白菜類蔬菜遺傳轉化研究進展

摘 " "要：遺傳轉化技術是研究白菜類蔬菜基因功能和開展遺傳育種的重要手段。通過適宜的遺傳轉化方法，可以將目標基因導入生物基因組，實現對其生物學特性和經濟性狀的改良。然而，白菜類蔬菜的遺傳轉化面臨著再生能力差、轉化效率低等問題。通過查閱國內外白菜類蔬菜遺傳轉化相關文獻，對影響白菜類蔬菜遺傳轉化效率的因素（基因型、再生體系、轉化方法等）進行了分析和總結，探討了CRISPR/Cas9在遺傳轉化中的應用，并對其再生與遺傳轉化的前景進行了展望。

關鍵詞：白菜類蔬菜；遺傳轉化；再生體系；轉化方法；CRISPR/Cas9

中圖分類號：S634 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）02-001-06

Research progress on genetic transformation of Brassica rapa vegetables

ZHANG Jiaxin1， 2， ZHANG Wenjing2， LU Cuiling3， SU Henan2， ZHAO Yanyan2， WEI Xiaochun2， YANG Shuangjuan2， WANG Zhiyong2， FENG Jianqi4， ZHANG Xiaowei2， YUAN Yuxiang2， YUAN Jingping1

（1. College of Horticulture and Landscape Architecture， Henan University of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 2. Vegetable Research Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 3. Zhengzhou Institute of Agriculture Science and Technology， Zhengzhou 450006， Henan， China; 4. Kaifeng Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Kaifeng 475004， Henan， China）

Abstract： Genetic transformation technology is an important toll for exploring the gene functions of Brassica rapa vegetables and conducting genetic breeding. Through appropriate genetic transformation methods， target genes can be introduced into the genome to improve their biological characteristics and economic traits. However， the genetic transformation of Brassica rapa vegetables faces challenges such as poor regeneration ability and low transformation efficiency. This paper reviews the relevant literature on genetic transformation of Brassica rapa vegetables both domestically and internationally， analyzes and summarizes the factors affecting transformation efficiency （such as genotype， regeneration system and transformation method， etc.）， discusses the application of CRISPR/Cas9 in genetic transformation， and provides prospects for "regeneration and genetic transformation in the future.

Key words： Brassica rapa vegetables; Genetic transformation; Regeneration system; Transformation methods; CRISPR/Cas9

白菜類蔬菜包括大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）、小白菜（Brassica rapa L. chinensis）和菜心（Brassica rapa L. chinensis var. utilis Tsen et Lee）等，屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）作物。白菜類蔬菜在我國蔬菜產業中占據重要地位，白菜類蔬菜育種對提高農業生產力至關重要。隨著組織培養技術、分子標記輔助育種技術和基因工程育種技術的進步，生物技術在農業中的應用越來越廣泛。將抗蟲、抗病等優異基因導入植物基因組中，對改良農作物、解決農業生產中的難題具有重要意義。目前，遺傳轉化技術已成為白菜類蔬菜育種工作的重要手段之一，但白菜類蔬菜的遺傳轉化仍面臨著許多問題。白菜種是蕓薹屬3個基本種和3個復合種中最難進行組織培養的一類[1]，其轉化效率遠遠低于同為蕓薹屬的油菜和甘藍。目前，研究者不斷探索和改良遺傳轉化方法，提高其再生率和轉化效率。筆者將歸納匯總目前已報道的白菜類蔬菜遺傳轉化方法和影響因素，以期為白菜類蔬菜遺傳轉化效率的提升和技術的優化提供參考[2]。

1 遺傳轉化的再生體系

高頻再生體系是遺傳轉化的基礎，近年來，國內外學者在白菜類蔬菜再生體系的建立方面做了大量工作，并取得了較大進展。用于白菜類蔬菜遺傳轉化的再生體系包括誘導愈傷組織的再生體系、直接分化的再生體系以及以生殖細胞為受體的再生體系[2]。其中，誘導愈傷組織的再生體系是最常用的方法。在誘導愈傷組織的再生體系中，影響再生的因素包括基因型、外植體類型、培養基成分等諸多因素。

