不同濃度EM菌對凡納濱對蝦生長及腸道菌群的影響

摘" 要：為探究不同濃度EM菌（Effective Microorganisms）對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長性能的影響，試驗選用體長3.0 cm的凡納濱對蝦蝦苗，向水中添加EM菌，養殖周期為60 d，試驗分為試驗組1、試驗組2、試驗組3（水體中菌液濃度分別為1×10⁴、1.5×10⁴、2×10⁴ CFU/mL）和對照組（對照組不添加EM菌）。結果顯示，1×10⁴ CFU/mL組凡納濱對蝦的生長性能最佳，1.5×10⁴ CFU/mL組對凡納濱對蝦生長指標和存活率無顯著影響（P＞0.05），2×10⁴ CFU/mL組提高了特定生長率。與對照組相比，試驗組腸道細菌數量有顯著增加（P＜0.05），試驗組2中，OUT數量顯著增加（P＜0.05），試驗組3中，在水中添加2×10⁴ CFU/mL的EM菌可提高對蝦腸道菌群物種豐度。相較于對照組，試驗組1能提高凡納濱對蝦的食物轉化率、攝食率和成活率。該研究有助于了解水體中EM菌濃度對凡納濱對蝦的生長和腸道細菌群落的作用，為凡納濱對蝦的疾病管理和養殖提供一定的理論依據。

關鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；EM菌（Effective Microorganisms）；生長性能；腸道菌群；養殖

中圖分類號：S966.12 文獻標志碼：A

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，也叫白腳蝦，正常體色為青藍色或青灰色，全身無斑紋^[1]。其盛產于南美洲大西洋沿岸，特點是生存能力極強，生長發育速度很快，產肉率較高，對飼糧中的蛋白質含量的要求較低，中國以及世界各地都在大規模養殖，是當今世界三大養殖蝦種之一。但是近幾年由于養殖的密度過高使對蝦在養殖過程中容易發病死亡，讓對蝦的產量下降，使養殖戶承受較多損失。由于長期使用抗生素等化學藥物，不僅使病原菌產生了耐藥性，引起內源性感染及二重感染，破壞了水產動物消化道內正常菌群生態環境，使其產生免疫抑制作用，抗生素在水產動物體內的積累對人類健康也是一種潛在威脅^[2]。隨著養殖技術的逐漸發展，益生菌被作為營養添加劑加入了養殖過程中，使用益生菌能在不產生抗生素副作用的前提下，起到促進水生動物生長發育的作用。近幾年，有益菌在水產動物的養殖過程中已經吸引了大家的關注。EM菌（Effective Microorganisms）有效微生物菌劑是由光合細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌等5科10屬80多種微生物復合培養而成^[3]。自20世紀80年代初問世以來，EM菌技術已在100多個國家和地區得到推廣和應用^[3]。在水產養殖方面，李躍華等在青蝦的養殖中使用EM菌時發現，提高了初級生產力，與對照池相比試驗池產量約高出6%，試驗池含磷總量以及溶解氧顯著增加^[4]。目前主要研究了EM菌可以提高水生動物的存活率、調節水質、抑制有害病菌的生長，并且降低亞硝酸鹽的含量、提高磷元素的利用率等^[5]。但是目前對于不同濃度的EM菌對凡納濱對蝦生長性能及其腸道菌群的影響研究較少，為此，該試驗開展不同濃度下的EM菌對凡納濱對蝦影響的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凡納濱對蝦由大連德洋水產養殖有限公司提供，體長（3.0±0.2 ）cm，體質量（0.47±0.05）g的凡納濱對蝦蝦苗720尾，蝦的附肢完整健康、活力好；EM菌劑由江西天意生物技術有限公司提供；水泥池6口（體積4 m×4 m×2 m），1 m×1 m網箱12個。

