FAdV-4通過Inc87774-MDM2-p53通路誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

摘要：由禽腺病毒4型（FAdV-4）引起的禽心包積液性肝炎綜合征近年來在我國頻頻發(fā)生，給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。長鏈非編碼RNA（incRNA）是病毒感染期間宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為揭示其在FAdV-4感染時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞的作用及機(jī)理，本研究以雞肝癌細(xì)胞系LMH為對(duì)象，通過芯片測序、生物信息學(xué)分析及Real-time PCR等方法篩選病毒感染過程中的關(guān)鍵incRNA分子，并通過熒光定位雜交、編碼一非編碼基因共表達(dá)（CNC）分析、Real-Lime PCR、酶聯(lián)免疫吸附（ELLSA）、RNA pull-down和蛋白免疫共沉淀（RIP）、流式細(xì)胞分析等分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位及互作蛋白的篩選、驗(yàn)證和功能分析。結(jié)果表明，篩選出了FAdV-4感染引起的關(guān)鍵incRNA分子inc87774，其主要定位在細(xì)胞質(zhì)，其靶向結(jié)合互作蛋白為E3泛素連接酶MDM2，過表達(dá)inc87774，MDM2和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，p53和Bax的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，顯著抑制細(xì)胞凋亡；沉默inc87774，上述基因表現(xiàn)出相反的變化趨勢且顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步沉默MDM2后，p53的表達(dá)量顯著上調(diào)，但同時(shí)過表達(dá)／沉默inc87774對(duì)FAdV-4引起的細(xì)胞凋亡沒有影響，表明FAdV-4感染LMH細(xì)胞過程中inc87774通過MDM2靶向調(diào)控p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。該研究結(jié)果將增加我們對(duì)FAdV-4與宿主細(xì)胞互作的認(rèn)識(shí)，為宿主抗病毒防御機(jī)制提供理論支持。

關(guān)鍵詞：禽腺病毒4型；長鏈非編碼RNA；蛋白互作；細(xì)胞凋亡；先天性免疫；致病機(jī)理

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025）01-0142-09

禽腺病毒4型是一種無囊膜的dsDNA病毒。近年來，F(xiàn)AdV -4引起的禽心包積液性肝炎綜合征廣泛流行。對(duì)我國家禽綠色健康養(yǎng)殖構(gòu)成巨大的威脅。被FAdV-4感染的家禽通常會(huì)出現(xiàn)急性死亡，死亡高峰集中在感染1周之內(nèi)，死亡家禽出現(xiàn)典型的心包積液以及包涵體肝炎癥狀。此外，F(xiàn)AdV-4感染能夠?qū)е滤拗鞯拿庖咭种疲纱藢?dǎo)致的免疫失敗、繼發(fā)感染、混合感染進(jìn)一步加劇了HHS的危害。FAdV-4宿主廣泛，不僅感染規(guī)模養(yǎng)殖的蛋雞、肉雞、肉種雞，也可以感染鴨、鵝以及多種野生鳥類，F(xiàn)AdV-4感染宿主的多樣性增加了跨宿主傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，給該病的科學(xué)防控增加了難度。FAdV-4抵抗力強(qiáng)，即可以水平傳播，也可以垂直傳播，導(dǎo)致其防控難度大。因此，為保障養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，加強(qiáng)對(duì)FAdV-4致病機(jī)制的研究十分必要。

天然免疫是機(jī)體抵抗病原體入侵的第一道屏障，具有保護(hù)機(jī)體免受外源病原微生物入侵和清除自身衰老或損傷細(xì)胞的重要功能。長鏈非編碼RIVA（long noncoding RNA，IncRNA）作為一種新的調(diào)節(jié)因子，在病毒和宿主相互作用過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，廣泛參與病毒的感染過程并雙向調(diào)控宿主天然免疫反應(yīng)。研究表明IncRNA參與各種不同的生物學(xué)過程并在其中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞生長和分化、凋亡、自噬、免疫反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等。例如，IncRNA-ELIT-l作為Smad3的輔助因子能促進(jìn)TCF-B/Smad信號(hào)傳導(dǎo)和上皮一間質(zhì)的轉(zhuǎn)化。聚核梭桿菌靶向lrtcRNA EN01-IT1促進(jìn)結(jié)直腸癌的糖酵解和腫瘤發(fā)生。在官頸癌研究中，LncRNA TUG1能夠競爭性結(jié)合miRNA-381-3p導(dǎo)致MDM2靶基因表達(dá)量升高以減輕細(xì)胞凋亡。

病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種策略來逃避免疫系統(tǒng)的消除，越來越多的研究表明，IncRNA在宿主抗病毒反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，是病毒感染期間宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。目前，關(guān)于IncRNA的研究在動(dòng)物疾病方面也有很多的報(bào)道。例如IncRNA TCONS_0179042在Mare-145細(xì)胞中能抑制豬繁殖與呼吸道綜合征病毒的復(fù)制。Lu等鑒定并分析了H5Nl亞型禽流感病毒感染鴨后得到的IncRNA表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)其中58條IncRIVA與抗H5Nl亞型禽流感病毒免疫反應(yīng)相關(guān)：Li等鑒定并分析了禽傳染性支氣管炎病毒感染HD11細(xì)胞的IncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)IneRNA在宿主抗IBV反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用；Chai等在流感病毒與宿主相互作用研究中發(fā)現(xiàn)，IncRNA ISG20在流感病毒感染和復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，并揭示了IneRNA ISG20作為一種新型干擾素誘導(dǎo)基因在宿主抗病毒天然免疫防御系統(tǒng)中的作用。因此，我們推測IncRNA在FAdV-4對(duì)宿主細(xì)胞的感染過程中也可能扮演著重要的角色，而其在宿主細(xì)胞中的作用與機(jī)理還不清楚，有待深入研究。本研究以雞肝癌細(xì)胞系LMH為宿主細(xì)胞，通過芯片測序等手段篩選FAdV-4感染過程的關(guān)鍵IncRNA及互作蛋白，并利用多種分子生物學(xué)方法探究其作用機(jī)制，以期為FAdV-4的防治提供理論支持。