甜瓜果實細胞壁修飾相關基因的篩選和分析

摘 " "要：甜瓜細胞壁對果實的脆度和口感具有重要影響。為了闡明細胞壁修飾相關基因對果實發育影響的分子機制，以厚皮甜瓜桂蜜12號為試材，應用轉錄組學﹑生物信息學篩選和分析雌花授粉后5 d和20 d的果實生長差異表達的基因。結果顯示，果實兩個發育時期差異表達基因有2950個，上調1141個，下調1809個。在富集Q值最顯著的前20個條目中，GO富集指向細胞組分、生物過程等所涉及細胞壁數目最多（8個，占40%）；KEGG富集后它們指向代謝途徑、遺傳信息途徑、環境信息處理、細胞過程等途徑。篩選出多聚半乳糖醛酸酶、擴張蛋白、木葡聚糖內糖基轉移酶、葡萄糖醛酸轉移酶、激素合成酶等基因，推測它們共同參與細胞壁修飾，影響甜瓜果實品質。

關鍵詞：甜瓜；細胞壁修飾；差異表達基因；轉錄組學；生物信息學

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）02-016-09

Screening and analysis of genes related to fruit cell wall modification of muskmelon fruit

LIANG Renfan1， HUANG Hao1， WEN Junli1， LIAO Yunyun2， GAO Xiaofeng3， WEI Chuanyi3， ZHANG Man1， WU Yongsheng1， ZHOU Guolie3， ZHOU Shengmao1

（1. Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China; 2. Nanning Vegetable Research Institute， Nanning 530021， Guangxi， China; 3. Yulin Academy of Agricultural Sciences， Yulin 537006， Guangxi， China）

Abstract： The cell wall of muskmelon plays an important role in the fruit’s crispness and taste. To clarify the molecular mechanisms of the effect of cell wall modification related genes on fruit development， the muskmelon varity Guimi No. 12 was used as the test material， and transcriptomics and bioinformatics were applied to screen and analyze the differential expression genes in the fruit at 5 and 20 days after pollination of female flowers. The results showed that there were 2950 differential expression genes during the two fruit development stages， with 1141 genes up-regulated and 1809 down-regulated. Among the top 20 enriched terms with the most significant Q-values， the GO enrichment pointed to cellular components and biological processes， with the highest number of cell wall related terms（8， accounting for 40%）. KEGG enrichment indicated pathways related to metabolism， genetic information proocessing， environmental information processing， and cellular processes. Genes such as polygalactulose synthase， expansion protein， xyloglucan glycosyltransferase， glucuronosyltransferase， and hormone synthase were selected， suggesting that these genes collectively participate in cell wall modification， affecting the quality of muskmelon fruit.

Key words： Melon; Cell wall modification; Differential expression gene; Transcriptomics; Bioinformatics

甜瓜是世界上種植廣泛的葫蘆科經濟作物，以果實品質優異而深受廣大消費者喜愛。隨著人們生活水平的提高，對果實品質的要求越來越高，果實品質成為甜瓜市場價值和產業發展的關鍵因素[1]。細胞壁是影響果實品質的重要因子，細胞壁組分的化學組成、結構和功能等理化特性對果實的脆度和口感具有重要影響[2]，也是影響果實大小、果實軟化及營養風味等品質變化的因素之一[3-5]。

目前，已知植物纖維素、半纖維素、果膠、木質素和糖蛋白是細胞壁的主要組分，它們的化學結構以及參與其合成、成熟、周轉的生化過程成為植物生物學的一個重要研究領域[6]。其中，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、擴展蛋白（EXP）及木葡聚糖內糖基轉移/水解酶（XTH）、葡萄糖醛酸轉移酶（GUX）等酶在細胞壁組分形成與修飾中發揮重要作用。編碼這些酶的PG、EXP、XTH和GUX等基因為超大基因家族[7]，在細胞壁形成與修飾中起著核心作用[3]。PG通過降解多聚半乳糖醛酸來參與果膠降解，使細胞壁結構解體，導致果實軟化[8]；EXP通過打斷纖維素與半纖維素之間的氫鍵連接，改變細胞壁的剛性結構，進而促進膨壓驅動的細胞生長和果實軟化[9]；XTH通過對半纖維素木葡聚糖的轉糖基和水解作用，促進細胞壁松弛，從而起到軟化果實的作用[10]。現已證明，西瓜PG基因Cla009218參與西瓜果肉成熟軟化，它的表達量與果實硬度呈正相關[11]；CmEXPA12、DkXTH1等基因分別在甜瓜、番茄等作物果實膨大生長階段表達量上升，起到調控果實大小的作用[5，12]；GUX基因在植物細胞壁形成中影響作為細胞壁上第二豐富多糖的木聚糖形成，經基因組重測序發現，GUX存在不同的表達模式，推測其高表達可以促進核桃細胞壁增厚[13]。植物激素也參與細胞壁的擴張、延伸、松弛等重構的修飾。在經典的“酸生長假說”中，生長素通過增加質子外排速度起到細胞壁酸化作用，從而增強細胞壁的延展性[2]；赤霉素、乙烯與XTH酶等共同參與細胞壁重組、組裝等修飾，促進細胞壁擴張[14]，這些激素形成的相關酶及其編碼的相關基因也勢必參與細胞壁的形成。