1.1 基因型

白菜類蔬菜的基因型對愈傷組織誘導和植株再生頻率影響極大，即使采用相同的培養條件，不同基因型也具有不同的再生頻率[2]。選擇合適的基因型對建立高頻再生體系至關重要。研究表明，白菜的再生率由核基因控制[3]。白菜類蔬菜屬于AA基因組，而控制芽再生的相關基因位于C基因組上[4-5]。Murata等[6]指出缺乏C基因的白菜類蔬菜，相比于CC型的甘藍類蔬菜，其不定芽再生困難、植株再生能力較低，這一現狀已成為制約白菜類蔬菜功能研究以及白菜轉基因品種培育的一大因素。張鳳蘭等[7]比較了123個大白菜基因型的再生頻率，結果表明，不同大白菜品種再生頻率差異極大，再生頻率與品種起源、結球類型及熟性無相關性。曹家樹等[8]研究了7個白菜類蔬菜栽培品種和1個雜交親本離體培養再生情況，發現青梗類品種的離體再生頻率明顯高于白梗類品種，認為青梗類品種更適宜離體培養的植株再生。任家利[9]對22個不同基因型的大白菜和小白菜進行再生分析，其中有17個可被誘導出不定芽，并指出純合基因型利于誘導出不定芽。

1.2 外植體類型

目前，白菜類蔬菜再生中應用最多的外植體有子葉、子葉柄、帶柄子葉、下胚軸、小孢子、花粉等。外植體只有同時具備再生能力強、易于農桿菌侵染、適應性強等特點，才能成為良好的轉化受體。Li等[10]對大白菜的下胚軸、帶柄子葉和根的不定芽分化進行評估，發現帶柄子葉的平均分化率高達81.15%。劉雨佳[11]用大白菜花粉和小孢子誘導胚狀體的形成。張曉東等[12]以大白菜品種Seoul下胚軸為外植體，建立了大白菜高效穩定再生體系，誘導出不定芽的頻率最高為39.15%。范愛麗等[13]提出白菜外植體保留單片子葉的切割方式明顯優于保留2片子葉的切割方式。陳敏敏等[14]比較了不結球白菜的帶柄子葉、子葉、沿葉脈切開的半子葉-子葉柄和下胚軸4種不同外植體的再生率，發現帶柄子葉的再生能力最強，子葉次之，下胚軸最差。劉學成等[15]利用06J28基因型大白菜真葉建立了高效再生體系，再生率最高達87.63%。

1.3 培養基成分

白菜類蔬菜再生體系的研究中大多使用MS培養基和B5培養基，并在這些培養基的基礎上再添加有利于愈傷組織誘導分化及再生的物質。在植物組織培養中，激素的種類和濃度對植株的再生效率具有決定性影響，特別是在白菜類蔬菜的遺傳轉化和再生過程中，確定合適的激素配比對提高再生頻率尤為重要。

在白菜類蔬菜離體芽誘導階段培養中，常用的生長素及類似物有NAA、IAA、IBA、2，4-D等，細胞分裂素有KT、6-BA、TDZ、CPPU等，其他種類激素有ABA、GA3等[9，16-18]。在誘導白菜類蔬菜不定芽分化時使用的激素組合多為6-BA+NAA或TDZ+NAA[19-20]。在生根方面，有研究發現用單一的生長素（IAA、IBA、NAA）刺激能表現出較高的生根率，而有研究則認為細胞分裂素和生長素組合的共同作用的生根效果更佳，只是與誘導培養基的激素比例不同[21]。

在植株生長的過程中會產生乙烯等氣體，所以多數培養基中都會添加AgNO3來中和這些氣體，同時它還具有促進植物器官和體細胞胚胎發生[22]、緩解褐化與玻璃化現象的作用。杜紅等[23]研究表明，培養基添加AgNO3能明顯促進大白菜子葉的芽再生。不同基因型的植株、不同的外植體類型和不同的轉化方法在離體培養各階段所需要的成分都不盡相同。

2 遺傳轉化的方法

目前，常用于白菜類蔬菜遺傳轉化的方法有基因槍法、磁轉染法和農桿菌介導法等。

2.1 基因槍法

基因槍法也稱粒子轟擊法，其基本原理是將外源DNA包被在金粉或鎢粉微粒中，通過基因槍轟擊將包被的顆粒直接轉移到細胞或組織中，進而在受體植株基因組中穩定遺傳表達，其本質是一種物理過程，故基本不受受體基因型的限制，使用范圍也更廣泛[24]。李菲[25]第一次報道以基因槍法進行大白菜遺傳轉化體系的構建。劉雨佳[11]利用基因槍法轟擊大白菜小孢子得出轉化效率為10.83%。但基因槍法作為轉基因技術工具，存在轉化率低、成本高、外源DNA易損和僅能轉移小于10 kb DNA片段等局限性[24]。

