蛋白酪氨酸磷酸酶受體R型對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響

摘要：目的探索蛋白酪氨酸磷酸酶受體R型（PTPRR）對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響。方法應用UALCAN網站對癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中膠質瘤樣本PTPRR的表達情況進行分析。取20例膠質瘤患者術中切除的新鮮腦膠質瘤組織及20例創傷性腦出血患者的正常腦組織，培養人膠質瘤細胞株及人星形膠質細胞系，取U87細胞分別轉染PTPRR的過表達質粒pcDNA3.1/PTPRR（pcDNA3.1/PTPRR組）和空白對照質粒pcDNA3.1（pcDNA3.1組）。實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測膠質瘤細胞系及膠質瘤組織的PTPRR mRNA表達；CCK-8實驗檢測細胞活性；集落形成實驗檢測細胞增殖能力；Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力；并進行細胞凋亡實驗。結果UALCAN網站分析顯示膠質瘤中PTPRR mRNA表達水平低于正常腦組織，且高級別膠質瘤低于低級別膠質瘤；PTPRR低/中表達者的生存期較高表達者更短。qRT-PCR結果顯示，PTPRR mRNA在膠質瘤細胞系及膠質瘤組織中均呈低表達；CCK-8實驗結果顯示，過表達PTPRR后24 h、48 h的膠質瘤細胞活性較pcDNA3.1組均降低。集落形成實驗、Transwell遷移及侵襲實驗結果顯示，過表達PTPRR后膠質瘤細胞集落形成個數、遷移及侵襲能力較pcDNA3.1組均降低。細胞凋亡實驗結果顯示，過表達PTPRR后膠質瘤細胞凋亡率升高。結論PTPRR在膠質瘤中呈低表達，且作為抑癌基因抑制膠質瘤細胞的活性、增殖、遷移及侵襲能力，促進膠質瘤細胞凋亡。

關鍵詞：神經膠質瘤；細胞增殖；細胞運動；腫瘤浸潤；蛋白酪氨酸磷酸酶受體R型

中圖分類號：R739.41文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240831

Effect of protein tyrosine phosphatase receptor R-type on malignant biological behavior ofglioma cells

GAO Rui1，ZHOU Guanen1，HONG Yan1，YAN Yan2，3△

1 Department of Neurology，Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300350，China;2 Clinical College of Neurology，Neurosurgery and Department of Neurological Rehabilitation，Tianjin Medical University;3 Department ofClinical Laboratory，Tianjin Huanhu Hospital

△Corresponding Author E-mail：yanyandoctor1982@163.com

Abstract：Objective To explore effects of protein tyrosine phosphatase receptor type R（PTPRR）on malignant biological behavior of glioma cells.Methods UALCAN website was used to analyze the expression of PTPRR in glioma samples from the Cancer Genome Atlas（TCGA）database.The fresh brain glioma tissue samples of 20 patients with glioma and normal brain tissue samples of 20 patients with traumatic cerebral hemorrhage removed during operation were obtained.Human glioma cell line and human astrocyte cell line were cultured.U87 cells were respectively transfected with PTPRR over-expression plasmid pcDNA3.1/PTPRR（pcDNA3.1/PTPRR group）and blank control plasmid pcDNA3.1（pcDNA3.1 group）.The expression of PTPRR mRNA in different glioma cell lines and glioma tissue samples were detected by quantitative real-time PCR.Cell activity was detected by CCK-8 assay.Cell proliferation capacity was detected by colony formation assay.Cell migration and invasion ability were detected by transwell assay.Meanwhile，the cell apoptosis experiment was performed.Results The result of UALCAN database analysis indicated that the expression of PTPRR in glioma was lower than that in normal brain tissue，and the expression of PTPRR was lower in high grade gliomas than that of low grade gliomas.The survival time of glioma patients with low/medium PTPRR expression was shorter than that of patients with high PTPRR expression.The result quantitative real-time PCR showed that the expression levels of PTPRR mRNA in different glioma cell lines and glioma tissue were decreased.CCK-8 assay showed that the cell viability at 24 h and 48 hafter over-expression of PTPRR was decreased respectively compared with the pcDNA3.1 group.Results of colony formation assay，Transwell migration and invasion assays showed that the number of colony formation，migration and invasion ability of glioma cells after over-expression of PTPRR were lower than the pcDNA3.1 group.The result of apoptosis experiment showed that the apoptosis rate of glioma cells after over-expression of PTPRR was increased compared with that of the pcDNA3.1 group.Conclusion The expression of PTPRR in glioma is lower.PTPRR acted as a tumor suppressor gene inhibits the activity，proliferation，migration and invasion of glioma cells，and promotes glioma cell apoptosis.