1.2 試驗設計和方法

1.2.1 試驗設計

將720尾凡納濱對蝦苗人工養殖60 d，設置4口養殖水泥池，試驗分三個試驗組和一個對照組，每口水泥池10 m³水體，每個水泥池設3個平行，每個水泥池放置三個網箱，網箱面積為1 m×1 m，每個網箱投放蝦苗60尾，共720尾蝦苗，向水體中添加EM菌養殖60 d。試驗組分別投放EM菌，使水體中菌液濃度分別為1×10⁴ CFU/mL、1.5×10⁴ CFU/mL、2×10⁴ CFU/mL，對照組不投放EM菌。

1.2.2 試驗對蝦樣品采集

凡納濱對蝦養殖60 d后停食24 h，每個平行組隨機撈取6尾對蝦，然后用滅完菌的醫用解剖剪在冰上解剖蝦體，解剖的凡納濱對蝦腸道放入1.5 mL的離心管中，并放入液氮中暫存，取樣完成后保存于-80℃冰箱，每次取蝦腸道后在酒精燈高溫滅菌后，再取下一個對蝦的腸道。

1.2.3 腸道菌群基因組測序分析

進行細菌DNA提取、16S rDNA特異引物PCR擴增、擴增引物純化、DNA測序、序列比對等步驟，首先對原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據（Clean Data），然后基于有效數據進行OTUs（OPerational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析^[5]。根據OTUs聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況^[5]。同時對OTUs進行豐度、AlPha多樣性計算、Venn圖和花瓣圖等分析，以得到樣本內物種豐富度和均勻度信息、不同樣本或分組間的共有和特有OTUs信息等^[6]。另一方面，可以對OTUs進行多序列比對并構建系統發生樹，通過PCoA、PCA、NMDS等降維分析和樣本聚類樹展示，可以探究不同樣本或組別間群落結構的差異^[6]。

1.3 日常管理

試驗蝦每天早晚飽食投喂1次（8∶00，18∶00），每日投喂量為蝦苗體質量的7%，每天吸污1次，每天適量補充收集殘餌和糞便流失的水量，5 d～7 d按網箱體積（100 cm×100 cm×100 cm，水體800 L）1/3～1/2的量換一次水，菌投放時間間隔為3 d。試驗期間溶解氧≥6 mg/L，鹽度2.5‰，pH值8.0～8.5，水溫24 ℃～27 ℃，總堿度0.16 mmol/L，總硬度0.3 mmol/L。

1.4 計算公式

食物轉化率（FCE，%）、攝食率（FI，%/day）、特定生長率（SGR，%/day）

食物轉化率FCE=100（W2 - W1）/ F

攝食率FI=100×C / [T ×（W2 - W1）/ 2]

特定生長率SGR=100×（InW2 - InW1）/ T

存活率=Nt/ N0 × 100 %

式中，W2、W1分別表示凡納濱對蝦最終體質量和起始體質量（g），F表示飼料攝入量，T表示生長天數，C表示凡納濱對蝦所攝食飼料的干物質量（g），Nt和N0分別為終末尾數和初始尾數。

1.5 試驗數據分析

試驗數據處理用SPSS 27進行單因素方差分析，各個處理組之間存在顯著差異（Plt;0.05），采用Duncan多重比較。試驗數據采用平均值±標準差表示，不同字母（a，b，ab）用于表示組間的顯著性差異，相同字母的組之間無顯著差異，不同字母的組之間存在顯著差異（Plt;0.05）。

2 結果

2.1 不同濃度的EM菌劑對凡納濱對蝦體質量的變化

如表1所示，與對照組相比，試驗組1和試驗組3凡納濱對蝦的體質量增長顯著（P＜0.05），試驗組2較對照組凡納濱對蝦體質量有增長但是不顯著（P＞0.05）。

2.2 凡納濱對蝦食物轉化率

如圖1所示，對照組（a）與試驗組1（b）有顯著差異，即試驗組1的FCE明顯高于對照組，說明該處理顯著提高了食物轉化率（Plt;0.05）。試驗組1（b）與試驗組2（ab）、試驗組3（ab）之間沒有顯著差異（P＞0.05），試驗組2（ab）和試驗組3（ab）與對照組（a）之間沒有顯著性差異，但與試驗組1（b）相比略低，說明這兩個處理組可能提升了FCE，但效果沒有達到統計學顯著性（P＞0.05）。