轉錄組是一個物種或特定類型的器官、組織和細胞產生等所有轉錄物的集合[15]。轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術因具有操作簡單、成本低、精度高和快速鑒定等優點而成為篩選差異表達基因的重要手段[15]。通過轉錄組學分析，前人篩選出甜瓜一系列與發育、代謝和抗性等功能有關的基因[16-18]；徐敏[19]挖掘出杏果實多個乙烯合成關鍵基因和細胞壁果膠酶代謝關鍵基因，這些基因差異表達量與果實成熟的軟硬度有著高度一致性。

盡管甜瓜等植物細胞壁生物合成機制至今已有大量研究，但是關于組分修飾及其分子機制研究方面的報道尚少。因此，筆者以廣西農業科學院選育的厚皮甜瓜桂蜜12號為試材，篩選和分析了雌花授粉后5、20 d的果實形成相關差異表達基因，旨在為闡明細胞壁組分修飾影響甜瓜品質的機制提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣西農業科學院育成的厚皮甜瓜桂蜜12號為試材，該品種早熟，果實發育期35 d左右，成熟果皮金黃色，具有稀網紋，果肉橙色，肉質爽脆，中心可溶性固形物含量（w，后同）16%左右，果實食用率69%左右，單果質量1.5 kg左右[20]；于2021年3月24日在海南省三亞市樂東九所廣西南繁基地采用無土栽培方式種植，隨機區組設計，3次重復。吊蔓栽培，單蔓整枝，在主蔓12節以上單株留瓜1個，雌花現花時采用人工輔助授粉。

1.2 方法

1.2.1 取樣測序 經過授粉后，在果實膨大2個關鍵點：膨大前期（授粉坐果后5 d）和膨大后期（授粉坐果后20 d）分別隨機采摘果實，去皮后取果肉中心部位切成約3 cm小塊，立即用液氮速凍，再放于-80 ℃冰箱保存，由深圳市惠通生物科技有限公司進行轉錄組測序。

1.2.2 生物信息學分析 首先運用Fastp軟件對各樣本轉錄組測序所得原始數據（RawDatas）進行質控，獲得高質量數據（CleanData）；再采用HISAT 2軟件與已知甜瓜基因組進行序列比對分析，將本次測序結果中發現但未被參考基因組（或參考基因集合）收錄的基因定義為新基因（Novel gene）；利用RSEM計算每個樣本中所有基因的表達量，表達量以FPKM值表示。使用DESeq2軟件進行基因差異表達水平分析，以FDRlt;0.05 amp; |log2FC|gt;1的基因篩選為顯著差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。將差異表達基因分別與GO、KEGG數據庫進行比對，利用Q值最小前20個GOterm和Pathway作圖；利用STRING 12.0蛋白質互作數據庫（http：//String-db.org）和Cytoscape V3.10進行差異基因蛋白互作網絡分析和制作網絡圖。

1.3 統計分析

采用WPS Office 2023進行數據整理，采用IBM SPSS Statistics 27.0進行統計分析，采用Originlab originpro 2021和GraphPad Prism 9.5等軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 甜瓜果實膨大過程中的形態變化

甜瓜果實發育期一般為35 d左右。為了確定桂蜜12號甜瓜果實膨大關鍵期，在雌花授粉后5、20 d進行果實表型形態觀察。由圖1可知，隨著果實膨大，果實橫徑由2.8 cm長至12.3 cm，增幅296.8%，果實縱徑由4.8 cm長至18.1 cm，增幅277.1 %，橫向膨大速度比縱向快；果實表面由發育初期帶白毛狀變為無毛而光亮；囊腔內種子由白色漸變為橙紅色，種子逐漸飽滿，果肉漸變橙色，說明桂蜜12號甜瓜經過20 d生長發育，果實開始進入成熟期。

