雞滑液囊支原體HB-MS分離株致病性研究

摘 要：為深入研究河北省某蛋雞場支原體病發病和迅速擴散的原因，本研究對現場的致病因子開展了病原學和生物學特性的研究。采集病雞上顎裂粘液樣本，通過細菌生物學特性分析、形態觀察、PCR檢測、測序和動物回歸試驗等，成功分離并純化到了一株雞滑液囊支原體。結果表明分離株HB-MS可降解葡萄糖產酸使培養基變黃色，在顯微鏡下可以觀察到經典“荷包蛋”狀菌落，符合支原體的生物學特征；SPF雞致病性試驗分析顯示，HB-MS具有較強致病性，并能再次分離到；遺傳進化分析顯示，本次分離的HB-MS株與現有支原體親緣關系較遠。以上研究結果為蛋雞支原體防控提供了重要的科學依據，有助于制訂有效的治療和預防策略。

關鍵詞：雞滑液囊支原體；分離鑒定；致病性試驗；藥敏試驗

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2025）01-0048-05

雞支原體感染（Mycoplasma gallisepticum infection），又稱慢性呼吸道病（CRD），可以長期潛伏在雞群中。感染后的雞只會出現一系列臨床癥狀，包括呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、鼻腔和眼瞼分泌物增多等[1]。主要通過呼吸道飛沫、直接接觸及垂直傳播等途徑傳播，污染的飼料、水和設備也可能成為感染的媒介。由于支原體沒有細胞壁，對許多常用的抗生素如青霉素類和頭孢菌素類具有天然耐藥性，因此治療起來相對困難[2]。診斷雞支原體感染通常需要綜合考慮臨床癥狀、流行病學信息以及實驗室檢測結果。其中，PCR技術因其高靈敏度和特異性，已成為診斷支原體感染的常用方法[3，12-14]。

對某肉雞場區內支原體發病情況開展持續性監測。結果發現，外地運輸來的一批飼料中攜帶支原體，致使支原體在該場迅速傳播，發病雞表現腳墊腫大、腿關節化膿性炎癥以及呼吸道炎癥等臨床癥狀，兩周內雞群整體患病率為70%，病死率高達55%。

1" 材料與方法

1.1" 材料

雞滑液囊支原體改良Frey液體培養基、改良Frey固體培養基均購自北京中海生物科技有限公司中海生物科技（棗莊）有限公司，雞滑液囊支原體MS-HB分離株由北京華都峪口家禽研究院分離并保存。試驗過程中使用的SPF雞胚購自于北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.2" HB-MS分離株的分離培養與純化

送檢病雞每日死亡6～8只，呈現典型的呼吸道癥狀，腳墊、腿關節處出現腫脹，喜臥拒食。滅菌棉拭子采集上腭裂處粘液，溶于滅菌PBS（pH=7.4），經過0.45 μm濾器過濾，將濾液以1：4置于支原體液體培養基中，同時做3個重復，置于37 ℃有氧溫箱中培養，待培養基顏色變黃后進行傳代3次，后接種于支原體固體培養基上培養3～5 d，每間隔12 h觀察一次，低倍鏡下可見典型的“荷包蛋”樣菌落，挑單菌轉移至支原體液體培養基中增菌培養，上述過程需重復3次，以確保單菌落的純化效果，所得純化菌液保存于-80℃待用。

1.3" 臨床分離株MS基因檢測

使用Primer Primer 6.0設計MS基因片段擴增引物（P：5’-CAACCCTCCAGGTCAACTCT-3’；R：5′-CTCTTAACAGGATTCCAGCATGT-3’），片段大小為124 bp。PCR反應體系20 μL：DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增程序設置：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 min；55 ℃ 退火30 min；72 ℃延伸1 min，共35個循環。5 mL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以Gel Extraction Kit（200）膠回收試劑盒回收純化目的條帶，純化產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測通。使用DNA star軟件，將所得基因序列與經典株進行同源性比較。

1.4" 致病性試驗

將30只45日齡SPF雞平均分為3組，試驗1組經腳墊注射HB-MS菌液，濃度為106 CCU/mL，0.5 mL/只；試驗2組經腳墊注射HB-MS菌液，濃度為107 CCU/mL，0.5 mL/只；試驗3組經腳墊注射支原體改良Frey液體培養基，0.5 mL/只；每間隔12 h觀察雞群情況，攻毒14 d后剖檢觀察病理變化。

2" 結果

2.1" 菌落形態及初步鑒定

過濾的菌液接種于支原體液體培養基24 h后出現顏色變化，40 h后液面呈亮黃色（圖1A）；接種于支原體固體培養基40 h后肉眼可見大量針尖狀、透明樣菌落（圖1B），電子顯微鏡4倍下可見經典“荷包蛋”菌落（圖1C）。綜合支原體液體培養基中的指示劑因葡萄糖被分解產酸而變色、典型的支原體菌落形態等結果，可初步判定分離菌株HB-MS為支原體。

