生乳中的安全風(fēng)險(xiǎn)及膠體金免疫層析技術(shù)在檢測(cè)中的應(yīng)用

1.引言

牛乳所含的營(yíng)養(yǎng)素全面，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高且易于消化吸收，是膳食中蛋白質(zhì)、鈣、等微量元素和維生素的的重要來源之一。生乳是乳制品生產(chǎn)的基礎(chǔ)，而生乳在生產(chǎn)和運(yùn)輸環(huán)節(jié)面臨著各種人為或非人為安全險(xiǎn)因素的干擾。乳制品質(zhì)量安全事件不斷發(fā)生，如“三聚氰胺毒奶粉事件”、β-內(nèi)酰胺酶“無抗奶”、“丙二醇牛奶事件”等造成了及其惡劣的影響。這就使得對(duì)生牛乳中污染物、殘留物等的分析檢測(cè)手段至關(guān)重要。因此在企業(yè)的乳品生產(chǎn)過程中，建立檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、結(jié)果可靠、成本低廉的檢測(cè)手段以提高其安全性對(duì)保證產(chǎn)品質(zhì)量安全而言至關(guān)重要。

膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是基于抗原抗體特異性結(jié)合，借助膠體金進(jìn)行信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)的一種快速固相膜免疫分析技術(shù)。操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、方便攜帶、檢測(cè)范圍廣，適合政府監(jiān)管檢驗(yàn)人員用于大批量的食品檢測(cè)和廣泛普查，同時(shí)也適用于食品機(jī)構(gòu)或企業(yè)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)的原理是氯金酸（HAuCl4）在還原劑檸檬酸三鈉作用下，被還原成為一定大小的膠體金顆粒，金顆粒通過在水中的靜電排斥力而達(dá)到穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在特定環(huán)境下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)通過靜電吸附作用牢固穩(wěn)定的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以可以使抗體這類蛋白質(zhì)依然保持生物特性。膠體金顆粒電子密度高，當(dāng)粒子聚集超過某一密度閾值時(shí)，膠體金就會(huì)變色為紅色，可以用肉眼觀察到。

3.生乳中的安全風(fēng)險(xiǎn)及膠體金免疫層析技術(shù)的應(yīng)用

生乳是指從符合國(guó)家有關(guān)要求的健康奶畜乳房中擠出的無任何成分改變的常乳。產(chǎn)犢后七天的初乳、使用抗生素期間和休藥期間的乳汁以及變質(zhì)乳不應(yīng)作為生乳用于出售或一切食品生產(chǎn)活動(dòng)。生乳中的化學(xué)危害物包括真菌毒素、微生物、重金屬、獸藥農(nóng)藥殘留、添加劑等。生乳檢測(cè)環(huán)節(jié)強(qiáng)調(diào)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，膠體金免疫層析技術(shù)完全符合這些檢測(cè)要求，現(xiàn)階段膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)于生乳的檢測(cè)研究多集中于尋求更加準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，更簡(jiǎn)單的樣品處理方式，更短的檢測(cè)時(shí)間以及建立可同時(shí)檢測(cè)多種化學(xué)物質(zhì)的試紙條。

3.1 真菌毒素

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一類對(duì)動(dòng)植物有毒有害并可廣泛污染農(nóng)副產(chǎn)品及乳制品的物質(zhì)。生乳中殘留的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等化學(xué)危害物不同種類的鐮刀菌毒素。其中，毒性最高的黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1在牛乳中的羥基代謝物，其主要來源是被污染動(dòng)物飼料，也是乳制品中污染率最高的真菌毒素，嚴(yán)重影響乳制品的食品安全質(zhì)量，對(duì)人體具有強(qiáng)致癌、致畸、致突變性，可對(duì)人體造成一系列不可逆轉(zhuǎn)的危害。

