清血消脂降糖方對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響及機制

關鍵詞 清血消脂降糖方；2 型糖尿病；胰島素抵抗；蛋白激酶R樣內質網激酶；叉頭框蛋白O1

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β細胞功能不足導致血糖調節失常為主要特征的慢性代謝紊亂疾病[1]。在T2DM中，IR 導致的高胰島素血癥和高血糖會通過負反饋機制加劇IR；同時胰島素反應性降低，無法有效抑制肝葡萄糖輸出，導致肝臟發生IR，從而進一步加劇糖脂代謝紊亂[2]。故改善IR是治療T2DM的關鍵策略。

IR、慢性低度炎癥與氧化應激之間關系復雜。慢性炎癥反應及氧化應激可通過損害胰島素信號傳導等途徑誘發或加重IR；同時，IR 可導致糖脂代謝紊亂，進而加劇炎癥反應和氧化應激，形成惡性循環[3]。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在IR 的發生發展中起著重要作用，當機體處于持續應激狀態時，內質網無法正確折疊蛋白質，從而引發ERS[4]。蛋白激酶R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）作為關鍵傳感器，在肝臟糖代謝中扮演著重要角色。當發生ERS 時，肝臟PERK 信號通路被激活，進而調節下游叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）活性，促進糖異生，增加肝糖輸出，最終加重IR引起的高血糖[5]。此外，PERK信號通路可通過抑制胰島素受體酪氨酸激酶活性、促進胰島素受體降解、抑制葡萄糖轉運和促進脂質合成等，進一步抑制胰島素信號傳導，加劇IR[6]。

清血消脂降糖方是在首都醫科大學附屬北京中醫醫院名老中醫臨床經驗方清血消脂方的基礎上繼承和創新而成，具有清熱瀉火、健脾化痰、活血消瘀的功效，臨床用于治療T2DM收效頗佳，但其具體作用機制尚不明確。本研究擬構建T2DM大鼠模型，初步探討清血消脂降糖方對T2DM大鼠IR 的影響，并從PERK/FOXO1信號通路出發初步探討其潛在作用機制，為該方防治T2DM提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有ACCU-CHEK Active 型血糖儀[羅氏診斷產品（上海）有限公司]、Synergy H1 型多功能酶標儀（美國Bio-Tek 公司）、3-18K型高速冷凍離心機（美國Sigma 公司）、Aperio CS2 型玻片掃描儀、Autostainer XL 型全自動染色機（德國Leica 公司）、MM400 型高通量組織研磨系統（德國Retsch 公司）、Tanon 4600 型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

黃連、虎杖、大黃、姜黃、澤瀉、萆薢、茵陳、白術、石菖蒲、紅花中藥飲片（批號分別為23052405、20221106、230513001、21061003、20231024、20221116、20230731、23101202、20230727、20230922）均購于北京同仁堂制藥有限公司，經首都醫科大學附屬北京中醫醫院藥學部韓旭陽副主任藥師鑒定均為真品；鹽酸二甲雙胍片（規格250 mg/片，批號H37020550）購于蓬萊諾康藥業有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-densitylipoprotein cholesterol，HDL-C）、天冬氨酸轉氨酶（aspartatetransaminase，AST）、丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）生化試劑盒（批號分別為20240123、20240123、20240123、20240123、20230714、20240120、20240120）均購于南京建成生物工程研究所；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、檸檬酸鈉緩沖液及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號分別為S8085、C1013、BC0025、BC5165）均購于北京索萊寶科技有限公司；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為A30640321、A38240412、A39440151）均購于杭州聯科生物技術股份有限公司；胰島素ELISA 試劑盒（批號BSI2405141864）購于上海愛萌優寧生物技術有限公司；鼠源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號TA-09）購于北京中杉金橋生物技術有限公司；兔源PERK多克隆抗體（批號24390-1-AP）購于武漢三鷹技術有限公司；兔源磷酸化PERK（p-PERK）多克隆抗體（批號3179S）、兔源磷酸化FOXO1（p-FOXO1）單克隆抗體（批號84192S）均購于美國CST公司；兔源FOXO1 單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG 二抗、HRP標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號分別為ab179450、ab6789、ab6721）均購于英國Abcam公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級SD雄性大鼠，共84 只，6周齡，體重（200±30） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號為SCXK（京）2021-0006]。大鼠購入后，飼養于首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫藥研究所SPF 級動物房內，飼養環境為12 h 明/12 h 暗交替、溫度（22±2） ℃、相對濕度（40±5）%，飼養期間大鼠自由活動。本實驗已通過首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫藥研究所實驗動物倫理委員會審查批準（倫理審批號為SQ-2022-02-50）。

