T-ALL來源的骨髓基質細胞通過FGF2-FGFR2通路促進T-ALL增殖

摘要：目的探究骨髓基質細胞（BM-MSCs）對急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）影響的作用機制，尋找靶向BM-MSCs的有效治療策略。方法構建Notch-1過表達誘導的T-ALL小鼠模型，分選T-ALL中BM-MSCs，與T-ALL細胞系建立體外共培養系統，檢測共培養后T-ALL增殖能力變化。運用RNA測序技術尋找不同來源MSCs的差異表達基因，并用PCR驗證。在小鼠體內注射BGJ398，檢測腫瘤生長情況。結果與T-ALL來源的MSCs共培養后，T-ALL細胞的增殖能力顯著增加。RNA測序結果顯示，T-ALL來源的MSCs成纖維細胞生長因子2（FGF2）分泌增加，與T-ALL細胞上的成纖維細胞生長因子2受體（FGFR2）結合可激活T-ALL細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路。加入BGJ398阻斷FGF2和FGFR2之間的相互作用可以抑制小鼠T-ALL腫瘤的生長。結論BM-MSCs可通過FGF2/FGFR2通路促進T-ALL腫瘤生長，阻斷FGF2/FGFR2通路是克服BM-MSCs介導T-ALL進展的有效策略。

關鍵詞：前體細胞淋巴母細胞白血病淋巴瘤；成纖維細胞生長因子2；細胞增殖；骨髓基質細胞；BGJ398中圖分類號：R733.71文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240355

T-ALL derived bone marrow stromal stem cells promote T-ALL proliferation through"he FGF2-FGFR2 pathway

YANG Jian1，LI Min2，LI Yueyang2，TIAN Chen2△

1 Department of Surgical Oncology，Qingdao Central Cancer Hospital，Qingdao 266042，China;2 Department of Hematology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin Clinical Research Center for Cancer

△Corresponding Author E-mail：tianchen@tjmuch.com

Abstract：Objective To elucidate the mechanistic role of bone marrow mesenchymal stromal cells（BM-MSCs）in T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL），and to find effective therapeutic strategies targeting BM-MSCs.Methods A T-ALL mouse model induced by Notch-1 overexpression was constructed.An in vitro co-culture system was established to investigate the proliferative capacity of T-ALL cells upon co-culturing with leukemia-derived MSCs.RNA sequencing was performed to identify key differentially expressed genes，which were further validated by PCR.BGJ398 was injected into mice to detect tumor growth.Results Co-culturing with T-ALL-derived MSCs resulted in a significant increase in T-ALL cell proliferation.RNA sequencing results revealed that the secretion of fibroblast growth factor 2（FGF2）from T-ALL-derived MSCs was increased，which binds to fibroblast growth factor 2 receptor（FGFR2）on T-ALL cells，activating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.Blocking the interaction between FGF2 and FGFR2 using BGJ398 inhibited the growth of T-ALL tumors in mice.Conclusion BM-MSCs can promote T-ALL tumor growth through FGF2/FGFR2 pathway，and blocking FGF2/FGFR2 pathway is an effective strategy to overcome BM-MSCS-mediated T-ALL progression.

Key words：precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma;fibroblast growth factor 2;cell proliferation;bone marrow mesenchymal stromal cells;BGJ398

急性T淋巴細胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukaemia，T-ALL）是一種極具異質性的血液系統惡性腫瘤［1］。白血病細胞破壞正常骨髓（bone marrow，BM）微環境，將其轉化為異常的生態位，誘導微環境中的細胞群發生變化［2］。在這一過程中，微環境中的關鍵細胞，如骨髓基質細胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BM-MSCs）為白血病細胞提供了庇護所，進一步加速了T-ALL的進展［3-4］。因此，深入了解白血病細胞與BM-MSCs間錯綜復雜的相互作用，并據此探尋新的治療靶點，對T-ALL的治療具有實踐意義。研究發現，在急性B淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukaemia，B-ALL）中，BM-MSCs通過直接接觸的方式促進B-ALL細胞的存活和增殖［5］。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中，白血病細胞與BM-MSCs的緊密接觸能夠抑制藥物誘導的細胞凋亡［6］。盡管已有研究報道BM-MSCs介導的保護作用涉及可溶性細胞因子、生長因子和細胞相互作用分子等多種機制［7-8］，但BM-MSCs在T-ALL中的支持作用機制仍需深入探索。因此，本研究旨在揭示BM-MSCs對T-ALL細胞的作用機制，以期為T-ALL的治療尋找新的治療策略。

