可栽培黃色羊肚菌品種的鑒定與系統發育分析

摘 " "要：采集栽培馴化基地的黃色羊肚菌子囊果樣品，經組織分離獲得了菌絲體培養物，進而采用常規的形態學特征結合多基因系統發育分析，包括內轉錄間隔區（internal transcribed spacers，ITS）、延長因子1α（elongation factor 1-alpha，EF1-α）、RNA聚合酶II大小亞基（RNA polymerase II subunit 1/2，RPB1/ RPB2）4個DNA片段，對3個可栽培黃色羊肚菌品種進行分類鑒定。子囊果的宏觀和微觀形態特征表明，馴化栽培羊肚菌屬于黃色羊肚菌類群物種；基于4個DNA片段的系統發育分析表明，3個馴化羊肚菌品種序列與10個黃色羊肚菌參考序列一起被聚類在黃色羊肚菌支系（Esculenta clade）內，與Mes-21標本被聚類在一個單系發育類群（支持率100%），表明其屬于Mes-21系統發育學種。這是首次被確認的黃色羊肚菌人工栽培種類，將有效地推動我國黃色羊肚菌人工栽培技術發展和規模化栽培應用。

關鍵詞：羊肚菌；支系；馴化栽培；系統發育學種；Mes-21

中圖分類號：S646.7 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）02-059-07

Identification and phylogenetic analysis of cultivable yellow morel mushrooms

ZHANG Wenchang1， SUN Wenhua2， WANG Haiyan3， YIN Qi1， KONG Weili2， HE Peixin1， LIU Wei4

（1. College of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450001， Henan， China; 2. Institute of Mushroom， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 3. Luoyang Wilderness Ecological Agriculture Co.， Ltd.， Luoyang 471000， Henan， China; 4. Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences/Yunnan Key Laboratory for Fungal Diversity and Green Development， Kunming 650201， Yunnan， China）

Abstract： The ascocarps of yellow morel samples from a cultivation and domestication base were collected， and mycelial isolates were obtained through tissue separation. Conventional morphological characters combined with the analysis of concatenated sequences of internal transcribed spacers（ITS）， elongation factor 1-alpha（EF1-α）， RNA polymerase II subunit 1/2（RPB1/ RPB2）were used to classify and identify three cultivated yellow morel varieties. The macro- and micro-morphological characteristics of the ascocarps supported their identities of yellow morels. Phylogenetic analysis based on four gene fragments showed that the sequences of the three domesticated morel varieties clustered together with 10 morel reference sequences in the Esculenta clade， and with the Mes-21 in a monophyletic group（support rate 100%）， indicating that they belong to the Mes-21 phylogenetic species.. This is the first confirmed artificial cultivated species of Esculenta clade， which will effectively promote the development of yellow morel artificial cultivation technology and its large-scale cultivation applications in China.

Key words： Morel mushrooms; Esculenta clade; Domestication; Phylogenetic species; Mes-21

羊肚菌（Morel）生物分類學上隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），是一類世界性分布的珍稀食藥兼用真菌，具有益腸胃、消化助食、化痰理氣、補腎納氣、補腦提神之功效，并具有抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調節和保護肝臟等功能[1-5]。羊肚菌子囊果具有環境可塑性和微觀結構的保守性，使得傳統的以形態特征為主的分類困難重重[6]。核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacers，ITS）序列分析被廣泛地應用于羊肚菌物種鑒定[6-10]，但其應用存在著分辨率低的局限性，基于ITS僅能揭示該屬大約76%的物種多樣性[6，10]。目前，多基因譜系一致性系統發育學物種識別（genealogical concordance phylogenetic species recognition， GCPSR）應用于羊肚菌分類鑒定已經成為共識，主要基于ITS、核糖體大亞基（ribosomal large subunit，LSU）、延伸因子1α（elongation factor 1-alpha，EF1-α）和RNA聚合酶II大小亞基（RNA polymerase II subunit 1/2，RPB1/ RPB2）等基因片段，對羊肚菌進行系統發育分析和物種鑒定。基于GCPSR，可把羊肚菌分為黃色羊肚菌支系（Esculenta clade）、黑色羊肚菌支系（Elata clade）和變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea clade）[6，11-17]。