2 方法

2.1 藥液制備

清血消脂降糖方組成：黃連30 g，虎杖、大黃、姜黃、澤瀉、茵陳、白術各15 g，萆薢、石菖蒲各10 g，紅花5 g。取以上藥材，用10 倍量水浸泡60 min，煎煮1 h，趁熱紗布過濾；取藥渣加8 倍量水二次煎煮30 min，過濾，合并煎液，濃縮濾液質量濃度為1.305 g/mL（以生藥量計）。使用研缽研磨二甲雙胍片直至粉末狀，計算所需給藥劑量后以0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液進行溶解。

2.2 造模、分組與給藥

SD大鼠適應性喂養1 周后，采用隨機數字表法將其分為正常對照組（8 只）和造模組（76 只）。正常對照組大鼠予以普通飼料飼養，造模組大鼠予以高脂高糖飼料飼養。連續喂養4 周后，造模組大鼠隔天按30 mg/kg 腹腔注射1 次STZ溶液（0.1 mol/L；以pH4.5 檸檬酸鈉無菌緩沖溶液為溶劑，現配現用），共注射3 次；正常對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。以大鼠非同日檢測（隔天檢測1 次）的3 次空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）＞11.1 mmol/L、隨機血糖＞16.7 mmol/L 為T2DM造模成功的判斷標準[7]，共有44 只大鼠造模成功。根據體重及FBG結果將造模成功的大鼠隨機分為模型組及清血消脂降糖方低、高劑量組（6.525、13.05 g/kg；根據人與大鼠體表面積換算，分別為0.5、1 倍臨床等效劑量）和二甲雙胍組（陽性對照，0.18 g/kg，臨床等效劑量），每組11 只。給藥組大鼠灌胃相應藥物，正常對照組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水；每日1 次，持續6 周。實驗期間，正常對照組大鼠均存活，模型組大鼠因血糖持續升高死亡4 只，3 個給藥組大鼠因在實驗過程中操作不當共死亡4 只，每組最終均以8只大鼠進行實驗。

2.3 體重、FBG測定及口服葡萄糖耐量試驗

給藥前及給藥后每周末記錄大鼠體重、FBG。末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，進行口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），測量各組大鼠FBG（即0 min 時血糖值），然后灌胃50% 葡萄糖溶液（2g/kg），分別于糖負荷30、60、120 min 時，采用尾尖取血法測定大鼠血糖值，繪制OGTT曲線并計算葡萄糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。葡萄糖AUC＝（0min 血糖值+2×30 min 血糖值+3×60 min 血糖值+2×120 min血糖值）/4。

2.4 取材及樣本處理

OGTT后第2 天，大鼠禁食不禁水12 h，稱重并測量大鼠FBG 后，處死大鼠，腹主動脈取血并以3 000 r/min離心10 min，留上清，置于－80 ℃冰箱中保存。取血后，解剖大鼠，迅速取相同部位的肝臟中葉，使用生理鹽水漂洗干凈，將部分組織固定于10% 中性固定液中，另一部分組織置于－80 ℃冰箱中保存。

2.5 血清胰島素水平、生化指標及炎癥因子檢測

取血清樣品，采用ELISA 法檢測血清空腹胰島素（fasting insulin，FINS）水平，并計算大鼠胰島素抵抗指數（HOMA-IR）及胰島素敏感指數（insulin sensitivity index，ISI）。HOMA-IR＝FINS（mIU/L）×FBG（mmol/L）/22.5，ISI＝1/（FBG×FINS）。由于ISI 為非正態分布，計算結果取自然對數[8]。采用微量法檢測大鼠血清中血脂（TC、TG、LDL-C、HDL-C）、肝功能（ALT、AST、AKP）及氧化應激（MDA、SOD）指標水平；采用ELISA 法檢測血清中炎癥因子（IL-6、TNF-α、CRP）水平。

2.6 肝組織病理學觀察

取10% 中性固定液固定的肝組織，經乙醇梯度脫水后，依次放入二甲苯中透明，再浸入石蠟中進行包埋，制成5 μm厚切片。使用全自動染色機進行HE染色后，采用玻片掃描儀進行成像。