1材料與方法

1.1細胞及培養T-ALL細胞系Jurkat、人骨髓基質細胞系HS-5、人胚胎腎細胞HEK293T均由中國醫學科學院血液病研究所程濤教授課題組贈送。Jurkat細胞在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養基中培養。HS-5和HEK293T在添加10%FBS的DMEM高糖培養基中培養。所有細胞均置于37℃、5%CO2孵箱中培養。

1.2主要試劑RPMI-1640培養基、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司。FBS購自ZETA公司。慢病毒載體MSCV-ICN1-IRES-GFP購自優寶生物公司。外周血淋巴細胞分離液購自索萊寶公司。CD45磁珠、Lineage磁珠（Microbeads）、LS磁柱（MACS Separation Columns）購自美天旎公司。流式抗體FITC-CD31/CD44/CD45/TER119、FITC-F4/80、FITC-RatIgG2a/2b，κIsotype Ctrl、APC-SCA1、PE-CD51、V450-Lineage（CD3/B220/CD11b/Gr-1/TER119）、PE/Cy7-cKit購自BioLegend公司。PE-AnnexinV凋亡試劑盒、APC-BrdU增殖試劑盒購自BD公司。TRIzol試劑購自ambion公司。Prime Script RT Master Mix、TB Green Premix Ex Taq購自TAKARA公司。兔源磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）1+AKT2+AKT3、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體及各自磷酸化抗體，GAPDH抗體及羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司。慢病毒載體pLVX-FGF2-mcherry購自優寶生物公司。成纖維細胞生長因子受體（FGFR）抑制劑BGJ398（Infigratinib）購自Selleck公司。

1.3實驗動物SPF級C57BL/6J（簡稱C57）小鼠6只、B6.SJL（簡稱B6）小鼠3只、NOD/SCID小鼠10只，6～8周齡，體質量18～25 g，所有小鼠均為雌性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0011；動物使用許可證號：SYXK（津）2017―0005。所有動物實驗均通過天津醫科大學腫瘤醫院實驗動物倫理委員會審批（倫理批號：DMZF-2021050）。

1.4 Notch-1誘導的T-ALL小鼠模型構建將過表達Notch-1的逆轉錄病毒載體MSCV-ICN1-IRES-GFP轉染至HEK293T細胞中，繼續培養293T細胞48 h后收集富含病毒原液的上清液，感染B6小鼠的骨髓細胞，構建Notch-1誘導的T-ALL細胞（即原代鼠T-ALL細胞），48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光評估感染情況［9］。構建流程見圖1。將6只C57小鼠均分為T-ALL組（尾靜脈注射原代鼠T-ALL細胞，1×106/100μL）和Control組（未作特殊處理）。注射12 d后處死2組小鼠，分離脾臟并稱質量，RT-PCR驗證T-ALL組BM細胞中Notch-1基因胞內段ICN1表達，倒置熒光顯微鏡觀察GFP+T-ALL細胞表達，流式細胞儀檢測GFP+細胞中CD3的表達以評估T-ALL小鼠模型構建情況。具體驗證方法參考本課題組前期研究［9］。

1.5流式細胞術分選小鼠BM-MSCs用PBS沖洗Control組和T-ALL組C57小鼠的髂骨、股骨和脛骨骨髓腔獲得BM細胞。用Ficoll法從BM中分離單個核細胞，用CD45磁珠去除BM細胞中的造血細胞，再使用Lineage/CD31/F4/80抗體去除其余細胞，剩余的GFP-CD45-Lin-CD31-F4/80-細胞即為目的BM-MSCs。

1.6共培養體系分別將Control組和T-ALL組的BM-MSCs與原代鼠T-ALL細胞以數目1∶3的比例（3×105個BM-MSCs細胞）置于DMEM培養基中，培養16 h后分離出懸浮的原代鼠T-ALL細胞，然后進行后續的功能實驗。

