6種脫毒劑對(duì)9608香菇菌絲生長及LeV-HKB病毒相對(duì)表達(dá)量的影響

摘" " 要：為了解決9608香菇種植出現(xiàn)的種性退化問題，以PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，研究6種脫毒劑處理對(duì)香菇菌絲生長速度、漆酶和羧甲基纖維素酶活性及LeV-HKB病毒含量的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花、香菇多糖處理的香菇菌絲生長速度分別提高9.33%、1.80%、4.76%、2.44%、0.39%，而卡那霉素和氨芐青霉素處理的香菇菌絲生長速度分別降低了5.26%和14.62%；與對(duì)照相比，脫毒處理均提高了菌絲漆酶活性；病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花以及香菇多糖處理后的羧甲基纖維素酶活性比對(duì)照分別提高了39.19%、31.08%、11.49%、10.81%、2.70%，卡那霉素和氨芐青霉素處理后的羧甲基纖維素酶活性比對(duì)照分別降低了22.97%、0.68%。所有處理中，菌絲生長速度與羧甲基纖維素酶和漆酶活性，均為病毒唑處理提高幅度最大。不同培養(yǎng)基生長菌絲的RT-PCR與qRT-PCR檢測結(jié)果表明，病毒唑處理基本不含LeV-HKB病毒。綜上，病毒唑處理可顯著提高香菇菌絲生長速度及羧甲基纖維素酶和漆酶活性，有效清除LeV-HKB病毒，該處理方式可為9608香菇優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供科學(xué)支撐。

關(guān)鍵詞：香菇；脫毒劑；酶活性；RT-PCR ；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S646.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）01-089-06

Effects of six detoxification agents on the growth of mycelium and relative expression level of LeV-HKB virus in 9608 shiitake mushroom

BAO Dandan1， LIU Ya’nan1， DUAN Nini1， 2， ZHANG Zhifeng1， 2， ZHANG Yingjun1， 2， LU Yunfeng1

（1. College of Life Sciences， Nanyang Normal University， Nanyang 473061， Henan， China; 2. Henan Engineering Technology Research Center for Mushroom-based Foods， Nanyang 473061， Henan， China）

Abstract： To address the issue of varietal degeneration in the cultivation of the 9608 strain of shiitake mushrooms， a study was conducted using PDA medium as a control to investigate the effects of six different detoxifying agents on the growth rate of mycelium， as well as the activity of laccase and carboxymethyl cellulase， and the content of the LeV-HKB virus. The results indicated that compared to the control， the growth rate of mycelium treated with viruszole， 1.5 tablets of berberine， 1 tablet of berberine， honeysuckle， and shiitake polysaccharides increased by 9.33%， 1.80%， 4.76%， 2.44%， and 0.39%， respectively. In contrast， treatments with kanamycin and ampicillin resulted in decreases in mycelial growth rate of 5.26% and 14.62%， respectively. Furthermore， the enzymatic activity of laccase in the mycelium increased following detoxification treatment compared to the control. The activity of carboxymethyl cellulase after treatment with viruszole， 1.5 tablets of berberine， 1 tablet of berberine， honeysuckle， and shiitake polysaccharides increased by 39.19%， 31.08%， 11.49%， 10.81%， and 2.70%， respectively， while treatments with kanamycin and ampicillin resulted in decreases of 22.97% and 0.68%， respectively. Among all treatments， the greatest enhancement in both mycelial growth rate and carboxymethyl cellulase and laccase activity were observed with viruszole treatment. RT-PCR and qRT-PCR analyses of mycelium grown on different media revealed that viruszole treatment essentially eliminated the LeV-HKB virus. In conclusion， viruszole treatment significantly enhances the growth rate of shiitake mycelium， increases the activity of carboxymethyl cellulase and laccase， and effectively eradicates the LeV-HKB virus， providing a scientific basis for the high-quality production of the 9608 strain of shiitake mushrooms.