2.7 肝組織中PERK/FOXO1 信號通路相關蛋白表達檢測

采用Western blot 法檢測。取適量置于－80 ℃保存的大鼠肝組織，加入RIPA裂解液進行勻漿，靜置30 min后，在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，取上清，采用BCA 法檢測總蛋白濃度。每組取15 μg 總蛋白煮沸變性，上樣進行電泳（以恒壓80 V啟動，蛋白進入分離膠后調至120 V），在恒流400 mA下濕法轉膜，以快速封閉液封閉；加入β-actin（稀釋度為1∶2 000）、PERK（稀釋度為1∶500）以及p-PERK、FOXO1、p-FOXO1（稀釋度均為1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜；漂洗3 次，加入對應二抗（稀釋度均為1∶10 000），室溫孵育40 min；漂洗3 次，應用化學發光儀進行成像，采用Image J 軟件分析蛋白灰度值，以p-PERK 與PERK、p-FOXO1 與FOXO1 的灰度比值分別表示PERK、FOXO1蛋白的磷酸化水平。

2.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 9.5 軟件進行數據分析和作圖。通過Shapiro-Wilk 進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以x±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 清血消脂降糖方對T2DM大鼠體重、FBG的影響

給藥前，與正常對照組比較，其余各組大鼠體重均顯著降低（P＜0.05），FBG均顯著升高（P＜0.05）。給藥6 周后，與模型組比較，清血消脂降糖方高劑量組和二甲雙胍組大鼠體重均顯著升高（P＜0.05），FBG 均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 清血消脂降糖方對T2DM大鼠OGTT結果的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠在糖負荷30 min時血糖值達峰值，且在糖負荷60、120 min 時血糖值及葡萄糖AUC 仍顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，清血消脂降糖方高劑量組和二甲雙胍組大鼠在糖負荷0、120 min 時的血糖值、葡萄糖AUC 以及二甲雙胍組大鼠在糖負荷30 min 時的血糖值、清血消脂降糖方低劑量組大鼠葡萄糖AUC 均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.3 清血消脂降糖方對T2DM大鼠血清胰島素水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠FINS、HOMA-IR顯著升高（P＜0.05），ISI 顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，清血消脂降糖方高劑量組和二甲雙胍組大鼠FINS、HOMA-IR 均顯著降低（P＜0.05），ISI 均顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

3.4 清血消脂降糖方對T2DM大鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中LDL-C、TC、TG水平均顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中LDLC、TC、TG水平均顯著降低（P＜0.05），清血消脂降糖方高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清中HDL-C水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表4。

3.5 清血消脂降糖方對T2DM大鼠肝功能、氧化應激及炎癥相關指標的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、AKP、MDA、IL-6、TNF- α、CRP 水平均顯著升高（P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中ALT、AST、AKP、MDA、IL-6、TNF-α、CRP 水平均顯著降低（P＜0.05），清血消脂降糖方高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清中SOD水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表5。

3.6 清血消脂降糖方對T2DM大鼠肝組織病理學的影響

正常對照組大鼠肝組織形態規則，肝小葉結構緊密，肝細胞排列有序，肝血竇界限清晰，周圍未見明顯纖維組織增生或炎癥細胞浸潤，膽小管和門管區結構較為完整。模型組大鼠肝組織結構異常，肝細胞排列紊亂，出現明顯空泡變性及脂肪變性；胞漿內可見脂滴空泡，肝血竇出現少量瘀血現象，炎癥細胞浸潤明顯。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織形態及病理變化均有不同程度改善。結果見圖1。

3.7 清血消脂降糖方對T2DM大鼠肝組織中PERK/FOXO1 信號通路相關蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中PERK、FOXO1 蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，清血消脂降糖方高劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織中PERK、FOXO1 蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2、表6。

4 討論

T2DM屬中醫“消渴”范疇，首見于《素問·奇病論》。《重廣補注黃帝內經素問》言：“中滿則宿食積滯，脾氣上溢……終致消渴之疾”。這提示恣食肥甘厚味，致使胃熱熾盛，乃消渴主要病機。《醫門法律》認為：消渴病始于胃熱，形成中消之癥。可見，T2DM早期多以實熱證為主，尤以胃熱熾盛為要。再者，過食肥甘，胃失和降，脾失健運，致痰濕內生；脾失運化，水谷精微不得輸布，影響宗氣生成，而血行瘀滯，凝而留止[9]。如此，熱、痰、濕、濁、瘀等病理因素相互交織，共同促進了消渴初期的發生與進展。針對此病機，清血消脂降糖方精妙配伍，以黃連為君，其味苦、性寒，專于清熱燥濕、瀉火解毒，尤善清除胃熱、治療濕熱壅滯之癥；虎杖助其利濕化痰、散瘀解毒；大黃則通腑降濁、活血祛瘀。三藥合用，既增強清熱解毒之力，又通腹泄濁，使毒邪從下而出，同時避免黃連燥濕過甚之弊。姜黃性溫、活血行氣，既助虎杖、大黃活血之力，又消君藥之苦寒；茵陳、澤瀉、萆薢共為臣藥，強化利濕化痰之效；佐以白術、石菖蒲健脾醒脾、和胃化痰；更用紅花為使藥，加強活血之力，引諸藥之力祛除血脈之瘀滯。在臨床應用中，該方不僅能有效緩解T2DM患者早期口渴多飲、消谷善饑等胃火熾盛癥狀，還能通過健脾化濕、祛痰活血的作用，改善患者乏力、肢體困重、舌厚苔膩等癥狀，促進體內熱毒、脂濁、痰濕、瘀血等病理產物排出，切中T2DM早期關鍵病機環節。