Key words：glioma;cell proliferation;cell movement;neoplasm invasiveness;protein tyrosine phosphatase receptor type R

膠質瘤是常見的中樞神經系統原發性腫瘤，約占所有原發性腦腫瘤的30%，占惡性腦腫瘤的80%，是原發性腦腫瘤患者死亡的主要原因［1］。2021年世界衛生組織（WHO）根據腫瘤惡性程度及組織學特性將膠質瘤分為低級別膠質瘤（Ⅰ—Ⅱ級，良性）和高級別膠質瘤（Ⅲ—Ⅳ級，惡性）［2-3］。膠質瘤的治療主要通過手術切除，結合放療和化療，但惡性膠質瘤復發率高，部分患者出現治療抵抗，預后不良［4］。因此，探索膠質瘤的發病機制并尋找新的潛在治療靶點至關重要。有研究顯示，異常蛋白磷酸化與膠質瘤的發生發展有關［5］，蛋白酪氨酸磷酸酶受體R型（PTPRR）通過調控蛋白的去磷酸化調節MAPK［6］、Wnt［7］等信號通路的級聯反應，從而調節細胞凋亡、增殖和轉移等多種生物學行為。研究表明PTPRR可作為抑癌基因抑制卵巢癌［8］、結腸癌［9］等腫瘤的發生發展。但PTPRR在膠質瘤中的作用尚鮮見報道。本研究旨在探討PTPRR在膠質瘤中的表達情況及其對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響，為揭示膠質瘤的發病機制提供參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞系、主要試劑及儀器人膠質瘤細胞株（U87、U251、SHG44、T98G、U373）和人星形膠質細胞系（NHA）購自中國科學院細胞庫。DMEM培養基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；miScript Reverse Transcription試劑盒購自德國Qiagen公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司；實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）相關引物及PTPRR過表達質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司；CCK-8購自美國Ameresco公司；Transwell小室購自美國Coring Incorparated公司；Matrigel Matrix膠購自美國BD公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；iQ5 Real-Time PCR擴增儀購自美國Applied Bios ystems公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.1.2組織標本來源選擇2019年1月—2020年12月于天津市環湖醫院神經外科行手術治療的膠質瘤患者20例，其中男12例，女8例，年齡29～66歲，平均（43.0±11.6）歲；低級別膠質瘤5例，高級別膠質瘤15例。組織病理學分型：毛細胞型星形細胞瘤2例、少突膠質細胞瘤3例、間變性星形細胞瘤5例、間變性少突膠質細胞瘤2例、膠質母細胞瘤8例。納入標準：（1）經術后組織病理檢查確診為腦膠質瘤，病理分級符合WHO診斷標準。（2）年齡≥18歲。（3）入院前未接受任何抗腫瘤治療。排除標準：（1）腦轉移瘤者。（2）合并顱內其他疾病。（3）合并其他部位惡性腫瘤。另擇同期于我院神經外科行腦外傷手術的創傷性腦出血患者20例，其中男15例，女5例，年齡25～69歲，平均（41.0±14.5）歲。2組患者性別（χ2=0.456）、年齡（t=0.469）差異無統計學意義（P＞0.05）。取術中切除的新鮮腦膠質瘤組織及正常腦組織于液氮（-80℃）中保存備用。本研究經過醫院倫理委員會批準（審批號：2024-104），患者或家屬簽署知情同意書。

1.2生物信息學分析應用UALCAN（The University of ALabama at Birmingham CANcer data analysis Portal）網站數據分析網頁（https：//ualcan.path.uab.edu/）比較癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中的多形性膠質母細胞瘤（GBM）組織和正常腦組織中PTPRR mRNA的表達差異。同時對低級別（Ⅱ級）與高級別（Ⅲ級）腦膠質瘤中PTPRR mRNA的表達差異進行了分析，并通過UALCAN網站數據分析網頁分析PTPRR的表達對膠質瘤患者生存期的影響。獲取PTPRR mRNA在膠質瘤中的表達情況及膠質瘤患者的生存曲線。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養及轉染U87細胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于5%CO2、37℃孵箱中培養。每天更換細胞培養液1次，當細胞融合度達80%時進行消化傳代。取對數生長期細胞，以1×104/mL接種于6孔細胞培養板中，培養18～24 h，當細胞密度為60%～70%時，參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書分別轉染PTPRR的過表達質粒pcDNA3.1/PTPRR（pcDNA3.1/PTPRR組）和空白對照質粒pcDNA3.1（pcDNA3.1組），用于后續實驗。