2.2" PCR鑒定及遺傳進化分析結果

PCR分別對HB-MS分離株的MS基因進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示MS基因的PCR擴增產物位于124 bp處，與預期條帶大小相符（圖2），空白對照無條帶出現。與GenBank中已登錄的禽源支原體MS基因部分核苷酸序列進行同源性比較，顯示HB-MS分離株與其他12株支原體親緣性較遠（圖3）。

2.3" 致病性結果

混合感染后第14天，對所有試驗組和對照組的雞進行剖檢，重點觀察了氣囊、腳墊的病理變化。試驗組死亡情況見表1，且試驗1組、2組雞的氣囊、腳墊均出現不同程度的病理變化（圖4）。腳墊組織病理學結果顯示，其疏松結締組織水腫，并伴有大量炎性細胞浸潤（圖5）。

3" 討論

雞滑液囊支原體嚴重危害我國養禽業發展，可水平和垂直傳播，傳染性高，極難凈化[4-5]。因此，支原體的防控凈化一直是困擾養雞業的難題。雞滑液囊支原體在臨床上主要采用的檢測方法是病原分離鑒定、血清學方法和生物學方法等[6-7]，其中病原分離鑒定是檢測的金標準，但臨床上該病常與其他細菌性疾病（如葡萄球菌、鏈球菌引起的關節炎等）混和感染，導致臨床死亡率升高和滑液囊支原體的分離率降低[8]，并且滑液囊支原體的臨床陽性率高，但分離率較低，極大制約了該病的防治。

雞支原體病嚴重影響家禽健康和生產性能，需要多措并舉才能有效防治這一疾病。當出現疑似支原體感染癥狀時，應盡早采集患雞的典型病料樣本進行實驗室檢測，確診是否為支原體感染。根據藥物敏感性測試結果，選擇有效的抗生素進行治療。在專業人員的指導下，按照推薦劑量和療程合理用藥，避免濫用和誤用藥物。與此同時，養殖場也應提高生物安全意識，嚴格控制人員和車輛進出，設立專門的消毒通道，對所有進入養殖區域的人員和車輛進行徹底消毒，防止病原體帶入。養殖場的雞舍、設備和周圍環境要定期進行徹底清潔和消毒，減少病原體的生存和傳播。對新引進的種雞進行嚴格的隔離觀察和健康檢查，確保它們未攜帶支原體[9]。采取必要的措施防止養殖場周邊野生動物和害蟲的侵入，避免傳播媒介進入場區感染雞群[10]。加強環境管理，保持雞舍良好的通風換氣，減少氨氣和其他有害氣體的聚積，注意合理控制養殖密度，避免過度擁擠導致的應激反應，為雞只創造一個舒適的生活環境。同時，臨床上預防支原體疾病發生的最優方案是制定合理的疫苗接種計劃，按計劃對雞群進行免疫接種[11]。高效、安全的疫苗品種，可以確保疫苗的質量和效力，并要注意接種時間、劑量和接種方式精確。

參考文獻：

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Study on chicken Mycoplasma synovialis HB-MS isolate strains pathogenicity and drug resistance

CAI Liangshuo1， LIU Wentao1，LIU Yanhan2， CHEN Shuo3，" CHENG Chunge3， LIU Ruonan1， ZHANG Liyong1， CHEN Jing2， ZOU Dongmin1

（1.Hebei North University ，Zhangjiakou" 076450， China;

2. Shandong Animal Disease Prevention and Control Center ， Jinan" 250010， China;

3.BeJing Huaduyukou Poultry Industry Co. LTD.， Beijing" 101206， China）

Abstract： In order to further investigate the causes of the onset and rapid spread of Mycoplasma infection in a chicken farm in Hebei Province， this study conducted a study on the pathogenic factors and biological characteristics on site. We collected mucus samples from the maxillary cleft of diseased chickens and successfully isolated and purified a strain of Mycoplasma pneumoniae through bacterial biological characteristics analysis， morphological observation， PCR detection， sequencing， and animal regression experiments. The results showed that the isolated strain HB-MS can degrade glucose and produce acid， causing the culture medium to turn yellow. Under the microscope， classic \"egg shaped\" colonies can be observed， which is consistent with the biological characteristics of Mycoplasma; The pathogenicity test analysis of SPF chickens shows that HB-MS has strong pathogenicity and can be re isolated. Genetic evolution analysis shows that the HB-MS strain isolated in this study has a distant relationship with existing Mycoplasma. The above research results provide important scientific basis for the prevention and control of Mycoplasma in laying hens， and help formulate effective treatment and prevention strategies.

Keywords： Mycoplasma; Isolation and identification; Pathogenicity testing; Drug sensitivity test

收稿日期：2024-08-08

基金項目：河北省現代農業產業技術體系建設專項資金（HBCT2024270407）；

山東省重點研發計劃（重大科技創新工程）項目（2022CXGC010606-03）

通信作者：鄒東敏（1990—），男，博士，從事動物臨床疾病防治相關工作，E-mail：1921892333@qq.com