肝臟是調節血糖平衡的重要器官，可通過糖原合成與分解、糖異生等途徑維持血糖的穩定。健康狀態下，肝臟對胰島素的敏感性較高，能迅速響應胰島素信號，降低血糖濃度；而在T2DM患者中，肝臟IR 現象顯著，導致其對胰島素敏感性降低，無法有效調控血糖[10]。本研究結果顯示，清血消脂降糖方可降低T2DM大鼠FBG，改善葡萄糖耐量異常，降低血清胰島素水平，增加胰島素敏感性，降低血清中LDL-C、TC、TG水平，提高血清中HDL-C水平，改善肝功能及肝組織病理變化，糾正糖脂代謝紊亂。

慢性低度炎癥在T2DM的發病機制中發揮著重要作用。長期的高血糖和代謝紊亂會引發持續性炎癥反應，損害胰島β細胞功能，并導致胰島素反應減弱，進而引發IR。此外，相關研究提出了“腸道-下丘腦-肝臟/脂肪/胰腺軸”的新概念，認為在代謝紊亂和炎癥條件下，這些器官之間的相互作用形成的局部炎癥微環境會加劇全身的炎癥，推動T2DM的發展[11]。因此，降低機體炎癥反應對防治T2DM具有重要意義。IL-6 在高水平時可損壞胰島β細胞功能；TNF-α可通過不同機制干擾胰島素信號傳導，導致IR；CRP 水平升高會加重IR[12]。本研究結果顯示，清血消脂降糖方可降低T2DM大鼠血清中IL-6、TNF-α、CRP 水平，表明清血消脂降糖方可以緩解T2DM大鼠炎癥狀態。

氧化應激與T2DM的發生發展密切相關，是誘發IR的重要因素之一。MDA是脂質過氧化的產物，可作為衡量氧化損傷程度的重要指標；而SOD為抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受氧化損傷[13]。在T2DM大鼠模型中發現，升高血清SOD活性、降低MDA水平，可保護胰島β細胞功能免受氧化應激的損害，緩解IR[14]。本研究結果顯示，清血消脂降糖方可降低T2DM大鼠血清中MDA水平并升高SOD活性，這對于緩解T2DM大鼠IR 具有重要意義。

ERS是細胞應對各種壓力的保護性反應。PERK作為ERS 的關鍵傳感器，在維持細胞穩態中發揮重要作用。然而，PERK的長期或過度激活會導致細胞功能紊亂，并與多種代謝性疾病相關，包括T2DM[15]。FOXO1作為關鍵轉錄因子之一，在T2DM的發生發展中扮演著重要角色。具體而言，FOXO1 可通過抑制胰島素信號傳導及葡萄糖攝取、促進糖異生及脂質合成等機制，導致糖脂代謝紊亂，引發IR，增加T2DM及其并發癥的發生風險[16]。當細胞發生氧化應激時，PERK被激活，進而使FOXO1 磷酸化，增強其轉錄活性。激活的FOXO1 一方面可以誘導抗氧化酶的表達，發揮保護作用；另一方面，過度激活FOXO1 會加劇氧化應激和炎癥反應，進一步損害胰島β細胞功能，促進IR 的發生發展[17]。本研究結果顯示，經清血消脂降糖方干預后，T2DM大鼠肝臟組織中PERK、FOXO1 蛋白磷酸化水平降低，表明清血消脂降糖方可能通過抑制PERK/FOXO1 信號通路調控T2DM大鼠炎癥反應及氧化應激水平，改善IR。

綜上，清血消脂降糖方可調節T2DM大鼠糖脂代謝、氧化應激和炎癥水平，同時提高胰島素敏感性，緩解肝臟損傷，從而改善IR，其作用機制可能與抑制PERK/FOXO1 信號通路有關。本研究為清血消脂降糖方防治T2DM提供了實驗依據，后續本課題組將深入研究其涉及的分子機制。