自2012年以來，我國實現了黑色羊肚菌物種的商業化栽培[2]。據統計，2021年我國的羊肚菌總種植面積已達1.6萬hm2，覆蓋了全國大部分地區[18]。目前，梯棱羊肚菌（M. importuna）、六妹羊肚菌（M. sextelata）和七妹羊肚菌（M. eximia）是中國羊肚菌大田栽培中的主要種類。栽培品種的野生資源主要發生在中國的西南高海拔地區，包括四川青川、平武、綿陽、涼山州和云南的香格里拉到麗江一帶，經過持續馴化栽培，逐漸演化為可栽培商業化品種[1-2，4-5]。實際上，我國平原地區和低海拔山區，同樣蘊藏著非常豐富的黃色羊肚菌資源。然而，黃色羊肚菌的馴化栽培工作一直沒有實質性突破，直到最近，源自河南省洛陽市的野生黃色羊肚菌成功實現了馴化栽培，有望規模化推廣應用。黃色羊肚菌的規模化栽培，將有助于豐富羊肚菌可栽培種質資源的多樣性。筆者采用形態學特征結合GCPSR，對可栽培羊肚菌進行鑒定，確定了其系統發育學地位，有利于我國黃色羊肚菌的人工馴化栽培和規模化推廣應用。

1 材料與方法

1.1 菌株培養

羊肚菌菌株的分離和培養采用CYM培養基（g·L-1）：葡萄糖20，蛋白胨2，酵母浸粉2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 0.46，K2HPO4 1，瓊脂20，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 材料

PCR擴增試劑盒和DNA分子質量標準 （100～2000 bp）由上海生工生物工程有限公司（上海生工）提供，ITS、EF1-α、RPB1和RPB2的擴增引物序列[11，14]見表1，由上海生工合成。

1.3 方法

1.3.1 標本的采集、記錄與組織分離 2024年4月13日，從洛陽大荒野生態農業有限公司上戈鎮生產基地采集馴化栽培出菇的福星2號、福星3號和福星5號羊肚菌子囊果樣品，描述新鮮標本的形態特征，記錄子囊果形態、菌蓋形態、顏色，菌蓋表面脊的排列、凹坑的形狀，菌柄的形態和顏色等形態特征。隨后將標本放在陰涼通風處風干，進行微觀特征測定與菌株分離。

微觀特征的測定：對成熟子囊果的菌蓋徒手切片，用15%的甘油封片后，在A1型倒置生物顯微鏡（德國徠卡公司，40×物鏡，DIC微分干涉效果）下觀察、拍照，記錄子囊、子囊孢子和支撐細胞的形態，并測量其大小。

組織分離：用解剖刀直接切取干燥子囊果的菌蓋組織塊接種短生長管（凈長度20 cm，內徑24 mm，管口凸起高度31 mm，管口凸起與生長管夾角120°）一端，25 ℃避光培養。當菌絲生長至生長管另一端時，取菌絲塊轉接新的CYM斜面，培養至菌絲滿管后4 ℃保存備用。福星2號、福星3號和福星5號3個品種的菌絲體分離物（菌株）分別編號為FX-2、FX-3和FX-5。

1.3.2 多基因系統發育分析 菌絲體加液氮充分研磨，取約0.5 g菌絲粉置1.5 mL離心管中，用700 μL CTAB提取緩沖液懸浮，65 ℃水浴20～30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，上清液加入700 μL氯仿-異戊醇（體積化24∶1）沉淀蛋白質2次，離心后，往上清液中加入等體積的無水異丙醇沉淀DNA，用70%和100%乙醇洗滌風干后重懸于100 μL無菌雙蒸水，-20 ℃儲存備用[19]。采用各自的特異性引物（表1）分別擴增ITS、EF1-α、RPB1 和RPB2 序列。PCR 擴增體系和擴增程序見參考文獻[11，20]。將擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送上海生工進行雙向測序，將序列提交基因庫，獲得基因號。