2.2 磁轉染法

利用磁性納米粒子（magnetic nanoparticles， MNPs）載體運轉外源基因，通過磁場進入和轉化細胞的過程稱作磁轉染法。磁性納米顆粒介導的轉化技術通過將質粒DNA包裹在磁性納米顆粒中，形成MNP-DNA復合物，利用磁場將這些復合物引入花粉中，然后用這些花粉給植物授粉，DNA會整合到植物的基因組中，產生轉基因種子，這些種子可以再生為轉基因植物[24]。該方法通過將DNA直接送入花粉中，通過授粉實現遺傳轉化，無需組織培養。劉雨佳[11]利用大白菜小孢子及花粉粒分別作為轉化受體，初步探討了以磁轉染法轉化大白菜的方式。許可翠[26]等用磁轉染法轉化不結球白菜，轉化效率為8.89%。侯忠樂[27]利用花粉磁轉化方法成功將外源基因編輯載體導入不結球白菜植株，獲得了轉基因植株。磁轉染法作為一個新興的遺傳轉化手段，仍存在許多問題，如基因轉化機制尚未明確、納米載體設計復雜以及需要針對不同植物系統定制建立有效的轉化體系等。

2.3 農桿菌介導法

農桿菌介導法是實現遺傳轉化成功例子最多的植物轉基因方法，因其具有轉化大片段DNA、轉化效率高、操作簡便且能穩定遺傳等優勢，已成為植物遺傳轉化的首選。在植物基因工程中大約有80%的遺傳轉化是通過農桿菌介導完成的[28]。農桿菌分為根癌農桿菌和發根農桿菌，其含有Ti（tumor-inducing）質粒，可通過對植物受傷部位的侵染將外源DNA整合入宿主細胞基因組。通過人為改造Ti質粒上的DNA片段，可以實現對植物的轉基因改造[11]。此方法選擇靈活，可基于離體再生體系完成轉化，又可獨立完成轉化[29]。李海艷[30]對4種農桿菌菌株（GV3101、LBA4404、EHA105、AGL-1）的大白菜遺傳轉化效率進行了比較，結果顯示GV3101菌株得到了最高的抗性愈傷組織誘導率、抗性芽分化率和轉化率，表明其轉化能力最強。EHA105、LBA4404和AGL-1的抗性愈傷組織誘導率、抗性芽分化率、轉化率都依次降低。賈艷麗[31]利用農桿菌介導法將抗蟲基因轉入漢陽青小白菜中，轉化率為3.65%。梁雯雯[32]利用農桿菌介導法建立了菜心的遺傳轉化59

體系，轉化率為2.22%。但農桿菌介導法也存在對物種基因型和外植體依賴性強、對組織培養技術要求高、轉化周期長等缺點。

2.4 其他方法

基因槍法、磁轉染法和農桿菌介導法各有利弊，研究者們也嘗試了其他方式。如孟茜[33]首次構建了細胞穿透肽介導的大白菜小孢子遺傳轉化體系，其主要是利用CPPs作為承載外源DNA等生物大分子物質的載體進入細胞。Liu等[34]用浸花法轉化普通白菜，結果表明用于擬南芥轉化的浸花法也可以適用于其他十字花科植物。Khan等[35]用浸花法轉化高產多室類型白菜，發現半開放花轉化率為7.2%，完全開放花轉化率為5.2%。胡毅等[36]利用蘸花法對普通白菜進行遺傳轉化并得到轉基因植株。趙靜[37]采用真空滲入法將目的載體轉入大白菜中，轉化率為0.37%。楊慧瑩[38]用超聲波-真空滲入法轉化結球白菜，但未獲得轉基因植株。

3 轉化載體的選擇

遺傳轉化載體構建是其中最為關鍵的一步。選擇具有合適的選擇標記基因和報告基因的遺傳轉化載體能極大地提高試驗效率。

3.1 選擇標記基因

在遺傳轉化過程中，標記基因的選擇起著關鍵作用。選擇標記基因通常用于識別成功整合到細胞或組織的目標基因。白菜類蔬菜遺傳轉化中常見的選擇標記基因分別為抗生素抗性基因（nptⅡ、hpt）和除草劑抗性基因（bar）。通過將相應篩選劑加入培養基中來篩選帶有轉基因載體的植株，篩選劑提供選擇性壓力，僅使包含目標基因的細胞能夠存活和生長。篩選劑的選擇必須與選擇標記基因匹配，篩選劑的濃度需要足夠高以抑制未轉化細胞的生長，但又不能對轉化細胞產生毒性[37]。

含有新霉素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）標記的載體可以選擇卡那霉素（Kan）、遺傳霉素（G418）、新霉素等作為篩選劑。含有潮霉素磷酸轉移酶基因（hpt）標記的載體可以選擇潮霉素（Hyg）作為篩選劑。賈艷麗[31]在建立白菜高效遺傳轉化體系當中使用20和25 mg·L-1的Kan進行篩選。潮霉素作為篩選劑時質量濃度范圍多在8～20 mg·L-1[1]。Sivanandhan等[39]通過逐漸增加潮霉素質量濃度（10～12 mg·L-1），對大白菜子葉外植體進行3次篩選，成功實現了14%的轉化率。