2.2 RNA-Seq轉錄本質量分析

轉錄組測序所得原始數據經過質量分析后，與已知甜瓜基因組（基因總數21 818個）進行RNA序列比對。結果顯示（表1），Q30堿基質量平均值為92.39%（5 d）、93.10%（20 d）；兩樣本共獲得92.14×106個比對序列，比對率分別為92.98%（5 d）、93.04%（20 d）。對序列組裝成轉錄本后，與參考基因模型進行比較，兩樣本各檢測到22 035個基因表達，新基因（Novel_Genes）217個。

為了解各樣本整體基因表達重復性情況，采用小提琴圖對樣本基因表達豐度進行分析（圖2），中位數（白線）水平位置基本一致，各樣本基因表達量log10（fpkm）值多數落在1～2，上位綠色線（上四分位數）分布基本一致。但20 d階段3個重復基因表達分布較5 d均勻，下位綠色線（下四分位數）兩時期基因表達一致。黑色圖形縱軸方向20 d長度比5 d長，說明20 d數據彌散程度較大，個別基因表達差異大，但總體上兩個階段基因表達豐度基本一致，多數基因表達量log10（fpkm）值在1～2。

2.3 甜瓜果實發育過程中差異表達基因時空表達

根據試驗組間表達量差異倍數︱log2（fc）︱≥1及差異水平（FDR）p≤0.05條件對基因進行篩選，結果（圖3-A～B）顯示，在5 d與20 d的比較中，共獲得差異表達基因（DEGs）2950個（褐色），上調基因1141個（紅色），下調基因1809個（藍色），無顯著差異基因19 085個（黑色），下調基因數多于上調基因數，說明果實在剛授粉時基因表達最強烈，生命特征旺盛，隨后在膨大進程中，生理代謝處于下行階段。

2.4 差異表達基因GO和KEGG功能注釋和富集分析

對差異表達基因進行GO功能注釋，結果（圖4-A）顯示，在富集Q值最顯著前20個GOterm條目中，差異基因表達一級富集分2類，包括細胞組分（cellular component，6個）和參與生物過程（biological process，14個）兩個過程，表明從宏觀上富集前20個條目的差異表達基因功能分布在2個類型上。它們涉及細胞壁8個（占40 %），細胞骨架3個（占15 %），糖代謝2個（占10 %），色素積累2個（占10 %），其他生長發育、外部封裝結構組織、色素積累、細胞成分大小的調節等各1個（占5 %）。這些說明在果實膨大過程中，涉及細胞壁最多，是膨大進程中最活躍的代謝生理之一。

對差異表達基因進行KEGG代謝通路分析，結果（圖4-B）顯示，對于富集Q值最顯著的前20個pathway條目而言，一級富集途徑指向代謝（metabolism，16個）、遺傳信息（genetic information processing，1個）、環境信息處理（environmenta information processing，1個）、細胞過程（cellular processes，1個）等4個代謝途徑，說明差異基因主要富集到代謝途徑。其中，Q值最大映射為代謝途徑ko01100，涉及差異基因背景數量為2072個；上調比例最大為代謝途徑ko0052，涉及半乳糖代謝，富集到51個差異基因；RichFactor值最大為代謝途徑ko00998，涉及次生代謝產物生物合成，富集到2個差異基因。這說明在雌花授粉后5、20 d間形成果實的代謝差異，以代謝途徑為主。

依據上述GO和KEGG功能解釋，從雌花授粉5 d與20 d的果實基因差異表達中，篩選到細胞壁修飾相關基因137個，占總差異基因的4.1%。其中，上調基因39個，占總候選基因的28.5%；下調基因98個，占總候選基因的71.5%，總體下調基因數量比上調數量多。

上調基因中（圖5-A），與細胞壁相關的蛋白、酶等基因修飾相關10個（GO：0009827// plant-type cell wall modification），占總上調候選基因數的25.6%，差異倍數較大，包括多聚半乳糖醛酸酶（At3g15720，ncbi：103494869，log2（fc）=14.85）、擴張蛋白（EXPA8，ncbi：103496617，log2（fc）=1.41；EXLB1，ncbi：103503501，log2（fc）=3.07）、木葡聚糖內糖基轉移酶（XTH27，ncbi：103495069，log2（fc）=1.53）、XTH30，ncbi：103503575，log2（fc）=2.21）等基因；與激素相關的候選基因29個，其中與乙烯相關的13個，占激素相關基因數44.8%，接近一半，是上調最多的激素種類，說明乙烯是甜瓜果實膨大進程中最為活躍的激素類型。

