黃花菜活性成分提取工藝及快速鑒定方法

摘" "要" "黃花菜含有酚類、多糖、醣甙化合物等多種活性成分。介紹了黃花菜活性成分的低成本分步工業化提取及快速鑒定方法，以及活性成分的結構與功能，以助于更好地高效綜合利用黃花菜，同時為萱草科其他植物活性成分提取鑒定研究提供參考。

關鍵詞" "黃花菜;活性物質;黃酮;皂苷;黃花菜多糖

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni， HCB），又稱檸檬萱草，也有地方稱之為忘憂草、安神菜、金針菜等，是一種多年生草本植物。在地理分布上，其種植區域橫跨中國多個生態區域，涵蓋了秦嶺山脈以南的亞熱帶及溫帶地區，包括湖南省、江蘇、浙江、湖北、江西、四川，向南則延伸至廣東省的珠江三角洲及粵北山地。此外，秦嶺以北的省份，如甘肅、陜西也有種植，最北端到達內蒙古以及東北地區的吉林省。黃花菜生物活性物質有多種次生代謝產物，例如黃酮、多糖、皂苷等，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種功效。因此，對黃花菜活性物質的提取和鑒定方法進行研究具有重要的意義。

1" "材料與方法

1.1" "儀器、材料與試劑" "黃花菜來自陜西大荔縣陜西省生物農業研究所實驗基地;蘆丁標準品由Sigma公司生產，人參皂苷Re標準品產自中國藥物生物檢定所;香草醛、苯、吡啶、甲醇、乙醇、1%三氯化鋁、AB-8大孔吸附樹脂、鹽酸、鎂粉、溴化鉀均購自天津瑞格斯科技有限公司;膜分離裝置（杭州科膜）;紫外—可見分光光度計UV-2501（日本島津公司）;Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛）、超聲波清洗機。

1.2" "活性物質提取方法" "黃花菜活性物質中酚類物質多以黃酮苷的形式存在，如黃酮類化合物。多糖多以低聚果糖形式存在[1]，而糖苷化合物多為皂苷類活性物質。利用黃花菜各種活性成分不同的理化性質，依次提取黃酮類化合物、多糖、皂苷。

1.2.1" "黃酮類化合物提取與含量測定" "將洗凈的鮮黃花菜蒸制5～6 min后晾涼至室溫，曬干，制成粗粉[2]。精密稱取黃花菜干品粗粉25 g，用70%乙醇500 mL，于具塞錐形瓶中，60 Hz超聲40 min[3]，轉入蒸餾燒瓶中，水浴回流數次，過濾（過濾物備用），常壓下回收乙醇，至提取濃縮液為20 mL且無醇味時，停止加熱。過濾物與保留的藥渣用于后續多糖和皂苷提取。

紫外—可見分光光度法鑒定黃花菜總黃酮。精確稱取蘆丁標準品，加50%甲醇制成0.2 mg/mL蘆丁標準溶液。按照中華人民共和國藥典方法，510 nm測吸光值，繪制標準曲線（圖1）[4]。計算回歸方程和相關系數y=13.266x+0.006，R2=0.998 4。

1.2.2" "多糖提取與含量測定" "粗多糖是黃花菜中的一種重要活性物質，具有抗氧化、抗疲勞等多種藥理作用。將黃酮類化合物提取后的過濾物與保留的藥渣采用80%乙醇回流兩次，每次2 h。料液比1 ∶ 40，50 ℃熱水浸泡2 h，抽濾去除單糖和低聚糖，抽濾后剩余不溶物重復提取1次，所有濾液通過0.2 μm微濾膜過濾除去大分子物質和雜質，取濾液依次過截留分子量為6 000、2萬、10萬道爾頓超濾膜，反復3次，濃縮液（透過液備用提取皂苷）用旋轉蒸發器真空濃縮至原體積20%，真空干燥得到粗多糖[5]。

硫酸-苯酚法測定多糖含量。采用國家標準SN/T 4260-2015[5]，490 nm測吸光值，以吸光值為縱坐標，葡萄糖對照液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線（圖2）。計算回歸方程和相關系數y=0.005 5x+0.000 7，R2=0.999 9。