Key words： Shiitake mushroom; Detoxification agents; Enzyme activities; RT-PCR; qRT-PCR

香菇富含營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，如香菇多糖、多酚、功能氨基酸等，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤和其他健康益處的功能，具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，在亞洲國家，特別是中國、韓國和日本廣泛種植[1-3]。

河南省西峽縣是中國香菇的主要產(chǎn)地，年產(chǎn)香菇超30萬t，9608品種自推廣以來，因其適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、菇性好等優(yōu)點(diǎn)，成為西峽縣的主栽香菇品種[4-5]。隨著香菇種植規(guī)模的逐年擴(kuò)大，香菇病毒問題日益凸顯[6-7]，引發(fā)了重大經(jīng)濟(jì)損失，影響社會(huì)穩(wěn)定[8]。中國香菇種質(zhì)資源中最常見的病毒有Lentinula edodes partitivirus 1 （LePV1）和L. edodes mycovirus HKB （LeV-HKB）2種[9-10]，LePV1和LeV-HKB能單一或復(fù)合感染香菇，且后者能顯著促進(jìn)前者基因的表達(dá)[11]。RT-PCR 是檢測香菇病毒存在的常用技術(shù)[6，12]，經(jīng)檢測9608香菇品種僅含有LeV-HKB[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，脫毒處理后的香菇具有更高的菌絲生長速率、菌落密度、酶活性和生物量[6-7，12]。香菇常用的脫毒方法有原生質(zhì)體再生脫毒法、單孢雜交法、菌絲體破裂法、斷橋式脫毒法以及脫毒試劑法[6，12-13]，相較其他方法，脫毒試劑法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，制備脫毒菌株用時(shí)短，簡便易行，效率高，優(yōu)勢(shì)明顯。病毒唑（利巴韋林）對(duì)人和動(dòng)物體內(nèi)的多種病毒具有良好的治療作用[14]，已成功應(yīng)用于香菇菌株（L856、L135和森源-1）脫毒[11]。黃連素抑制了細(xì)胞中HSV-1病毒的活性[15]，金銀花提取物在抗煙草花葉病毒方面具有良好防效[16]，氨芐青霉素和卡那霉素 2 種抗生素能阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成[17]，香菇多糖可以阻止細(xì)菌病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制[18]。因此，上述6種試劑有望用于香菇病毒的脫毒處理。

鑒于目前尚未有關(guān)于9608香菇脫毒的相關(guān)報(bào)道，試驗(yàn)以常規(guī)PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，研究病毒唑、黃連素、金銀花、香菇多糖、氨芐青霉素和卡那霉素等6種脫毒劑對(duì)9608香菇菌絲生長速度、漆酶和羧甲基纖維素酶活性及LeV-HKB病毒含量的影響，以期為食用菌菌株脫毒復(fù)壯提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2024年1—6月在河南省南陽師范學(xué)院菌類食品工程研究中心進(jìn)行。供試菌株為9608香菇，由河南省南陽市菌類食品工程研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，共設(shè)置8個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。對(duì)照組為常規(guī)PDA培養(yǎng)基，pH 6～7。除特別說明外，試驗(yàn)組（脫毒培養(yǎng)基）按表1所示，在分裝有250 mL PDA培養(yǎng)基的三角瓶中添加相應(yīng)比例的脫毒劑，調(diào)節(jié)pH至6～7，高壓滅菌，55 ℃時(shí)倒入脫毒鐵盒中，室溫冷卻凝固。其中黃連素培養(yǎng)基（2個(gè)梯度）：分別加入1.5片（150 mg）、1片（100 mg）的鹽酸小檗堿片；金銀花培養(yǎng)基：稱取200 g土豆和50 g金銀花，紗布包裹放入鍋中煮沸20 min，后續(xù)步驟與配置常規(guī)PDA相同；病毒唑培養(yǎng)基：加入25 mg利巴韋林藥片配置終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1；香菇多糖培養(yǎng)基：加入25 g香菇多糖配置終濃度（φ）為10%；卡那霉素培養(yǎng)基與氨芐青霉素培養(yǎng)基：在常規(guī)PDA冷卻至55 ℃時(shí)，分別加入質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的卡那霉素和氨芐青霉素各2.5 mL，搖勻后倒入脫毒鐵盒。