使用Geneious R6軟件編輯獲得的DNA序列，使用BLASTN進行同源性搜索[21]。下載NCBI數據庫中同源性大于99%的羊肚菌序列，并選取公開發表的可用于羊肚菌屬物種系統發育學分析的序列進行分析。對全部樣本序列和參考序列進行拼接處理[22]，采用BioEdit整理樣本和參考物種的單個基因序列。首先通過Clustal X 將序列對齊（采用系統默認設置參數），選擇保守區域。將最終序列整合成矩陣，并以fas格式保存。使用BioEdit Sequence Alignment Editor（5.09）在編輯模式下將ITS、EF1-α、RPB1和RPB2序列集合，按照“ITS + EF1-α + RPB1 + RPB2”的順序進行拼接，得到的新序列同樣以fas格式保存。最后，將拼接序列輸入MEGA11.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹，自舉值設置為1000。

2 結果與分析

2.1 子囊果宏觀和微觀形態

人工栽培的3個羊肚菌品種子囊果均單生或群生（圖1-A），菌蓋形狀和顏色受環境影響較大。3個品種的栽培子囊果顏色和形態相似，均中等偏小，高3.0～12 cm，近圓形、卵圓形、寶塔狀或近柱狀，高2.0～9.0 cm，最寬處2.0～6.5 cm。菌蓋表面縱脊明顯，縱橫脊交錯，成熟子囊果脊的顏色為淺黃色至淺灰色；凹坑形狀和大小不規則。菌柄基部不膨大、稍膨大至明顯膨大，白色至淺黃色，圓柱狀，中空；長2.0～3.5 cm，底部寬3.0～4.0 cm，上部寬1.5～2.5 cm。相比而言，FX-2栽培子囊果最小，菌柄基部鮮有膨大（圖1-B）；FX-3與FX-5子囊果大小相近，FX-3菌柄基部明顯膨大（圖1-C），FX-5子囊果菌柄基部稍膨大（圖1-D）。

顯微觀察表明，3份標本的微觀特征一致，八孢子囊，子囊長棒狀至近圓筒狀，基部足狀，大小（178.18～263.02） μm × （18.13～26.80） μm；子囊孢子橢圓形，透明無色，表面光滑，大小（19.82～26.20） μm × （11.95～15.49） μm，長寬比為1.64±0.14；側絲棒狀、近圓筒狀，無色、透明、有隔，大小為（61.96～103.26） μm × （8.75～12.46） μm；不育脊上剛毛棒狀，頂部收縮至細棒狀，大小在（65.52～115.42） μm × （13.65～31.64） μm（圖1-E～F）；3%的氫氧化鉀不顯色。子囊果的宏觀和微觀形態特征與黃色羊肚菌類群物種相一致。

2.2 系統發育分析

2.2.1 ITS、EF1-α、RPB1和RPB2的測序序列 3個菌株（FX-2、FX-3和FX-5）的4個特異性片段經PCR擴增后直接進行雙向測序。結果表明，ITS片段長度約為1100 bp，EF1-α基因片段長度為1100 bp左右，RPB1基因片段大小為750 bp左右，RPB2基因片段大小約為800 bp。DNA片段整理后進行在線BLASTN比對，顯示3個品種均屬于黃色羊肚菌支系。將12條樣本序列上傳至NCBI數據庫，授權每個基因的序列登錄號如表2所示。

2.2.2 多基因系統發育樹 以變紅羊肚菌（M. rufobrunnea） YAASMVR菌株為外群，對供試羊肚菌品種和羊肚菌屬的主要分支物種進行系統發育分析。所有樣本序列及參考序列經過對齊處理后，ITS 部分DNA序列保留870 bp，EF1-α、RPB1和RPB2部分基因序列分別保留800、610和650 bp，拼接后的全序列長度均為 2930 bp，采用MEGA 11構建了系統發育樹（圖2）。從圖2可以看出，3個馴化羊肚菌品種序列與其他黃色羊肚菌參考序列被聚類在一個大的分支上。FX-2、FX-3和FX-5與Mes-21 FCNU1082標本被聚類在一個小的分支上，支持率100%。結合子囊果宏觀和微觀形態特征，四基因GCPSR進一步證實FX-2、FX-3和FX-5屬于黃色羊肚菌支系的Mes-21系統發育學種。