我國(guó)GB/T2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中要求規(guī)定牛乳中黃曲霉毒素M1含量不得超過0.5μg/kg。膠體金免疫層析技術(shù)作為檢測(cè)生乳中殘留的AFM1的方法已經(jīng)有較為成熟的研究。李婕等通過將膠體金免疫層析法與ELISA檢測(cè)試劑盒法對(duì)比檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩者的檢測(cè)結(jié)果能夠相互對(duì)應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，通過設(shè)置不同濃度梯度的黃曲霉毒素M1驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在一定的梯度效應(yīng)，且在濃度為0.2μg/kg時(shí)開始呈現(xiàn)陽(yáng)性，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，具有較好的定性初篩價(jià)值。吳文曄等應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)制備了能同時(shí)檢測(cè)黃曲霉毒素B和赭曲霉毒素A兩種真菌毒素的膠體金快速檢測(cè)卡，兩者之間沒有干擾性，靈敏度均可達(dá)到2.5μg/L，重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。

3.2 農(nóng)藥殘留

農(nóng)藥具有防止農(nóng)作物受到病蟲害，提高農(nóng)作物產(chǎn)量的作用，農(nóng)藥可長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，并會(huì)在動(dòng)物和人類體內(nèi)積累，形成安全風(fēng)險(xiǎn)，因此，農(nóng)藥殘留、富集是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可避免的。生乳中的農(nóng)藥殘留主要與牛食用被污染的飼料有關(guān)，即食物鏈與生物富集效應(yīng)殘留。農(nóng)藥的種類包括有機(jī)磷、氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲聚酯類等。膠體金免疫層析技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛，特別是在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)中的運(yùn)用，已成為提高食品安全檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性的重要手段。李洋洋等通過制備有機(jī)磷農(nóng)藥的通用結(jié)構(gòu)人工抗原，解決了有機(jī)磷農(nóng)藥小分子抗體制備的難題，最終通過優(yōu)化制作出特異性及準(zhǔn)確性良好的試紙條，反應(yīng)時(shí)間在5-10min，樣本檢測(cè)限為200ng/mL。

3.3 獸藥殘留

獸藥的種類主要包括抗菌素類、抗寄生蟲類、激素類藥物，前兩類藥物多以抗生素為主主要針對(duì)動(dòng)物的病癥及預(yù)防，后者則為了提高動(dòng)物繁殖和生產(chǎn)性能，長(zhǎng)期食用含有動(dòng)物激素殘留的食物，會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)的激素水平失衡，尤其對(duì)正在發(fā)育中的孩子來說容易造成肥胖和性早熟等問題，更有可能引發(fā)癌癥。在產(chǎn)奶牲畜用藥后一段時(shí)間內(nèi)，生鮮乳中會(huì)出現(xiàn)抗生素及其代謝物的殘留，如果在藥物使用后沒有一段足夠的休藥期或?yàn)E用、違規(guī)使用獸藥，其產(chǎn)出的生鮮乳中就會(huì)存在抗生素殘留。抗生素殘留的危害性主要表現(xiàn)在以下方面：長(zhǎng)期食用可能會(huì)出現(xiàn)超敏反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)甚至?xí)?dǎo)致呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重者甚至休克；人體長(zhǎng)期服用會(huì)造成或增強(qiáng)耐藥性，導(dǎo)致藥物的有效性降低。

生乳中抗生素檢測(cè)是最為重要，也是最容易出現(xiàn)安全風(fēng)險(xiǎn)的項(xiàng)目，檢測(cè)項(xiàng)目主要包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、霉素類、四環(huán)素類、喹諾酮類等，利用膠體金免疫試紙條對(duì)生乳中的抗生素進(jìn)行檢測(cè)已成為主要檢測(cè)手段。袁曉春建立了一種可同時(shí)檢測(cè)生乳、純牛奶和奶粉中β-內(nèi)酰胺類-四環(huán)素類-頭孢氨芐抗生素殘留的多重膠體金免疫層析法，且無需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，可在8min內(nèi)快速定性生乳中20種抗生素殘留。武晉孝等建立可同時(shí)檢測(cè)牛奶中6種氨基糖苷類藥物殘留的膠體金免疫層析技術(shù)，同樣無需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，可在10min內(nèi)同時(shí)檢出，經(jīng)過高效液相色譜對(duì)比后結(jié)果一致。白宇等針對(duì)乳制品中易濫用易殘留的激素類藥物雌二醇（E2）應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立快速、敏感、準(zhǔn)確的測(cè)試試紙條，奶樣品經(jīng)2倍稀釋消除基質(zhì)干擾直接用于檢測(cè)。