菌絲制備：挑取米粒大小的菌塊接入普通平板中，在25 ℃下培養(yǎng)12 d，然后切取平皿中生長旺盛的菌絲尖端2 mm接入PDA培養(yǎng)基和脫毒培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將脫毒鐵盒中菌絲塊（直徑6 mm）分別接入常規(guī)PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 香菇菌絲生長速度測定 采用十字交叉法測量菌落半徑，計(jì)算菌落半徑（mm）與生長時(shí)間（d）的比值（菌絲生長速度）。

1.3.2 漆酶、羧甲基纖維素酶活性測定 粗酶液的制備：待香菇菌絲生長12 d后，取0.1 g菌絲研磨，然后加25 mL ddH2O，40 ℃水浴中浸提2 h，5000 r·min-1、4 ℃下離心10 min，上清液為菌絲粗酶液。采用 DNS 試劑法測定羧甲基纖維素酶活性，采用鄰聯(lián)甲苯胺溶液法測定漆酶活性，以沸水滅活的粗酶液作為對(duì)照[19]。酶活性單位定義為 1 min 能轉(zhuǎn)化 1 μmol 底物的酶量，即 1 個(gè)酶活性單位（U）。

1.3.3 香菇病毒RT-PCR檢測 將待檢香菇菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃ 暗培養(yǎng)15 d，用刮鏟收集菌絲體，使用E.Z.N.A.? Plant RNA 提取試劑盒提取香菇菌絲體總RNA。設(shè)計(jì)引物（表2）對(duì)香菇病毒LeV-HKB的特異性區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)Reverse Transcription Kit（with gDNase）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。

將反轉(zhuǎn)錄的樣品通過RT-PCR檢測病毒，反應(yīng)總體系22 μL，包括0.9 μL cDNA，正反向引物各1 μL，11 μL enzyme Mix，8.1 μL DEPC處理水。香菇病毒定性分析的反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)檢測RT-PCR結(jié)果[10]。

1.3.4 香菇病毒qRT-PCR定量檢測 根據(jù)病毒基因組序列設(shè)計(jì)病毒特異性qRT-PCR檢測引物（表3）。反應(yīng)體系為10 μL：AceQTM qPCR SYBR Green Master Mix 5 μL、引物（0.25 μmol·L-1）各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)qRT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次。經(jīng)qRT-PCR反應(yīng)所得循環(huán)閾值即Ct值，采用2-△△Ct的方法計(jì)算各組中病毒的相對(duì)表達(dá)量[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。采用Norm Finder、 Graph Pad Prism 8.0分析香菇病毒定性和定量檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種脫毒劑處理對(duì)香菇菌絲生長的影響

由圖1可知，不同脫毒劑處理后，香菇菌絲均可生長，其中在病毒唑培養(yǎng)基上生長較快，第12 天菌絲已經(jīng)基本長滿平板且菌絲厚密。

2.2 6種脫毒劑處理對(duì)香菇菌絲生長速度的影響

由表4可知，與對(duì)照相比，脫毒劑處理能顯著影響香菇菌絲生長速度。病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花、香菇多糖處理的菌絲生長速度分別比常規(guī)PDA提高9.33%、1.80%、4.76%、2.44%和0.39%，其中病毒唑處理與對(duì)照呈顯著差異；卡那霉素與氨芐青霉素處理的菌絲生長速度則比常規(guī)PDA分別顯著降低5.26%和14.62%。以上結(jié)果表明，選擇合適的脫毒試劑能有效提高香菇菌絲的生長速度。

2.3 6種脫毒劑處理對(duì)香菇菌絲酶活性的影響

如表5所示，與常規(guī)PDA相比，不同脫毒劑處理的漆酶活性均有不同程度的提高，病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花、卡那霉素、氨芐青霉素和香菇多糖處理分別提高29.51%、3.28%、20.22%、19.12%、11.48%、8.74%和0.55%。與常規(guī)PDA相比，不同脫毒劑處理的羧甲基纖維酶活性有升有降，病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花和香菇多糖處理分別提高39.19%、31.08%、11.49%、10.81%、2.70%；卡那霉素和氨芐青霉素處理與常規(guī)PDA相比分別降低22.97%和0.68%。以上結(jié)果表明，合適的脫毒劑處理能顯著提高香菇菌株的漆酶和羧甲基纖維素酶活性。