1.3.2 qRT-PCR檢測膠質瘤細胞系及膠質瘤組織的PTPRR mRNA表達分別取對數生長期的U251、U87、SHG44、T98G、U373細胞和NHA，以2×104/mL接種于6孔細胞培養板中（每孔3 mL），取各膠質瘤組織及正常腦組織標本約200 mg，采用TRIzol法提取總RNA。采用miScript Reverse Transcription試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。qRT-PCR采用SYBR Green I試劑盒，反應體系（20μL）：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0μL，上、下游引物（5 mmol/L）各1.0μL，cDNA模板1.0μL，雙蒸水補至20μL。反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

1.3.3 CCK-8實驗檢測細胞活性取轉染24 h后的U87細胞，以1×105/mL接種于96孔板中，于37℃細胞培養箱中培養，0 h、24 h、48 h時每孔分別加入10μL CCK-8試劑，孵育30 min。采用酶標儀測定波長450 nm處各孔的光密度（OD）值。

1.3.4集落形成實驗檢測細胞增殖能力取轉染24 h后的U87細胞（200個）接種于12孔板，培養1～2周，待每個克隆細胞數長至50個以上，棄去完全培養基，以4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色并用水沖洗，數碼相機拍照計數克隆形成數。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲情況（1）遷移實驗。每個Transwell小室底面涂10μL纖維連接蛋白（0.5 g/L），在超凈臺內風干。消化各組細胞并計數，取1×105個細胞經200μL無血清DMEM培養基稀釋后加入Transwell小室中。下層小室加入含20%Gibico血清的DMEM培養基。放入37℃孵箱中培養24 h。用棉簽擦除上層未遷移的細胞。用甲醇、冰醋酸按照3∶1配制成混合液固定30 min，0.1%結晶紫染色15 min。顯微鏡下取3個隨機視野進行拍照。（2）侵襲實驗。提前溶解Matrigel Matrix膠，以無血清培養基稀釋至300μL/L，取50μL稀釋液均勻地涂抹在小室的PET膜上，余步驟同遷移實驗。

1.3.6細胞凋亡實驗取轉染后的U87細胞培養48 h，經0.25%胰蛋白酶消化，取5萬～10萬個重懸的細胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入195μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，室溫（20～25℃）避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4統計學方法采用GraphPad 8.0軟件對數據進行分析。計量資料以x±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 UALCAN網站分析PTPRR在膠質瘤中的表達情況多形性膠質母細胞瘤中PTPRR mRNA表達水平低于正常腦組織［0.75（0.40，1.42）vs.29.89（28.46，32.37），P=0.026］（圖1A），高級別膠質瘤中PTPRR mRNA表達水平低于低級別膠質瘤［0.76（0.33，1.86）vs.1.22（0.51，2.94），P=0.016］（圖1B）。低級別膠質瘤中PTPRR高表達者的生存期較低/中表達者更長（P=0.035，圖1C），低級別膠質瘤PTPRR高表達者、低級別膠質瘤PTPRR低/中表達者、高級別膠質瘤PTPRR高表達者、高級別膠質瘤PTPRR低/中表達者的生存期依次縮短（P＜0.001，圖1D）。

2.2 PTPRR mRNA在膠質瘤細胞及膠質瘤組織中的表達膠質瘤細胞系U251、U87、SHG44、T98G、U373中PTPRR mRNA的表達水平分別為0.29±0.03、0.81±0.04、0.49±0.03、0.44±0.04、0.64±0.05，均低于NHA（1.00±0.03），差異有統計學意義（t分別為23.920、4.661、19.900、19.380、8.202，均P＜0.05）。低、高級別膠質瘤組織中PTPRR mRNA的表達水平（分別為1.03±0.07、0.53±0.22）均低于正常腦組織（1.90±0.55），差異有統計學意義（t分別為3.390、8.868，均P＜0.05）。

2.3過表達PTPRR抑制膠質瘤細胞活性和細胞增殖pcDNA3.1/PTPRR組PTPRR mRNA的表達水平高于pcDNA3.1組（P＜0.05）；過表達PTPRR后24 h、48 h的細胞活性低于pcDNA3.1組；過表達PTPRR后膠質瘤細胞集落形成個數少于pcDNA3.1組（Plt;0.05），見表2、圖2。

2.4過表達PTPRR抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲能力pcDNA3.1/PTPRR組膠質瘤細胞遷移和侵襲能力均低于pcDNA3.1組，見表3、圖3。

2.5過表達PTPRR促進膠質瘤細胞凋亡凋亡實驗結果顯示，pcDNA3.1/PTPRR組膠質瘤細胞凋亡率高于pcDNA3.1組（1.98±0.11 vs.1.00±0.09，t=11.950，P＜0.05），見圖4。