3.4 重金屬

生鮮乳中的重金屬殘留主要跟牧場(chǎng)的地址（與市區(qū)、工業(yè)區(qū)的距離）、土壤、飼養(yǎng)方式有關(guān)，主要來源于飼料、飲水以及奶畜服用中草藥而引起。其中重金屬殘留主要有鉛、汞、鎘、鉻、砷等。生鮮乳中的重金屬殘留重金屬會(huì)在人體中不斷積累，且難以降解和排除體外，長(zhǎng)期飲用含有重金屬殘留的乳品，會(huì)毒害人體各個(gè)臟器、骨髓和免疫系統(tǒng)。

現(xiàn)有研究能通過膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)對(duì)糧食樣本中重金屬鎘、鉻離子進(jìn)行快速檢測(cè)且能達(dá)到較好的靈敏度，而膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)于檢測(cè)生鮮乳中的重金屬物質(zhì)檢測(cè)鮮有研究。趙小旭等通過競(jìng)爭(zhēng)抑制膠體金免疫層析對(duì)乳制品中的鉛進(jìn)行檢測(cè)，生鮮乳的檢出限為 25μg/kg，檢測(cè)結(jié)果與儀器法檢測(cè)結(jié)果一致，且重復(fù)性好。

3.5 致病菌

生鮮乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富、水分含量高，很容易導(dǎo)致微生物污染，可攜帶多種致病菌，包括金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、黃曲霉菌等數(shù)十種致病菌，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是生鮮乳檢測(cè)中最常見的兩項(xiàng)微生物指標(biāo)。除此之外，這些致病菌還會(huì)攜帶的耐藥因子，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，其代謝產(chǎn)物中含有的毒素同樣也會(huì)對(duì)人體造成危害引發(fā)食源性疾病。而導(dǎo)致生乳微生物污染和超標(biāo)的主要因素包括：產(chǎn)乳的奶牛患有乳腺炎等疾病從而在擠奶的環(huán)節(jié)出現(xiàn)污染；飼養(yǎng)環(huán)境或擠奶過程不符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；生乳儲(chǔ)存及運(yùn)輸環(huán)節(jié)沒有保證干凈的低溫環(huán)境。

生乳中致病菌的快速檢測(cè)方法研究多以ATP生物熒光快速檢測(cè)技術(shù)、電阻抗法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法等為主，而膠體金免疫層析技術(shù)的研究較少，主要問題在于檢測(cè)靈敏度和微生物抗原的選擇較為困難。劉洪貴等采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用膠體金標(biāo)記鼠抗金黃色葡萄球菌凝集因子A（ClfA）重組蛋白特異性抗體，該方法可以在10min內(nèi)完成對(duì)含金黃色葡萄球菌奶樣的檢測(cè)，敏感度為1×104cfu/mL以上，穩(wěn)定性、特異性較好。大腸埃希氏菌O157： H7主要污染的牛肉、牛奶及其制品，王曉芳等采用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金溶液標(biāo)記大腸桿菌O157：H7抗體（6C1E5），研制出的檢測(cè)試紙檢測(cè)靈敏度達(dá)104CFU/mL，并其他8種菌株無交叉反應(yīng)，顯示出較強(qiáng)的特異性。膠體金免疫層析技術(shù)還應(yīng)用于布魯氏菌、沙門氏桿菌等其他通常感染生鮮乳的致病菌中，但對(duì)于國(guó)標(biāo)規(guī)定生乳中不能檢出的微生物膠體金免疫層析技術(shù)目前只能做到定性初篩。