下調基因（圖5-B～C）中，篩選到與細胞壁修飾的蛋白、酶等相關候選基因22個，包括擴張蛋白（EXPA1，ncbi：103489135；EXPB3，ncbi：103490518）、木葡聚糖內糖基轉移酶（XTH15，ncbi：103491388；XTH33，ncbi：103489017）、葡萄糖醛酸轉移酶（GUX4，ncbi：103495046；GUX2，ncbi：103487894）等基因。篩選到與激素相關的候選基因76個，分別為CYCA3-2（ncbi：103487861C）、MAPKKK17（ncbi：103495976）、CDKB2-2（ncbi：103493849）等，細胞增殖相關激素占比最大。

2.5 細胞壁修飾相關基因的互作關系

為探討細胞壁修飾相關基因的互作關系，根據差異基因的表達量、蛋白互作等關系，對差異倍數[log2（fc）]≥3的41個候選基因（蛋白及酶等16個和激素25個）進行基因相關性分析和蛋白互作網絡分析。

相關分析結果（圖6）顯示，蛋白及酶的上調相關基因與激素的上調相關基因呈正相關，如EXLB1與UGT73C2（R=0.81）、CYP88D6（R=0.73）；XTH31與ERF110（R=0.98）、ABR1（R=0.87）、BBM（R=0.84）；At4g23560與ABR1（R=0.91）。其中，XTH31與激素為呈正向顯著相關個數最多的基因，說明XTH31與激素關系更密切。相反，它們與下調的激素相關基因呈負相關，但未達到顯著水平。同理，下調的細胞壁修飾的酶及蛋白的相關基因與下調的激素相關基因呈正相關，如GUX2與MYB101（R=0.85）、SN1（R=0.89）、CTL2（R=0.92）、WAT1（R=0.84）、EXO70A1（R=0.96）、GPAT6（R=0.96）等呈顯著正相關；而其與上調激素相關基因呈負相關，XTH10與CYP88D6（R=-0.87）、ERF110（R=-0.84）、ABR1（R=-0.92）、UGT73C2（R=-0.91）等多個激素基因呈顯著負相關，說明XTH10更易受激素負向調控。

應用STRING蛋白質互作數據庫（http：//string-db.org）中的互作關系，從數據庫中提取出差異基因集合，利用cytoscape構建互作關系網絡圖。結果表明，由XTH31、EXLB1、CYP88D6、TAR2、CYP735A2、UGT73C2、ACO3等7個中心節點構成上調蛋白互作網絡圖（圖7-A），它們可能在上調基因中起核心作用。同理，由EXPA1、XYL1、XTH33、CEL1、At2g01630、At3g07010、PGL3、MYB101、GASA1、ARAC7等10個中心節點構成下調蛋白互作網絡圖（圖7-B），它們可能在下調候選基因中起核心作用。

3 討論與結論

3.1 細胞壁修飾相關基因表達促進果實膨大

細胞通過調節細胞壁擴張性能和重排細胞壁動態結構而得以伸長膨大[21-22]。但是，細胞壁擴張性能需要EXP、XTH、PG等修飾酶催化激活才能完成，這些酶活性直接或間接地影響細胞壁組成，進而控制細胞寬度[22-23]。筆者通過轉錄組分析發現，在甜瓜雌花授粉5、20 d的果實膨大生長期間，多聚半乳糖醛酸酶基因（At3g15720，PG）、擴張蛋白基因（EXPA8，EXLB1）、木葡聚糖內糖基轉移酶基因（XTH27，XTH31）等10個細胞壁修飾相關基因高度上調，排在GO富集顯著差異最前面，與果實不斷變大生長相吻合，且EXLB1和XTH31起核心作用。由此推斷，這些基因可能參與調控甜瓜果型大小。許多研究證實，CmEXPA12基因促進甜瓜果實膨大[5]，過表達DkXTH1促進轉基因番茄果實膨大[2，11]，PG參與果膠水解等[24]，本研究推斷的結果與前人研究結果相一致。但是，據報道PG主要對果實起軟化調控作用，有關促進膨大方面的研究鮮有報道，有待進一步研究。