2.3 凡納濱對蝦特定生長率

如圖2所示，對照組（a）與試驗組3（b）之間存在顯著差異（P＜0.05），試驗組3的處理方式顯著提高了特定生長率（SGR）。試驗組試驗組2（ab）均與對照組（a）和試驗組3（b）無顯著差異（P＞0.05），說明這兩個組的SGR介于對照組和試驗組3之間，但未達到統計學顯著性（P＞0.05）。試驗組1（ab）和試驗組2（ab）與試驗組3（b）之間也無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 凡納濱對蝦攝食率

如圖3所示，與對照組相比，試驗組1凡納濱對蝦的攝食率有顯著差異（P＜0.05），試驗組2和試驗組3的凡納濱對蝦攝食率沒有顯著性差異（P＞0.05）；試驗組1與試驗組2和試驗組3相比，凡納濱對蝦攝食率沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.5 凡納濱對蝦成活率

如圖4所示，對照組的成活率為75.56%，試驗組1的成活率為91%，試驗組2的成活率為71.11%，試驗組3成活率為67.22%。

2.6 凡納濱對蝦腸道菌群結果分析

如表2所示，飼料中添加不同濃度的EM菌對凡納濱對蝦腸道有效OTUs數目有顯著影響（P＜0.05），腸道OTUs數目最高值出現在試驗組3，用Alpha多樣性分析對蝦腸道微生物群落的多樣性，各組腸道菌群檢測覆蓋率指數均大于0.99。與對照組相比，試驗組3的香濃多樣性、辛普森多樣性和Chao指數差異性顯著（P＜0.05）。

如圖5所示，在門水平上，對蝦腸道菌群主要包含放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、未被定義的菌門（unidentified Bacteria）為主，各組菌群類別基本一致，但是相對豐度存在一定差異。所有試驗組中的變形菌門相對豐度較對照組有下降趨勢，試驗組2中厚壁菌門的相對豐度顯著高于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，添加EM菌的各試驗組的變形菌門較對照組其相對豐度均下降，而厚壁菌門有所升高。

由圖6所示，在屬水平上，腸道菌群主要由弧菌屬（Vibrio）、念珠菌屬 （Candidatus Bacilloplasma）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）組成。其中，所有試驗組中念珠菌屬、弧菌屬的相對豐度均高于對照組（P＜0.05），而所有試驗組中的希瓦氏菌屬和乳酸桿菌屬相對豐度顯著低于對照組（P＞0.05）。試驗組3中氣單胞菌屬相對豐度高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 EM菌對凡納濱對蝦生長的影響

研究表明，EM菌不僅可以提高水生動物的存活率，而且是一種無污染、能夠抑制有害病菌的生長，而且還能降低硝酸鹽的含量，提高磷元素的利用率等^[7]。伍麗等在飼料中直接添加EM菌，試驗表明有效改善了鯽魚和大口鯰的血液指標，并且增強了機體的新陳代謝，促進了養殖魚類的生長，該試驗結果與之相符合^[8]。

該研究結果顯示試驗組與對照組相比，添加了EM菌的試驗組中的凡納濱對蝦的特定生長率逐漸隨著添加的EM菌濃度的增高而增高，說明EM菌對水產養殖動物的特定生長率起到直接促進作用。武鵬在對幼參進行試驗時發現，不同濃度之間，試驗范圍內濃度越大對幼參生長的促進作用越顯著（P＜0.05）^[9]。這可能與投喂濃度高，有益菌可以更快進入和定植幼參腸道，提高幼參消化吸收率有關^[9]。該試驗與武鵬等的實驗結果是相似的，即添加EM菌對凡納濱對蝦的特定生長率起到良好的促進作用，且在一定限度內，隨著EM菌的濃度升高，其特定生長率也在升高。胡京等通過研究4個EM菌劑處理組顯著高于對照組（P＜0.05），對海參的生長性能均有顯著提高，其中工2-L組效果最顯著（P＜0.05），質量增加率達到84.0%。試驗表明，在一定限度內，隨著EM菌的濃度升高，其特定生長率也在升高^[10]。該試驗結果與胡京、董琦、張春巖等研究結果相似。這可能是因為EM菌本身就有大量的營養物質，當它們在動物的腸道內定植、繁衍和代謝之后，就可以產生動物生長需要的氨基酸、促生長因子和多種酶，以此來增強機體的代謝能力，讓機體能充分利用養分，使養殖對象快速生長。