3討論

PTPRR是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，使蛋白質去磷酸化并參與調控多種生物學過程，包括細胞生長、分化及調控腫瘤發生發展過程中的多種信號通路［10］。研究表明，PTPRR在宮頸癌［5-6］、結腸癌［8］、卵巢癌［9］、前列腺癌［11］、多發性骨髓瘤［12］等腫瘤中呈低表達并發揮腫瘤抑制因子的作用。膠質瘤的進展受多種因素調控［13-14］，目前研究較為廣泛的蛋白酪氨酸磷酸酶為蛋白酪氨酸磷酸酶受體Z1［15］，PTPRR在膠質瘤中的表達尚鮮見報道。

本研究采用UALCAN網站數據分析網頁對TCGA數據庫中膠質瘤組織PTPRR的表達進行分析顯示，多形性膠質母細胞瘤中PTPRR mRNA表達水平低于正常腦組織，高級別膠質瘤中PTPRR mRNA表達水平低于低級別膠質瘤。本研究分別在細胞及組織水平驗證此結果，結果表明PTPRR在膠質瘤細胞及膠質瘤組織中均呈低表達。

有研究表明，PTPRR可通過調控多種信號通路影響細胞生物學功能［16］，其通過去磷酸化和失活β-catenin，抑制Wnt信號通路，從而抑制細胞生長［9］。另有研究表明，PTPRR可通過負向調控RAS/ERK1/2信號通路抑制細胞增殖［11］。筆者推測，PTPRR在膠質瘤中亦可作為抑癌基因抑制腫瘤的發展。本研究結果顯示，過表達PTPRR可抑制膠質瘤細胞的活性、增殖、遷移及侵襲能力，并促進膠質瘤細胞凋亡。這與既往研究結果基本一致，提示PTPRR在膠質瘤中作為抑癌基因抑制腫瘤的惡性行為，但具體分子生物學機制尚不明確，其可能涉及的信號通路有待進一步探索，如PTPRR對Wnt/β-catenin、MAPK、RAS/ERK1/2等信號通路關鍵調控蛋白的去磷酸化的影響。

有研究表明，PTPRR的表達受多種表觀遺傳學調控，在結直腸癌中PTPRR啟動子均呈現高甲基化狀態［17］；在宮頸癌中通過DNMT3B介導的甲基化可沉默PTPRR［18］；在肺癌細胞中，PTPRR啟動子區組蛋白乙酰化富集可恢復PTPRR轉錄［19］。另有研究表明，PTPRR受miR-218-5p［8］、miR-125b［20］等非編碼RNA調控。本研究證實PTPRR在膠質瘤細胞及組織中均呈低表達，但其具體機制尚不明確，在膠質瘤中PTPRR的啟動子區域表觀遺傳學的調控機制及轉錄后的非編碼RNA的調控機制尚待進一步探索。本研究通過生物信息學篩選了調控PTPRR表達的非編碼RNA，未來將進一步探索非編碼RNA以及PTPRR啟動子區域甲基化及乙?；潭葘TPRR表達的調控機制。

綜上，PTPRR在膠質瘤中呈低表達，過表達PTPRR可抑制膠質瘤細胞的活性、增殖、遷移及侵襲能力，并促進膠質瘤細胞凋亡，但調控PTPRR表達的具體機制及PTPRR抑制膠質瘤細胞惡性生物學行為的具體機制尚不明確，仍需進一步探索。

參考文獻

［1］OSTROM Q T，PRICE M，NEFF C，et al.CBTRUS statistical report：primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020［J］.Neuro Oncol，2023，25（12 Suppl 2）：iv1-iv99.doi：10.1093/neuonc/noad149.

［2］GRITSCH S，BATCHELOR T T，GONZALEZ CASTRO L N.Diagnostic，therapeutic，and prognostic implications of the 2021 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system［J］.Cancer，2022，128（1）：47-58.doi：10.1002/cncr.33918.

［3］WANG L M，ENGLANDER Z K，MILLER M L，et al.Malignant glioma［J］.Adv Exp Med Biol，2023，1405：1-30.doi：10.1007/978-3-031-23705-8_1.

［4］OBTADOR E，MORENO-MURCIANO P，ORIOL-CABALLO M，et al.Glioblastoma therapy：past，present and future［J］.Int J Mol Sci，2024，25（5）：2529.doi：10.3390/ijms25052529.

［5］WANG L B，KARPOVA A，GRITSENKO M A，et al.Proteogenomic and metabolomic characterization of human glioblastoma［J］.Cancer Cell，2021，39（4）：509-528.e20.doi：10.1016/j.ccell.2021.01.006.