3.2 細胞壁修飾相關基因表達促進果實軟化

細胞壁修飾相關基因均是多家族基因，它們參與多項功能，涉及植物生長發育、果實成熟軟化、非生物脅迫等重要功能[5]。現已證實，McXTH參與調控海巴戟果實軟化[10]，超量表達EXP1使番茄果實變軟[25]；木聚糖葡萄糖醛酸轉移酶基因（GUX）屬于GT8家族成員，在木聚糖側鏈形成中發揮著重要的作用，參與某些原壁組分的合成[26]，但參與軟化調控方面的研究鮮有報道。在本研究中，編碼細胞壁修飾相關擴張蛋白（EXPA1和EXPB3）、木葡聚糖內糖基轉移酶（XTH15和XTH33）、木聚糖葡萄糖醛酸轉移酶（GUX4和GUX2）等22個候選基因高度下調，并以EXPA1、XTH33等基因為下調核心。同一家族中，下調數量比上調多，與果實在膨大進程中不斷變硬生長一致。因此，結合前人研究結果推斷，表現下調細胞壁修飾相關基因參與調控果實爽脆和硬度大小。但也有學者認為，PG基因在果實成熟初期開始轉錄，直到成熟過程仍持續高表達[27]，與本試驗中At3g15720（PG）表達相似，說明上調At3g15720基因在膨大階段參與調控果型大小，但在成熟階段可能轉為參與調控果實軟化。因此，對甜瓜果實發育5、20 d篩選獲得細胞壁修飾相關差異基因，按膨大、軟硬等功能分類，可大體分三類，第一類為主要與果實膨大相關基因，主要在膨大期上調表達；第二類為主要與果實軟化相關基因，在膨大期下調表達，但在成熟期轉為上調表達；第三類為可能膨大與軟化功能兩者兼有，在不同發育階段表達趨向相同，但功能不同，膨大期上調表達調控果實大小，成熟期上調表達調控軟化，但它們在成熟期實際表達作用仍需進一步研究。

3.3 細胞壁修飾基因表達與細胞分裂的關系

在植物細胞中，細胞壁的修飾和形成過程與細胞分裂密切相關。一方面，植物細胞在分裂時會首先在內部合成新的細胞壁，然后與現有的細胞壁融合，才最終完成細胞分裂?。另一方面，果實生長分為細胞分裂和細胞擴展兩個階段，細胞分裂是細胞膨大的前期階段，它限定了果實最終的細胞數目，決定了果實最終的大小[28]。甜瓜、黃瓜等作物授粉后1～5 d是細胞快速分裂期，5 d后為細胞膨大、體積變大和間隙增加的膨大期[29-30]。本研究結果顯示，在細胞壁相關基因上調的同時，伴隨著細胞增殖相關的CYCA3-2、MAPKKK17、CDKB2-2等基因大量下調，且下調數多于上調數，說明桂蜜12號甜瓜果實膨大前期（1～5 d）可能以細胞分裂為主，膨大期（5～20 d）以細胞體積膨大為主，與前人研究一致。但是，細胞壁修飾相關基因如何參與細胞分裂鮮有報道。另外，本研究中的甜瓜果實授粉5 d后較早進入膨大期階段，以及20 d后果肉開始變為橙黃，說明桂蜜12號膨大期比較短，可能與桂蜜12號為早熟品種有關。有學者認為，甜瓜細胞分裂階段長短與果實大小相關[31]。所以，如何維持細胞分裂長短可能是今后選育早熟甜瓜的重要措施之一。

3.4 細胞壁修飾相關基因互作關系

參與細胞壁修飾的酶、蛋白和激素等物質互為密切相關，它們協同調控細胞壁延伸、松弛等功能[32]。擴張蛋白膨大的酸化環境需由IAA誘導，GA參與XTH促進細胞壁擴張，XTH促進擴張蛋白滲入細胞壁等[2]。越來越多的證據顯示，植物激素參與果實細胞壁修飾來促進膨大和調控果實軟硬度。生長素IAA能夠促進番茄果實SlXTH、黃瓜果實CsEXP10表達量上調[33-34]，促進果實膨大，但對SlXTH2、多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性具有一定抑制作用，表達量下調，使果實變硬[34-35]；GA參與XTH、CsEXPb1等促進細胞壁擴張[2，36]；乙烯促進榴梿DzEXP1、香蕉MaXE等基因表達[37-38]，這些生物功能可能與植物激素參與促進細胞壁酸化有關[2]。在本研究中，XTH31、EXLB1與CYP88D6一致表現上調，它們之間的表達量呈顯著正相關，在蛋白互作中有直接關聯作用，進一步說明細胞壁修飾相關的擴張蛋白、赤霉素等物質之間密切相關，共同促進甜瓜果實膨大。

綜上所述，筆者運用轉錄組測序篩選出甜瓜果實膨大進程中差異表達的基因，通過生物信息學方法對這些差異表達基因進行分析和分類，推測它們與細胞壁修飾相關，共同參與果實大小、果實軟硬等生理調控，進而影響果實品質，但候選基因功能有待進一步驗證。

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