抗除草劑基因（bar）編碼膦化麥黃酮（phosphinothricin，PPT）和乙酰轉移酶（phosphinothricin acetyltransferase，PAT），可以使轉基因植株對篩選劑草丁膦、草銨膦及其類似物Basta具有耐性[2]。劉任源[29]發現，8 mg·L-1膦化麥黃酮（PPT）可作為菜心轉化過程中的最適篩選劑和質量濃度。Park等[40]用5 mg·L-1草胺膦篩選出了過表達的大白菜轉基因植株。

選擇合適的標記基因，探索最適宜的篩選劑濃度對抑制和篩選未轉化的植株、提高篩選效率、提高轉化率有重要作用。

3.2 報告基因

為方便快捷地鑒定轉化植株，需要用到報告基因。在白菜類蔬菜轉基因研究中常用的報告基因包括uidA（GUS）和GFP。uidA（GUS）基因編碼能夠水解X-葡萄糖苷基底物（如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷）的β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），進而產生藍色反應物。因此，通過GUS基因的表達能夠觀察到組織或細胞中的活性位置，從而檢測轉基因的表達情況[41]。張國裕等[42]利用GUS染色組織分析法研究最適轉化條件，建立了農桿菌介導的菜心遺傳轉化體系。綠色熒光蛋白（GFP）是一個廣泛應用的熒光報告基因。GFP基因可以通過其獨特的綠色熒光標記在細胞或組織中表達，GFP自身可發光，不需要外加底物，可以直接通過熒光顯微鏡觀察，因此應用于基因表達、蛋白質定位等研究中[43]。報告基因的表達實現了轉基因表達的實時檢測和可視化，是研究基因功能及生物過程的強大工具。Xin等[44]利用抗GFP抗體對大白菜轉基因植株進行驗證。侯忠樂[27]在轉化后的第3天檢測到GFP熒光蛋白標簽的表達，得到CRISPR/Cas9系統編輯的不結球白菜，編輯效率為12.5%。選擇合適的標記基因不僅可以提高轉化效率，鑒定轉基因植物的準確性和簡便性，還能幫助人們快速識別成功轉化的個體，從而加速育種進程，減少篩選時的工作量和降低成本。

4 應 用

近年來CRISPR/Cas9基因編輯技術得到廣泛應用并與遺傳轉化相結合。CRISPR/Cas9基因編輯技術利用Cas9核酸酶和向導RNA，精確識別和切割基因組中的特定位點[45]。切割后通過DNA修復機制（如NHEJ或HDR）引入插入、缺失等修飾，實現基因的精準編輯和改造。與傳統的轉基因技術相比，CRISPR/Cas9具有靶向性高、操作簡便、成本低廉、精確定位和編輯特定基因序列等特點，適用于各種生物體的基因編輯[46]。此外，CRISPR/Cas9能夠實現穩定遺傳的突變，確保編輯后的基因能夠在后代中傳遞。在農業中，它常被用于培育具有抗病性、耐逆性和高產特性的作物品種[47]。CRISPR/Cas9在大白菜中的應用并不影響大白菜轉化效率[30]。吳棟雄[48]對菜心CRISPR/Cas9系統進行了初步的探索。李海燕[30]建立了穩定高效的大白菜遺傳轉化體系，并將CRISPR/Cas9系統成功地應用于大白菜基因編輯，最終該體系經重復試驗證明，平均轉化率為10.83%。王薇[49]在研究中對白菜材料中的基因進行特異敲除，在得到的基因編輯植株中，檢測到在靶點處發生不同程度的堿基替換，進而驗證了白菜目的基因的功能。Park等[50]研究表明，CRISPR/Cas9介導的基因敲除能夠成功生成具有獨特代謝特性的白菜育種資源，且CRISPR/Cas9技術能夠高效應用于功能性大白菜育種中。

5 展 望

目前，白菜類蔬菜遺傳轉化仍面臨遺傳轉化效率較低、篩選困難、后代難以收種、基因型依賴性強、受生長激素和培養條件影響較大、轉化不穩定、轉基因植株嵌合體多、假陽性高等問題。解決這些問題需要綜合利用新的技術和方法。在再生體系方面需要對外植體類型、培養基成分等進行綜合優化，以提高再生效率。面對再生困難的品種應重點研究不依賴于組織培養的轉化方法，選擇合適的載體與工具。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的發展，其越來越多地應用于相關作物的分子育種及基因功能鑒定上，遺傳轉化技術與CRISPR/Cas9基因編輯技術相結合必將推動白菜類蔬菜育種技術的發展。

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