3.2 EM菌對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

蝦腸道內富含許多微生物，其中包括一些能夠代謝蛋白質的細菌和酵母菌，將蛋白質分解成小分子的氨基酸，提供給對蝦進行吸收利用，正常腸道微生物菌群在機體內構成一道天然屏障，對動物營養、生長健康、免疫等方方面面起著重要的作用^[11]。對蝦的消化、吸收、代謝、腸道發育和免疫系統防御能力與腸道菌群有著微妙的關系，腸道菌群對于蝦類的生長有著重要意義，也對對蝦生存有重要的生理意義^[12]。研究表明健康蝦腸道菌群代謝氨基酸可能通過合成蛋白質、酶和激素等功能來維持健康狀態并提供能量^[13]。也有研究報道，益生菌可以對有害菌產生拮抗作用，來競爭營養物質與生存繁殖空間，從而達到抑菌目的，也改善水產動物的腸道微生物組成^[14]。該試驗中，與對照組相比，試驗組中凡納濱對蝦食物轉化率、特定生長率、成活率都有提高，說明了所選濃度的EM菌劑能提高凡納濱對蝦對飼料的利用率，促進凡納濱對蝦的生長和成活。

4 結論

該試驗的結果表明，與其他三組相比，試驗組3，在水中添加2×10⁴ CFU/mL的EM菌可以提高對蝦腸道菌群物種豐度，這應該與EM菌的濃度及營養成分有關，與對照組相比，試驗組2橫軸上的跨度垂直方向與平滑程度相似，沒有提高對蝦腸道菌群豐度，這可能與EM菌的濃度有關系，也可能受到其他因素的影響。綜上所述，添加1×10⁴ CFU/mL的EM菌對凡納濱對蝦的生長性能最佳，而1.5×10⁴ CFU/mL的EM菌組則對凡納濱對蝦生長指標和存活率無顯著影響（P＞0.05），2×10⁴ CFU/mL的EM菌組只是提高了特定生長率。因為EM菌作為水質調節劑投入養殖水體中，通過多種具有益生功能的不同屬的多個細菌相互協同作用，改善養殖環境，抑制環境中的病原菌來促進水產動物的生長。該研究有助于了解EM菌對南美白蝦腸道細菌群落的影響，為凡納濱對蝦的疾病管理和健康養殖提供理論依據。但是益生菌是如何作用于宿主腸道菌群并優化其菌群結構的，有待于進一步的研究。

參考文獻：

[1]何淑君.南美白對蝦溫棚養殖技術簡介[J].漁業致富指南，2023（3）：49-50.

[2]WANG Yamin，WANG Yingeng.Advance in the Mechanisms and Application of Microecologics in Aquaculture[J].Progress in Veterinary Medicine2008，29（6）：72-75.

[3]夏蒙，李朋富.微生態制劑作用機理及其在水產養殖中的應用[J].黑龍江水產，2013（2）：39-41.

[4]李躍華，葛家春，彭剛，等.二種微生物制劑對青蝦池水質和生長的影響[J].水產養殖，2009，30（10）：65-67+70.

[5]CHUMPOL S P， KANTACHOTE D P， NITODAT，et al.The roles of probiotic purple n-onsulfor bacteria to control water quality and prevent acute hepatopancreati-cnecrosis disease （AHPND） for enhancement growth with higher survival in white shrimp （Litopenaeus vannamei） during cultivation[J].Aquaculture，2017，473（2）：327-336.

[6]郝爽，張振國，尤宏爭，等.復合益生菌對凡納濱對蝦腸道菌群結構的影響[J].水產科學，2022，41（4）：597-604.