多糖含量以質量分數ω計，公式詳見國家標準SN/T 4260-2015[5]。

1.2.3" "皂苷提取與含量測定" "將多糖提取超濾后透過液用旋轉蒸發器真空濃縮至原體積20%，減壓干燥得到皂苷粗品。皂苷粗品水溶液過大孔吸附樹脂柱，將乙醇溶液洗脫液減壓干燥得到精制黃花菜皂苷[6-7]。

香草醛冰乙酸溶液顯色法測定總皂苷含量。分別吸取20 μL、50 μL、100 μL、150 μL和200 μL的2.0 mg/mL人參皂苷Re，按照《保健食品檢驗與評價技術規范（2003版）》保健食品中總皂苷的測定方法[8]560 nm測定吸光值，繪制標準曲線（圖3）。計算回歸方程和相關系數y=0.001 1x+0.016 4，R2=0.996 9。

2" "結果與分析

2.1" "黃酮類化合物含量測定" "按實驗方法根據回歸方程計算黃花菜樣品中黃酮類化合物活性物質濃度，結果見表1。測得黃花菜提取液中黃酮類化合物含量為0.36 mg/mL，相對標準偏差3.89%，黃花菜黃酮類化合物含量=提取液濃度×提取液總體積/黃花菜質量，得黃花菜中黃酮類化合物含量為14.4 μg/g。

2.2" "多糖含量測定" "硫酸-苯酚法測定多糖含量。取適量黃花菜多糖樣品制成溶液，測定吸光值。根據樣品葡萄糖濃度計算多糖含量，結果見表2。測得黃花菜樣品葡萄糖濃度為78.53 μg/mL，相對標準偏差3.35%，進而依據公式求得黃花菜中多糖含量為11.31 g/100 g。

2.3" "皂苷含量測定" "按實驗方法分別測定樣品吸光度。計算樣品中總皂苷含量，結果見表3。本方法測得黃花菜樣品中總皂苷含量為437.64 μg，相對標準偏差 2.79%。

3" "討論

3.1" "黃酮類化合物與多糖提取工藝優化" "為了進一步優化黃酮與多糖分步提取工藝，在未來的工作中可以考慮超聲波輔助提取工藝優化，將乙醇濃度、提取溫度、提取時間、超聲功率和料液比5個工藝參數為變量，選取對試驗結果影響較大的因素及相應水平正交試驗，篩選出黃酮類化合物優化提取工藝[9]。

按照1.2.2方法過程中，在提取出粗多糖后，抽濾去除單糖和低聚糖工藝前可以增加多糖優化提純工藝。將乙醇沉淀出的黃花菜多糖分別用無水乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯洗滌后離心分離，重復多次，除去溶劑后真空干燥至恒重[1]。

3.2" "黃酮類化合物快速鑒定" "在經過2.1方法鑒定黃酮類化合物后，為了滿足批量生產快速經濟性，可以通過熒光檢識黃酮結果。楊青等根據C3-羥基類黃酮在紫外光下熒光顯著的原理，在紫外光下觀察濾紙上黃花菜提取液，如顯亮黃綠色熒光，即可確認含C3-羥基類黃酮化合物[10]。

3.3" "黃花菜多糖光譜分析

3.3.1" "紫外光譜分析" "準備1.0 mg/mL黃花菜多糖水溶液，對樣品在190～400 nm范圍內進行掃描，分析樣品共軛體系、不飽和鍵、芳香環結構。樣品在200 nm處有微弱吸收，具有多糖特征。在220、260 nm處沒有明顯吸收峰，背景平坦。經過分析，可以確定不含核酸、蛋白質以及多肽成分。見圖4。

3.3.2" "紅外光譜分析" "將1 mg干燥的黃花菜多糖樣品與100 mg干燥的溴化鉀粉末混合研磨均勻并壓制成薄片，進行紅外光譜分析，結果如圖5所示。

紅外光譜分析結果顯示，黃花菜多糖樣品在3 100～3 600 cm-1范圍內出現寬而強的吸收峰羥基伸縮振動吸收峰;在3 000～2 800 cm-1和1 480～1 300 cm-1范圍內出現CH3、CH2、CH等基團的C-H伸縮振動和彎曲振動吸收峰;在1 700～1 550 cm-1范圍內出現C=O羰基伸縮振動吸收峰;在1 000～1 200 cm-1范圍內，出現吡喃糖苷存在的特征峰。吡喃糖苷是低聚果糖等糖類化合物中常見的結構單元。綜合以上紅外光譜特征，所提取的產品是一種低聚糖[11]。

參考文獻

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