HEK293細胞系等。用親和層析和離子交換層析純化到的抗體不僅可用ELISA、蛋白質印跡（western blotting，WB）十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）分析，還能采用體內藥物活性測定法、免疫沉淀試驗、活細胞成像測定法、蝕斑法、半數蝕斑減少中和試驗等實驗室方法篩選或鑒定抗體及其生物學特性[78]。

3 其他制備技術

3.1 嵌合抗體技術

早期生產mAb大多是鼠源的，當該類抗體用于治療人類疾病時，在使用者體內會產生抗鼠抗體，即人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA），這是一種人體抵御異源蛋白侵害的有害免疫產物，以致于mAb 不能達到預期的治療效果。為此，Morrison等[79]開發了一種基于人源mAb恒定區與鼠源mAb相結合的嵌合方法，將其嵌入到載體中，實現對宿主mAb的高效轉染，從而提高治療效果；人鼠嵌合mAb通過基因工程改造，在保留mAb Fab片段的基礎上，獲得與人更加相似的mAb，具有良好的生物相容性。abciximab/IIIa 是美國食品藥品監督管理局（Food and DrugAdministration，FDA）于1994 年批準的一種新型的嵌合抗體，具有廣泛的臨床應用前景[80]。

另外，基于人?鼠嵌合型抗體，利用互補決定區（complementarity-determining regions，CDR）是抗體可變區（V區）的一部分，且具有與抗原發生相互作用并與之結合的功能，因而使用基因工程技術移除和植入外源的CDR，建立了一類新型的人源化抗體，并對其性能和功效進行探究[81]。當獲得了相應鼠源抗體后，只需將該抗體的CDR序列植入人類抗體，即可獲得90%以上由人源序列組成抗體，有效地保證了靶標抗體的特異性，可以顯著降低HAMA的產生。然而，此類mAb中仍有部分鼠源性基因片段，無法徹底消除人源化mAb產生的免疫排斥風險[82]。

3.2 轉基因小鼠技術

1989年，第一批全人源化mAb制備成功，其主要利用了噬菌體展示和轉基因小鼠2種平行技術，轉基因小鼠技術以轉基因小鼠為載體，利用基因工程手段在小鼠的基因組中插入人源化mAb的基因，從而實現人的抗體可變區基因在小鼠的淋巴細胞中的重組和表達。在此基礎上，對轉基因小鼠制備的雜合細胞進行篩選，最終得到具有較高親和力及抗原特異性的人源化mAb[83]。FDA于2006年通過了首個由基因改造的鼠源人體抗體panitumumab，其可以抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR），用于晚期結直腸癌的治療；2009年，靶向人類白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的canakinumab 被批準上市，用于治療周期性發燒和系統性青少年風濕性關節炎；同年，靶向CD20的ofatumumab也被批準上市，用于治療慢性淋巴細胞白血?。?020年，美國FDA 批準了首個治療埃博拉病毒的抗體——inmazeb，本質上是regeneron pharmaceuticals使用轉基因小鼠開發的3 種抗體（atoltivimab、maftivimab 和odesivimab）的混合物[84]。與其他制備人源抗體的方法比較，轉基因小鼠技術不僅具有增加抗體的多樣性、無需對抗體進行人源化加工等優勢，而且可在小鼠體內篩選成熟的、高親和力的抗體。然而，由于人源化mAb的基因較大，如何在轉基因小鼠體內更高效地表達人源化mAb重鏈的V（variable）基因片段、D（diversity）基因片段，和J（joining）基因片段，仍是轉基因抗體技術所需解決的難點。此外，轉基因動物產生的全人源化mAb并沒有野生型抗體產生的作用明顯，且轉基因小鼠免疫系統不能產生和人體完全相同的抗體。早期的方法是使用微型基因，即使使用少量基因也可以獲得具有良好結合特性的mAb[85]。為解決轉入的人源化抗體基因與動物B細胞結合的問題，獲得多樣性更豐富、親和力更高的候選抗體，需要對動物抗體產生的機制進行更加深入的研究，同時，在面臨突發性生物安全事件時，如何快速大量的生產全人抗體也是未來人源抗體轉基因動物培育需要重點解決的問題。

3.3 RNA-多肽融合技術

RNA-多肽融合技術又稱mRNA展示技術，該技術最早是Roberts等[86]用于體外選擇多肽和蛋白質的；Nemoto等[87]進行了類似的試驗。該展示系統采用了一種新型的生物信息學方法，即以嘌呤霉素為模板，將其與mRNA及mRNA編碼的多肽進行共價偶聯，并將其與mRNA的3’端相連。在基因表達過程中，核酸與DNA結合后，核酸與核酸結合。mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文庫可以在體外進行表達，之后用固定的目標分子篩選出純化的RNA-多肽復合物，類似于核糖體展示系統，該復合物可利用RT-RCR進一步擴增[88]。