2.4 6種脫毒劑處理對(duì)香菇病毒相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4.1 香菇HKB病毒定性檢測分析 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測香菇HKB病毒，如圖2所示。擴(kuò)增條帶清晰唯一，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目標(biāo)條帶一致，所有培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲均擴(kuò)增出Actin基因（250 bp）。除病毒唑培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲均擴(kuò)增出HKB病毒（589 bp），說明病毒唑處理能有效清除9608香菇的LeV-HKB病毒。

2.4.2 香菇HKB病毒定量檢測分析 qRT-PCR檢測結(jié)果如圖3所示，8組處理之間存在顯著差異。與常規(guī)PDA相比，黃連素1.5片和卡那青霉素處理顯著提高了病毒相對(duì)表達(dá)量；香菇多糖、1片黃連素、氨芐青霉素和金銀花處理后，病毒相對(duì)表達(dá)量顯著降低；病毒唑處理后，病毒相對(duì)表達(dá)量基本為0，相比常規(guī)PDA，病毒相對(duì)表達(dá)量顯著降低了98.00%。以上結(jié)果表明，病毒唑（利巴韋林）在6種脫毒劑中抑制病毒復(fù)制效果最佳。

3 討論與結(jié)論

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，香菇栽培規(guī)模逐年擴(kuò)大，香菇病毒問題日益凸顯[2]。香菇通過脫毒之后的生長速度和酶活性高于未脫毒對(duì)照，可能與以下因素有關(guān)。香茹屬于木腐類真菌，其菌絲體分解、腐蝕木材，將木質(zhì)素、半纖維素、纖維素等轉(zhuǎn)化成菌絲體的營養(yǎng)成分[22]。香菇能產(chǎn)生多酚氧化酶類，其中以漆酶最為重要，可把木材中不溶性的芳香類聚合物成分轉(zhuǎn)化為水溶性含有苯環(huán)的簡單化合物，苯環(huán)最后被破壞產(chǎn)生有機(jī)小分子化合物，被菌絲體加以吸收[23-25]。菌絲分解纖維素、木質(zhì)素的能力也反映了菌絲的生長速度[26-28]。感染病毒的香菇菌絲活性衰弱，菌絲纖維素酶及木質(zhì)素酶等酶活性明顯下降，分解培養(yǎng)料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的能力不足[8]。因此，脫除病毒能有效提升菌絲活力和分解培養(yǎng)料的相應(yīng)酶活性。本試驗(yàn)中，通過脫毒試劑法對(duì) 9608香菇菌種進(jìn)行脫毒處理，RT-PCR與qRT-PCR檢測結(jié)果表明，1片黃連素、金銀花、氨芐青霉素處理后能顯著降低香菇HKB病毒相對(duì)表達(dá)量；病毒唑處理能基本清除HKB病毒，這與Sun等[12]通過利巴韋林法消除LeV-HKB病毒的研究結(jié)果相同。

不同脫毒方法得到的脫毒效果可能相同。李京[22]研究表明，香菇經(jīng)過原生質(zhì)體再生脫毒后菌絲生長茂密，生長速度明顯高于未脫毒對(duì)照，且能有效去除香菇dsRNA病毒。通過對(duì)脫毒菌株與帶病毒菌株的研究，脫毒菌株的漆酶和羧甲基纖維素酶活性明顯高于帶病毒菌株，這與楊清香等[29]的結(jié)果相同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花、香菇多糖處理后，生長速度、漆酶和羧甲基纖維素酶活性均高于常規(guī)PDA，其中病毒唑處理的菌絲生長速度、漆酶和羧甲基纖維素酶活性均高于其他處理劑。病毒唑脫毒作為一種簡單、方便、容易實(shí)施的脫毒方法，能夠解決香菇菌株容易出現(xiàn)的菌種退化、香菇病毒病等問題。

綜上所述，9608香菇經(jīng)病毒唑、1.5片黃連素、1片黃連素、金銀花、香菇多糖脫毒處理后，菌絲生長速度、漆酶和羧甲基纖維素酶活性都有不同程度的提高。相較于其他脫毒劑，病毒唑能顯著提高香菇菌絲生長速度及羧甲基纖維素酶和漆酶活性，清除LeV-HKB病毒的能力最強(qiáng)。

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