1.6.1細胞增殖和凋亡檢測在上述共培養后分離出的原代鼠T-ALL細胞中以10μL/mL的比例加入BrdU，孵育6 h后用抗BrdU偶聯抗體標記，通過流式細胞儀分析細胞增殖情況；以5μL/mL的比例加入AnnexinV、7-AAD，冰上避光孵育15 min，1 h內通過流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.6.2 RT-PCR法檢測與細胞周期、凋亡及增殖相關基因的表達收集Control組與T-ALL組細胞后采用Trizol法提取總RNA。逆轉錄反應體系：5×Prime Script RT Master Mix 2μL，Total RNA 350 ng，RNase Free dH2O補至10μL；逆轉錄反應條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。RT-PCR反應體系（20μL）：上、下游引物各0.8μL，2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，50×ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4μL，cDNA溶液2μL，滅菌水6μL。RT-PCR反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環，保存數據后采用2-ΔΔCt法分析數據。所有引物序列見表1。

1.6.3 Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，再將凝膠上的蛋白樣本轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，剪膜后4℃孵育兔PI3K、AKT、mTOR、一抗（1∶1 000）過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，配置化學顯色試劑，化學發光儀自動曝光。將GAPDH作為蛋白內參計算目的蛋白相對表達量。

1.6.4 RNA測序分析TRIzol法提取Control組與T-ALL組BM-MSCs的總RNA后送往上海美吉生物公司（www.majorbio.com）進行RNA測序。

1.7慢病毒感染法敲降T-ALL組BM-MSCs的FGF2基因表達用pLVX-FGF2-mcherry感染HEK293T細胞，培養48 h后收集富含病毒原液的上清液。以1×106/孔的密度接種T-ALL組BM-MSCs于6孔板中，每孔加入2 mL病毒原液，并加入8 mg/L Polybrene，1 800 r/min離心90 min后棄去病毒原液，繼續培養48 h后通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光以評估感染情況。

1.8皮下成瘤及給藥取雌性NOD/SCID小鼠10只，左腋下皮下接種3∶1混合的Jurkat與HS-5細胞混懸液（1×107/200μL）。保留6只腫瘤體積在100～150 mm3的小鼠，等比例分為BGJ398組及PBS組。BGJ398組每2 d腹腔注射25μL BGJ398（30 mg/kg），給藥7次；PBS組同期腹腔注射25μLPBS。待PBS組小鼠腫瘤體積達1 000 mm3后中止實驗，剝除各組小鼠腫瘤并稱質量。

1.9統計學方法使用Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示。2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 T-ALL小鼠模型的驗證結果建模12 d后，T-ALL組C57小鼠脾臟較Control組明顯增大（圖2A），質量（g）增加（0.9±0.1 vs.0.1±0.0，n=3，t=45.848，Plt;0.01），Notch-1胞內段ICN1表達升高（3.8±0.3 vs.0.6±0.1，n=3，t=17.332，P＜0.01）。沖洗四肢骨留取骨髓液，在熒光顯微鏡下發現T-ALL小鼠的BM中GFP+細胞占90%以上（圖2B），T-ALL組小鼠GFP+細胞高表達CD3（圖2C、D），證實T-ALL小鼠模型構建成功。

2.2 T-ALL來源的BM-MSCs促進T-ALL細胞的增殖見圖3。與T-ALL組BM-MSCs共培養的T-ALL細胞數目較與Control組共培養的增多（單位：105個；6.7±0.4 vs.4.0±0.2，n=3，t=12.100，P＜0.01），凋亡率降低（46.7%±6.1%vs.84.3%±7.0%，n=3，t=6.568，P＜0.01），S期細胞的比例顯著增加。

2.3 T-ALL來源的BM-MSCs異常激活FGF2/FGFR2通路RNA測序顯示，T-ALL組與Control組BM-MSCs之間有74個基因存在差異表達，包括23個上調基因和51個下調基因（設置差異倍數＞2，P＜0.01，圖4A）。74種基因中有6種與細胞周期、增殖和凋亡相關，具體為Csf2、Ctf1、Fgf2、Igf2、Hgf和Lif。PCR驗證發現與Control組相比，T-ALL組BM-MSCs中Fgf2表達顯著上調（圖4B），與T-ALL組BM-MSCs共培養的T-ALL細胞Fgfr2表達顯著上調（圖4C）。