4 抗體制備新技術在獸醫領域中的應用

開發和改進制備單抗技術是為了更好地發揮mAb在治療和防控動物疫病中的作用[89]。自mAb開發以來，雜交瘤技術就與之形影相隨，應用于非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV）等病原的mAb制備，相應地在細胞無限繁殖、細胞融合等方面得到一定的改進和優化。表4為mAb制備技術的優缺點及其應用。最先用于解決細胞無限繁殖的方法是利用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞進行融合，后來探索了用皰疹病毒感染人B 細胞以達到無限繁殖的效果。融合效率是制約雜交瘤細胞無限繁殖的重要因素，因此在雜交瘤技術制備mAb中，不僅需要考慮細胞能否無限繁殖，還需考慮雜交瘤細胞的融合效率。起初是通過用聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）與雜交瘤細胞化學融合來提高其融合效率。然而，PEG在一定程度上具有細胞毒性且可能發生非特異性膜融合。因此，又開發了促進雜交瘤細胞的病毒（如仙臺病毒、水泡性口炎病毒）或電融合等多種技術來代替PEG在雜交瘤細胞融合中的作用。盡管這些新方法比PEG介導的方法有所改善，但仍然不能特異性地控制特定B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合。雖然雜交瘤技術受到這些方面的限制，但由于其具有可操作性強、成本低廉等優點，目前仍是實驗室中制備mAb的常用技術。繼雜交瘤技術之后，研發了一系列針對mAb制備的技術，如一些體外抗體篩選技術在mAb制備中得到廣泛使用。自從將噬菌體展示技術引用到展示抗體或多肽中，因其具有高通量、篩選周期短、操作簡單等優點，已被用于分離各種類型的天然抗體，且篩選的抗體需經過生物淘選故而抗原特異性較高。噬菌體展示在免疫治療和疫苗開發領域發揮李重要作用，在動物疫病的防控方面也大有可為。然而在噬菌體表面上產生和呈現疏水肽或重組蛋白形成聚合體的問題仍未解決，開發新穎和改進的噬菌體展示平臺是噬菌體展示技術在抗體制備領域的重要突破口。繼噬菌體之后，酵母被應用到抗體制備中。酵母作為一種單細胞生物，依靠真核表達系統，在翻譯后正確折疊和修飾復雜的核蛋白，在一定程度上解決了噬菌體和細菌展示系統中缺乏翻譯后修飾以及錯誤折疊蛋白（抗體）的問題。在酵母表面錨定蛋白的C 端或N 端插入外源蛋白不會破壞表面蛋白的結構，也不會影響表面展示效果。此外，在酵母展示中，整個抗體的溶解度得到提高，因為該技術可用于哺乳動物糖基化的修飾中。此外，伴侶蛋白的存在有助于酵母正確折疊內質網中蛋白質，可用于制備ASFV單抗[99]。

此外，由于單個B細胞抗體能夠迅速生成高親和力、高特異性的人源抗體而備受重視，但仍面臨著諸多問題，如抗原標記、抗原分選、引物設計等。與此同時，其他經典的制備技術仍被廣泛應用。

5 小結與展望

隨著分子檢測技術、人工智能、微生物學發展，抗體制備技術也得到較大發展。Ravn等[100]首次將下一代測序技術應用到噬菌體篩選mAb過程中，大大提高了篩選目的抗體效率。Dufner等[101]利用噬菌體和核糖體展示提高了抗體篩選效率?；谌斯ぶ悄荛_發的AlphaFold 和RoseTTAfold 這2 種技術成功預測蛋白質結構[102103]。Ruffolo 等[104]開發了一種DeepAb 技術，可高效地預測和優化抗體結構?？贵w制備技術與下一代測序技術、細胞分選技術等生物技術相結合，與噬菌體、酵母菌、核糖體等相關生物材料的特性相結合，在人工智能軟件的幫助下必將在篩選mAb過程發揮更加強大的作用。盡管抗體制備技術在不同程度和方面上對mAb篩選工程進行了優化和改進，但無法改變mAb存在不能進行凝集反應、無法應用于一些檢測方法中且在治療病毒引起的神經性疾病作用有限等缺點，而納米抗體（nanobody，Nb）等新型抗體在一定程度上彌補了上述缺點，有望成為未來研發和利用的重要對象。表5和表6列出了幾種在獸醫及人醫領域常用的Nb。總體而言，無論哪種mAb制備技術都有各自的優勢和不足，在制備過程中需要根據使用mAb的目的和需要為導向，針對性地選擇抗體種類及其制備技術和方法。隨著人們越來越關注抗體藥物、試劑的安全性和有效性，抗體制備技術仍需在實踐過程中不斷解決自身的缺陷、不斷創新，從而得到更好的應用。

參 考 文 獻

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