3.6 添加劑

向生鮮乳中加入添加劑的目的主要是為了造成生乳品質(zhì)高或掩蓋其含有某些違規(guī)物質(zhì)或微生物超標(biāo)。而添加的物類有熟乳、食鹽、蔗糖這類僅為了提高生乳品質(zhì)而對(duì)人體健康危害性不大的物質(zhì)，也包括三聚氰胺、堿類物質(zhì)、β-內(nèi)酰胺酶等危害大的物質(zhì)。添加三聚氰胺會(huì)增加生鮮乳的總氮含量， 從而提高檢測(cè)時(shí)生鮮乳的蛋白質(zhì)含量以用來通過檢測(cè)。而β-內(nèi)酰胺酶可以分解奶牛因使用β-內(nèi)酰胺類還未過休藥期取奶而殘留在生鮮乳中的抗生素，造成不存在抗生素殘留的假象。堿類物質(zhì)的加入可以降低生鮮乳因酸敗而導(dǎo)致的酸度超標(biāo)，從而掩蓋其已經(jīng)變質(zhì)的問題。這些添加劑的加入不僅是欺騙消費(fèi)的行為，更重要的是會(huì)對(duì)人體造成不同程度的急性或慢性永久損傷。生乳及乳制品中非法添加三聚氰胺一直都是檢測(cè)中重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象，對(duì)于三聚氰胺的檢測(cè)方法已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)樣品前處理簡(jiǎn)單方便，可用于大量樣品的篩選。張立靜采用雙抗夾心法建立了TEM1型β-內(nèi)酰胺酶的膠體金免疫層析方法，最小檢出限為6U/mL，該試紙條靈敏度、特異性、穩(wěn)定性均良好。

4.展望

生鮮乳從產(chǎn)出到運(yùn)輸再到檢測(cè)整個(gè)過程都需要安全、快速地進(jìn)行，尤其是檢測(cè)環(huán)節(jié)至關(guān)重要。生乳檢測(cè)環(huán)節(jié)通常要求快速、準(zhǔn)確，檢測(cè)項(xiàng)目多且范圍廣，因此乳品行業(yè)急需能應(yīng)對(duì)各種目標(biāo)物的快速檢測(cè)方法。膠體金免疫層析前處理簡(jiǎn)單、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，將成為快速檢測(cè)方法中新型有效的一種初篩手段，能夠從乳制品源頭、生產(chǎn)到流通各個(gè)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)安全檢測(cè)，對(duì)于乳品加工企業(yè)來講能夠提高產(chǎn)品安全性、節(jié)省人力物力，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對(duì)于市場(chǎng)監(jiān)管部門來講能夠準(zhǔn)確迅速的對(duì)市場(chǎng)上的產(chǎn)品進(jìn)行篩查，具有重要的社會(huì)價(jià)值。而目前對(duì)于生乳的檢測(cè)來說，抗生素、真菌毒素及部分添加劑的檢測(cè)已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)全面使用膠體免疫層析試紙條，但微生物檢測(cè)和重金屬檢測(cè)仍需要利用平板法和大型儀器，這就使得檢測(cè)時(shí)間大大延長(zhǎng)，檢測(cè)所需的儀器和耗材成本也難以降低，這為乳品質(zhì)量安全和乳品企業(yè)的長(zhǎng)期發(fā)展帶來隱患和難題。

因此，快速檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展和膠體金免疫層析檢測(cè)項(xiàng)目全面覆蓋，是乳品行業(yè)乃至整個(gè)食品行業(yè)亟需解決的問題。同時(shí)膠體金免疫層析技術(shù)的功能完善，實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的半定量、定量檢測(cè)，也將成為食品安全快速檢測(cè)的發(fā)展新趨勢(shì)。

第一作者

王琴（1981.03-），女，漢族，新疆克拉瑪依人，碩士，副高級(jí)畜牧師；研究方向：液態(tài)奶質(zhì)量管理和產(chǎn)品開發(fā)。

*通訊作者

任遠(yuǎn)慶（1980.06-），男，漢族，新疆克拉瑪依人，碩士，畜牧師。