3 討論與結論

在形態特征上，黃色羊肚菌支系種類子囊果的脊通常為淺黃褐色或赭黃色，成熟后顏色也不加深；脊的排列一般不規則。而黑色羊肚菌支系種類成熟時子囊果的脊通常為深棕色或黑色，脊縱向排列或平行排列，一般較規則[23]。本研究中3個品種馴化栽培羊肚菌表現出典型的黃色羊肚菌支系種類特征，表明其屬于黃色羊肚菌類群物種。

羊肚菌屬的多基因GCPSR分析最早由TA?KIN等[11]引進開發，基于核糖體LSU、EF1-α、RPB1和RPB2四個基因片段的聯合分析對地中海及愛琴海區域的62個羊肚菌標本進行了系統發育分析，識別了15個新的系統發育學種。隨后，O’DONNELL等[12]進一步采用多基因GCPSR對收集自北美和歐洲羊肚菌屬的177個標本進行了系統發育分析，提出羊肚菌屬由黃色羊肚菌支系和黑色羊肚菌支系兩個姊妹類群以及變紅羊肚菌支系一個基礎單系分支構成，記錄了變紅羊肚菌支系1個系統發育學種、黃色羊肚菌支系16個系統發育學種（Mes-1到Mes-16）及黑色羊肚菌支系24個系統發育學種（Mel-1到 Mel-24）。目前，黑色羊肚菌支系已經記錄了至少51個系統發育學種，對其中的36個進行了生物學特征描述[13，17，24-31]；黃色羊肚菌支系共記錄了36個系統發育學種，對其中的19個進行了詳細描述和命名[17，28，32-34]；而變紅羊肚菌支系共記錄和描述了2種羊肚菌：變紅羊肚菌和小紫羊肚菌（M. anatolica）[14，35]。至此，羊肚菌屬共計記錄了89個系統發育學種，其中57個物種被詳細地進行過形態描述，并給出了雙名法名稱。

美國20世紀末實現的羊肚菌室內栽培所使用的品種屬于變紅羊肚菌[12，36-38]。我國經過幾十年的持續探索，并借鑒美國羊肚菌工廠化栽培經驗，在發現和應用可栽培品種和成功實施外源營養袋技術的前提下，于2012年首先在川渝地區成功實施了羊肚菌商業化大田栽培[2]。我國羊肚菌大田栽培所使用的品種，主要來自自然發生的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌的野生馴化。該3個品種羊肚菌均屬于黑色羊肚菌支系，在生態上都是典型的火燒地品種[38-39]。除此以外，黑色羊肚菌支系的Mel-9、Mel-13、M. owneri和Mes-21也有報道可以栽培出菇[28，40-41]。然而，黃色羊肚菌雖有大田、林下和室內仿生馴化栽培嘗試[42-44]，但其穩定性的人工栽培至今沒被證實。相對于黑色羊肚菌主要發生于海拔1000～4000 m山區，野生黃色羊肚菌主要發生于北半球溫帶的平原地區和海拔1000 m以下山區，在水溝、堤壩、果園、茶園、地頭、路邊、草地、林地等生境均可發現它們的蹤跡，在火燒地鮮有發生[2，45]。筆者測定的3個黃色羊肚菌品種均分離自洛陽市淺山區林地發生的野生子囊果，經過多年持續人工馴化栽培獲得。3個品種大致上采取我國當前推廣的黑色羊肚菌大田栽培技術進行人工栽培，具體技術有待于申報知識產權保護。黃色羊肚菌人工栽培具有較大的商業化推廣應用潛力，有待于規模化推廣應用。

筆者采集了黃色羊肚菌馴化栽培基地的羊肚菌子囊果，經組織分離獲得菌絲體分離物，利用常規的形態學特征結合ITS、EF1-α、RPB1和RPB2四個片段的聯合序列分析，最終確認人工栽培的3個羊肚菌品種均屬于黃色羊肚菌支系，均為Mes-21系統發育學種。這是首次科學確認的黃色羊肚菌人工栽培種類，將有效推動我國黃色羊肚菌人工栽培技術的發展和規模化推廣應用，有利于我國羊肚菌產業的持續、穩定和長久發展。

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