基于表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫層析法的卷煙紙中重金屬元素快速檢測(cè)

摘要： 為實(shí)現(xiàn)卷煙紙中重金屬的高敏、定量及快速檢測(cè)，本研究提出了一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS） 信號(hào)的新型免疫層析技術(shù)。SERS免疫層析法使用一種樹(shù)莓狀的SERS標(biāo)簽Fe3O4@樹(shù)莓狀金磁性納米顆粒（Fe@RAu） 捕獲樣本中的金屬殘留物，F(xiàn)e@RAu表面的Au殼能夠產(chǎn)生拉曼熱點(diǎn)效應(yīng)以增強(qiáng)其表面修飾的5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB） 分子的拉曼信號(hào)，且其Fe3O4內(nèi)核可被外加磁力吸附以富集樣本中的靶標(biāo)。基于這些特性，SERS免疫層析法具有超高的檢測(cè)靈敏度和定量能力。結(jié)果表明，該方法同時(shí)檢測(cè)卷煙紙燃燒灰燼中鎘（Cd2+）、鉻（Cr3+）、鉛（Pb2+），3種重金屬離子的靈敏度分別達(dá)1. 424、0. 937和1. 568 ng/kg，檢測(cè)實(shí)際卷煙紙標(biāo)準(zhǔn)樣品的加標(biāo)回收率gt;90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） lt;10%，檢測(cè)時(shí)間（包含預(yù)處理）lt;30 min。

關(guān)鍵詞：卷煙紙；重金屬；快速檢測(cè)；表面增強(qiáng)拉曼光譜；免疫層析

中圖分類號(hào)：TS761. 2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10. 11980/j. issn. 0254-508X. 2025. 01. 012

卷煙紙是用于包裹煙絲制備卷煙煙支的專用紙，由于直接參與卷煙的燃燒過(guò)程，卷煙紙燃燒灰分中的潛在風(fēng)險(xiǎn)物是質(zhì)量安全監(jiān)管的關(guān)鍵指標(biāo)[1-2]。卷煙紙中可能引起安全風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)主要源自造紙?jiān)媳旧砘蚣庸み^(guò)程中引入[3-4]的砷、鉛、鉻等重金屬[5-6]。目前，砷、鉛、鉻的檢測(cè)主要依靠電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS） [7-8]和火焰原子吸收光譜法（FAAS） [9-10]， 上述2 種方法均為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，其檢測(cè)前處理過(guò)程較繁瑣，檢測(cè)效率較低且成本較高，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速實(shí)時(shí)檢測(cè)的要求。免疫層析（lateral flow immunoassay，LFIA） 法是一種以色譜層析分離與免疫識(shí)別為基礎(chǔ)的即時(shí)分析技術(shù)，具有快速、低成本和簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，在食品安全領(lǐng)域被廣泛用于農(nóng)獸藥殘留、抗生素等分析檢測(cè)[11-12]。基于LFIA技術(shù)的食品重金屬檢測(cè)試紙已在食品快檢現(xiàn)場(chǎng)成功應(yīng)用[13-14]，然而，現(xiàn)有LFIA 法通常使用膠體金作為探針來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物，靈敏度低、難以定量，極大地限制了LFIA技術(shù)在微量重金屬元素檢測(cè)中的應(yīng)用。

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced raman spec?troscopy，SERS） 利用金、銀等貴金屬納米粒子的增強(qiáng)基底表面電磁效應(yīng)，大幅放大了檢測(cè)對(duì)象的固有分子振動(dòng)指紋，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度[15-16]。SERS技術(shù)已初步應(yīng)用于廢水、食品中微量重金屬離子的快速檢測(cè)[17-18]。

為實(shí)現(xiàn)卷煙紙中重金屬元素的高敏及快速測(cè)定， 本研究制備了一種新型樹(shù)莓狀SERS 標(biāo)簽DTNB-Fe@RAu，并據(jù)此構(gòu)建了SERS 免疫層析檢測(cè)試紙，通過(guò)便攜式拉曼光譜儀測(cè)量該試紙檢測(cè)線上的SERS 強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了卷煙紙中重金屬離子的定量檢測(cè)，為卷煙紙的安全質(zhì)量監(jiān)管提供了一種高效的檢測(cè)手段，為其他紙制品的重金屬檢測(cè)應(yīng)用提供了方法依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