[7]周紅艷，陳麗珊，黃艷清. EM菌劑與EDTA配施對銅、鉛復合污染下黑麥草種子萌發和生長及重金屬吸收的影響[J].江西農業學報，2021，33（11）：145-150.

[8]伍莉，陳鵬飛.微生態制劑對大口鲇和鯽魚生長及血液指標的影響[J].西南師范大學學報（自然科學版），2007（1）：82-86.

[9]武鵬，趙大千，蔡歡歡，等. 3種微生態制劑對水質及刺參幼參生長的影響[J].大連海洋大學學報，2013，28（1）：21-26.

[10]胡京，董琦，張春巖，等.兩種EM菌劑對養殖水體水質及幼刺參生長性能的影響[J].大連工業大學學報，2016，35（2）：79-83.

[11]李舢舢，趙晨曦，吳波，等.肝腸胞蟲對凡納濱對蝦腸道和肝胰腺菌群的影響[J].水生生物學報，2024，48（2）：315-323.

[12]鄭軍榮，羅婷，李志強，等.4株凡納濱對蝦腸道益生菌分離、鑒定及應用研究[J].水產科學，2019，38（3）：320-326.

[13]HUANG Zhishu， AWEYA J J， ZHU Chunhua， et al. Modulation of crustacean innate immune response by amino acids and their metabolites：inferences from other species[J]. Frontiers in Immunology，2020（11）：574721.

[14]孫永旭，董宏標，段亞飛，等.魚類腸道應激及其損傷防護研究進展[J].海洋湖沼通報，2019（3）：174-183.

The effect of different concentrations of EM bacteria on the growthand intestinal flora of Litopenaeus vannamei

LING Zhan¹， WANG Zhengang^1，2， LIU Gang¹， WANG Maolin¹， ZHANG Wei³

（1.Dalian Ocean University， Key Laboratory of Applied Biology and Augmentation of Northern Fish in Liaoning Province， Dalian 116023， Liaoning China; 2.Donggang Aquatic Technology Promotion Station， Dandong" 118399， Liaoning China; 3. Donggang City Huangtukan Farm Co.， LTD.， Dandong 118300， Liaoning China）

Abstract：In order to explore the effects of different concentrations of Effective Microorganisms on the growth performance of Litopenaeus vannamei， larvae of 3.0 cm long Litopenaeus vannamei were selected and added into the water. The culture period was 60 days. The experiment was divided into experimental groups 1， 2 and 3 （the concentration of bacterial liquid in water was 1×10⁴， 1.5×10⁴ and 2×10⁴ CFU/mL， respectively） and control group （no EM bacteria was added in the control group）. The results showed that 1×10⁴ CFU/mL group had the best growth performance， 1.5×10⁴ CFU/mL group had no significant effects on the growth index and survival rate of Litopenaeus vannamei （Pgt;0.05）， and 2×10⁴ CFU/mL group increased the specific growth rate. Compared with the control group， the number of intestinal bacteria in test group was significantly increased （Plt;0.05）， the number of OUT in test group 2 was significantly increased （Plt;0.05）， and the species abundance of intestinal flora in test group 3 was increased by adding 2×10⁴ CFU/mL EM bacteria in water. Compared with the control group， experimental group 1 could improve the food conversion rate， feeding rate and survival rate of Litopenaeus vannamei. This study helps to understand the effects of EM bacteria on the growth and intestinal bacterial community of Litopenaeus vannamei， and provides a theoretical basis for disease management and culture of Litopenaeus vannamei.

Keywords：Litopenaeus vannamei; Effective Microorganisms （EM）; growth performance; Intestinal flora; culture

基金項目：2021年遼寧省海洋經濟發展項目資助；遼寧省教育廳面上項目（JYTMS20230500）。

作者簡介：凌戰（1999- ），男，碩士在讀。主要從事水產養殖學研究。E-mail：13327756486@163.com。

通訊作者：王茂林（1980- ），男，博士，副教授。主要從事水產養殖學、魚類生理生態學研究。E-mail：wangmaolin@dlou.edu.cn。