2.4 FGF2/FGFR2激活T-ALL細胞中的PI3K/AKT/mTOR通路Western-blot結果顯示，與T-ALL組BM-MSCs共培養后T-ALL細胞中p-PI3K、p-AKT表達水平較Control組升高（圖5A），加入BGJ398或敲降BM-MSCs中FGF2基因后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著降低（圖5B）。

2.5阻斷FGF2/FGFR2通路可抑制T-ALL小鼠腫瘤生長阻斷FGF2/FGFR2通路后，BGJ398組小鼠腫瘤體積較PBS組明顯減小，質量明顯下降（單位：g；0.02±0.01 vs.0.44±0.13，t=18.290，P＜0.01），見圖6。

3討論

成人T-ALL異質性強，存在原發耐藥或經治療后再次復發，導致療效及預后欠佳。既往研究發現，骨髓微環境為白血病細胞的增殖、存活及黏附提供了支持和保護，促進了白血病的發生和發展［10-11］，其中BM-MSCs的作用尤為重要。Wang等［12］發現，黏附分子ICAM-1介導Jurkat細胞與BM-MSCs的黏附，促進Jurkat細胞線粒體轉移至BM-MSCs內，誘導T-ALL化療耐藥。Cai等［13］也發現，BM-MSCs可觸發Drp1激活，誘導線粒體動力學變化，誘導T-ALL化療耐藥。然而，BM-MSCs對T-ALL的直接作用及發揮作用的機制尚不完全清楚，探尋具體機制對尋找骨髓微環境中的潛在T-ALL治療靶點具有重要意義。為此筆者設計了本研究進行探索。

本研究結果顯示，T-ALL來源的BM-MSCs促進T-ALL細胞的增殖，抑制T-ALL細胞的凋亡，這與Jia等［14］的研究結果一致。本研究進一步證明BM-MSCs為T-ALL細胞的生長提供了保護作用。Jia等［14］發現地塞米松通過激活甾醇調節元件結合轉錄因子1（SREBF1）促進BM-MSCs分化為脂肪細胞，脂肪細胞通過激活Notch1信號通路保護T-ALL細胞。本研究發現，在T-ALL微環境中，MSCs分泌大量FGF2，與T-ALL細胞上的FGFR2結合導致T-ALL細胞的PI3K/Akt/mTOR通路過度激活，進而促進T-ALL腫瘤生長。

FGFs是一類龐大的生長因子家族，可調節細胞的存活、生長和分化［15-17］。FGFs與四種FGFRs結合，可激活包括PI3K/Akt/mTOR通路在內的多條信號通路［18］。有證據表明，FGF2在血液惡性腫瘤的發病機制中起著重要作用［19］，如慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）、慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）和霍奇金淋巴瘤［20］。本研究首次證實，FGFs/FGF2在T-ALL的存活及進展中發揮重要作用。英菲格拉替尼，也稱為BGJ398，是一種口服FGFR1-3選擇性酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）。筆者發現，應用BGJ398可以使T-ALL細胞的PI3K/Akt/mTOR通路失活，抑制小鼠T-ALL腫瘤的生長，BGJ398可能是靶向T-ALL中MSCs的有效藥物。

本研究為BM-MSCs對T-ALL細胞具有保護作用提供了重要的證據支持，證實BM-MSCs通過FGF2/FGFR2通路促進T-ALL腫瘤生長，為克服BM-MSCs介導的T-ALL進展提供了新靶點。FGF抑制劑BGJ398有望為T-ALL患者提供新的治療方案，亟待臨床進一步驗證。當然，本研究的小鼠模型是Notch-1高表達誘導的T-ALL模型，其發生率只占T-ALL患者的10%左右，在臨床上還有其他因素誘導的T-ALL［21］。因此需要臨床前及臨床階段的研究，以進一步證實其他因素導致的T-ALL是否同樣存在FGF2/FGFR2通路的過度激活。

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（2024-03-23收稿2024-09-11修回）

（本文編輯胡小寧）