卷煙紙標(biāo)準(zhǔn)品由國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供，經(jīng)ICP-MS 檢測(cè)：其中4 份陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品中Pb2+含量分別為1.73、4.51、3.80 和10.06 mg/kg，Cd2+含量分別為0.10 、0.46、0.22 和1.22 mg/kg，Cr3+含量分別為1.80、8.26、3.47 和20.02 mg/kg。Pb2+、Cd2+和Cr3+標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/kg） 購(gòu)自北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院。Cd2+單克隆抗體（抗-Cd2+-EDTA-抗體）、Cd2+完全抗原（Cd2+-EDTA-BSA） 購(gòu)自深圳安提生物科技有限公司。乙二胺四乙酸螯合劑、Cr3+單克隆抗體（抗-Cr3+-EDTA- 抗體）、Cr3+ 完全抗原（Cr3+-EDTA-BSA）、Pb2+ 單克隆抗體（抗-Pb2+-EDTA- 抗體）、Pb2+完全抗原（Pb2+-EDTA-BSA） 由江南大學(xué)提供。山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗體購(gòu)自上海生工生物公司。

1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸） （DTNB）、聚乙烯亞胺（PEI）、甲醇、乙醇、乙二醇、二甘醇、亞硫酸氫鈉（NaHSO3）、pH值=7.4 的磷酸鹽（PBS） 緩沖液，聚乙烯吡咯烷酮（PVP），以上試劑均購(gòu)自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司； 四水合氯化鐵（FeCl3·4H2O）、四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）、乙酸鈉、鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫-20（Tween-20），以上試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；鹽酸水溶液（HCl）、去離子水、樣品墊、吸收墊、背卡、硝化纖維（NC） 膜、MCE水系針頭過(guò)濾器，以上試劑和材料均購(gòu)自合肥拜爾迪化學(xué)科技有限公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

用于重金屬檢測(cè)的樹(shù)莓狀SERS標(biāo)簽Fe3O4@樹(shù)莓狀金磁性納米顆粒（Fe@RAu） 的制備過(guò)程如圖1所示，主要包括：PEI包覆、Au殼還原、DTNB修飾、抗體修飾4個(gè)關(guān)鍵步驟。圖2為卷煙紙中重金屬元素的檢測(cè)流程，主要包括：樣品預(yù)處理、靶標(biāo)捕獲、層析檢測(cè)、信號(hào)讀取4個(gè)步驟。

1. 2. 1 重金屬檢測(cè)標(biāo)簽DTNB-Fe@RAu的制備

1. 2. 1. 1 1DTNB-Fe@RAu的制備

1DTNB-Fe@RAu 制備方法主要依據(jù)參考文獻(xiàn)[19]，并在此基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整與優(yōu)化。具體步驟如下。

1） 單分散Fe3O4 納米顆粒（粒徑150 nm） 的制備：將FeCl3·4H2O （540 mg） 和PVP （2 g） 溶于甲醇（10 mL） 和二甘醇（10 mL） 的混合溶劑中，120 ℃攪拌30 min，加入乙酸鈉（1.5 g） 繼續(xù)攪拌30 min。將混合物轉(zhuǎn)入高壓釜，200 ℃加熱10 h。產(chǎn)物用乙醇洗滌3 次，60 ℃真空干燥6 h 得到單分散Fe3O4 納米顆粒。取5 mg 干燥產(chǎn)物分散于5 mL 去離子水備用。

2） Fe@RAu的制備：將制備的具有磁性的單分散Fe3O4納米顆粒水分散液超聲分散10 min，與PEI水溶液（0.3 mg/mL，30 mL） 反應(yīng)。超聲30 min后，用磁性法收集包覆好的磁性顆粒，洗滌2次，重新分散于10 mL去離子水中。將Au納米粒子溶液（60 mL） 加入， 強(qiáng)力超聲30 min， 磁性分離并干燥后得到Fe@RAu。產(chǎn)物分散于5 mL去離子水中備用。

3） DTNB-Fe@RAu的制備：將Fe@RAu水分散液（1 mL） 與含HAuCl4·4H2O （15 μmoL/L）、DTNB（1 μmoL/L） 和PVP（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%） 的NH2OH·HCl水溶液（100 mL） 混合，超聲處理5 min。磁性收集產(chǎn)物，洗滌2次，干燥后得到DTNB-Fe@RAu。產(chǎn)物分散在5 mL乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

使用透射電子顯微鏡（TEM，荷蘭Philips公司）及X射線光電子能譜（XPS，美國(guó)Thermo公司） 對(duì)過(guò)程產(chǎn)物進(jìn)行表征。