［6］SU P H，LIN Y W，HUANG R L，et al.Epigenetic silencing ofPTPRR activates MAPK signaling，promotes metastasis and serves as a biomarker of invasive cervical cancer［J］.Oncogene，2013，32（1）：15-26.doi：10.1038/onc.2012.29.

［7］LI X，LIU Z，LI W，et al.PTPRR regulates ERK dephosphorylation in depression mice model［J］.J Affect Disord，2016，193：233-241.doi：10.1016/j.jad.2015.12.049.

［8］CHANG Y，HUANG Z，HOU F，et al.Parvimonas micra activates the Ras/ERK/c-Fos pathway by upregulating miR-218-5p to promote colorectal cancer progression［J］.J Exp Clin Cancer Res，2023，42（1）：13.doi：10.1186/s13046-022-02572-2.

［9］WANG Y，CAO J，LIU W，et al.Protein tyrosine phosphatase receptor type R（PTPRR）antagonizes the Wnt signaling pathway in ovarian cancer by dephosphorylating and inactivatingβ-catenin［J］.J Biol Chem，2019，294（48）：18306-18323.doi：10.1074/jbc.RA119.010348.

［10］LI H，ZHANG P，LIU C，et al.The structure，function and regulation of protein tyrosine phosphatase receptor type J and its role in diseases［J］.Cells，2022，12（1）：8.doi：10.3390/cells12010008.

［11］MUNKLEY J，LAFFERTY N P，KALNA G，et al.Androgen-regulation of the protein tyrosine phosphatase PTPRR activates ERK1/2 signalling in prostate cancer cells［J］.BMC Cancer，2015，15：9.doi：10.1186/s12885-015-1012-8.

［12］WANG H，YU D，ZHANG H，et al.Quercetin inhibits the proliferation of multiple myeloma cells by upregulating PTPRR expression［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2021，53（11）：1505-1515.doi：10.1093/abbs/gmab128.

［13］PIENKOWSKI T，KOWALCZYK T，CYSEWSKI D，et al.Glioma and post-translational modifications：a complex relationship［J］.Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2023，1878（6）：189009.doi：10.1016/j.bbcan.2023.189009.

［14］陳明武，王開宇，楊波，等.lncRNA OIP5-AS1調節miR-942-5p/CHEK1軸對腦膠質瘤細胞生物學行為的影響［J］.天津醫藥，2022，50（12）：1246-1253.CHEN M W，WANG K Y，YANG B，et al.lncRNA OIP5-AS1 regulates the effect of miR-942-5p/CHEK1 axis on the biological behavior of glioma cells［J］.Tianjin Med J，2022，50（12）：1246-1253.doi：10.11958/20220867.

［15］PAPADIMITRIOU E，KANELLOPOULOU V K.Protein tyrosine phosphatase receptor zeta 1 as a potential target in cancer therapy and diagnosis［J］.Int J Mol Sci，2023，24（9）：8093.doi：10.3390/ijms24098093.

［16］CHEN Y，GUAN M，YU F，et al.Protein tyrosine phosphatase receptor type R（PTPRR）reduces AChR clustering by dephosphorylating MuSK［J］.Dis Markers，2022，2022：5160624.doi：10.1155/2022/5160624.

［17］LACZMANSKA I，KARPINSKI P，BEBENEK M，et al.Protein tyrosine phosphatase receptor-like genes are frequently hypermethylated in sporadic colorectal cancer［J］.J Hum Genet，2013，58（1）：11-15.doi：10.1038/jhg.2012.119.

［18］CHANG C C，HUANG R L，WANG H C，et al.High methylation rate of LMX1A，NKX6-1，PAX1，PTPRR，SOX1，and ZNF58 2 genes in cervical adenocarcinoma［J］.Int J Gynecol Cancer，2014，24（2）：201-209.doi：10.1097/IGC.0000000000000054.

［19］DU T，HU X，HOU Z，et al.Re-expression of epigenetically silenced PTPRR by histone acetylation sensitizes RAS-mutant lung adenocarcinoma to SHP2 inhibition［J］.Cell Mol Life Sci，2024，81（1）：64.doi：10.1007/s00018-023-05034-w.

［20］NELSON H M，QU S，HUANG L，et al.MiR-100 and miR-125b contribute to enhanced 3D growth and invasiveness and can be functionally transferred to silence target genes in recipient cells［J］.bioRxiv，2024：2024.01.16.575716.［Preprint］.doi：10.1101/2024.01.16.575716.

（2024-07-08收稿2024-10-21修回）

（本文編輯陳麗潔）