紫山藥干腐病的病原鑒定

摘 " "要：為明確2023年在貴州省黔西南州興義市引起當地特色作物紫山藥干腐病的病原菌的分類地位，采用組織分離法和單孢純化法獲得培養特征一致的15個菌株。代表菌株SY2-2經柯氏驗證為病原物，結合形態學特征觀察及ITS與RPB2基因序列分析，構建系統進化樹，確定引起紫山藥干腐病的病原菌為產核青霉菌Penicillium sclerotigenum。該研究結果為貴州省紫山藥干腐病的科學防控奠定了理論基礎。

關鍵詞：紫山藥；干腐病；病原鑒定

中圖分類號：S632.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）02-129-05

Pathogen identification of dry rot of purple yam

XU Yuanliu1，2， HUANG Lei3， LIU Min3， YANG Jiawei2， BAI Qingrong1， YANG Chao3

（1. State Key Laboratory of Green Pesticides， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2. Xingyi Agricultural Technology Extension Center， Xingyi 562400， Guizhou， China; 3. Guizhou Jifeng Seed Industry Co.， Ltd， Xingyi 562400， Guizhou， China）

Abstract： To clarify the taxonomic status of the pathogen causing dry rot of purple yam in Xingyi city， Guizhou province in 2023， 15 strains with the same cultural characteristics were obtained by tissue isolation and single spore purification. The representative strain SY2-2 was confirmed as pathogen of the disease by Koch's test. Based on morphological characteristics and ITS and RPB2 sequence analysis， a phylogenetic tree was constructed. Penicillium sclerotigenum was identified as the pathogen causing the dry rot of purple yam. The results lay a theoretical foundation for the scientific control of dry rot of purple yam in Guizhou province.

Key words： Purple yam; Dry rot; Penicillium sclerotigenum; Pathogen identification

紫山藥（Dioscorea alata）又名紫蒔藥、紫淮山和紫參薯等，屬薯蕷科薯蕷屬參薯，屬于山藥的近緣植物，塊莖肉質呈紫紅色，富含黏液質、多糖、蛋白質、淀粉和礦物質元素，特別是花色苷含量較高，是山藥中的精品。花色苷也是迄今為止所發現的最強效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗衰老、抗癌與抗動脈硬化等功能，有較高的食用價值和藥用價值[1-2]。紫山藥原產于亞洲熱帶地區，在我國主要分布于南方的溫暖地帶，包括浙江、江蘇、廣東、廣西、福建、江西、云南和臺灣等地，在北方地區種植較少[3]。

紫山藥是藥食同源的植物，深受廣大消費者喜愛，隨著需求量的增多，種植面積不斷擴大，該特色產業對農民增收致富具有重要的現實意義。隨著紫山藥種植面積的增加，其病害發生種類和發生程度也隨之加重，嚴重制約著山藥產業的發展。山藥塊莖病害主要有根腐病（Fusarium chlamydosporum、Fusarium solani、Fusarium avenaceum、Fusarium oxysporum、Humicola fuscoatra、Pythium ultimum var. ultimum）[4-6]、干腐病（Penicillium sclerotigenum）、黑皮病Monilochaetes infascans、瘡痂病（Streptomyces spp.）、山藥細菌性軟腐病（Pseudomonas dioscoreae、Pantoea agglomerans）、根腐線蟲病（Pratylenchus spp.）和根結線蟲病（Meloidogyne spp.）[6]。山藥皮薄，在收獲、運輸、貯藏和銷售的過程中，易破皮或折斷造成傷口，大大增加了多種病原菌的侵染概率，干腐病的發生對山藥品質產生不利影響，造成巨大的經濟損失[7-8]。

2017年由貴州吉豐種業有限責任公司從廣西引進種植的紫玉淮山，經4 a（年）4代系統選育形成穩定品系，定名為紫山藥1號，2021年將紫山藥1號擴繁，2022年開始小面積種植，田間表現抗逆性強、適應范圍廣、產量高、效益顯著。2023年開始推廣種植，目前紫山藥在黔西南州興義市、晴隆縣、普安縣等地方均有種植。該品種植株蔓生，生長勢強，葉片呈闊卵圓形，苗期葉色紫色，后期青綠色，平均葉長14.2 cm、葉寬8.5 cm；薯形長棒形，平均單薯長86 cm、橫徑6.2 cm，平均單薯質量1.4 kg；薯皮紫紅色、肉質粉紫色。種子呈扁卵圓形、紡錘形等，表皮暗褐色，種子肉質深紫色；生育期260～300 d。在紫山藥的種植過程中葉部零星發生炭疽病，尚未發現影響生產的地上部病害。2023年1月在貴州省黔西南州興義市紫山藥貯藏期間發現有5%～10%紫山藥腐爛壞死，罹病部位呈深褐色，部分山藥罹病部位長有青色霉層，罹病薯塊不能食用，嚴重影響山藥的品質和商品價值。為明確引起該病害的病原菌的分類地位，筆者對罹病紫山藥進行病原菌的分離與純化、致病性測定、形態特征觀察及分子生物學鑒定，以期為研究該病害的發生規律及防治方法奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2023年1月至2024年3月在貴州大學綠色農藥全國重點實驗室完成。病害來源于貴州省黔西南州興義市送檢的紫山藥干腐病樣品。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 " "病原菌的分離與純化 " "采用組織分離法對2次送檢的15個罹病紫山藥發病組織塊進行病原菌分離，先用滅菌刀切去病部外表皮，再用無菌鑷子從發病變色部位夾取少量組織塊，置于75%乙醇溶液中浸泡消毒60 s，無菌水清洗3次。將消毒的組織塊放到盛有吸水紙的培養皿中，在無菌操作臺中風干2 h后，移至PDA培養基上，25 ℃恒溫培養。待組織塊邊緣長出菌絲后，用無菌接種鏟在菌落邊緣鏟起3 mm×3 mm菌塊，放入PDA培養基中進行純化培養。待培養2～3 d后，將長出的真菌菌落挑取邊緣菌絲至新的PDA培養基上，待病菌產孢后，挑取單個孢子進行純化[9]，將純化后的純培養物保存備用。第一次送檢樣品分離得到6個分離物，記為SY1-1～SY1-6，第二次送檢樣品分離得到9個分離物，記為SY2-1～SY2-9。

1.2.2 " "分離物致病性測定 " "選取新鮮健康的紫山藥塊莖，使用75%的乙醇表面消毒，待乙醇自然風干后使用無菌刀將山藥切段。代表菌株SY2-2培養7 d后用無菌水制成濃度為1×106 個·mL-1孢子懸浮液，均勻噴在整個山藥塊莖表面及兩側切口。以噴灑無菌水為對照，每個處理3次重復，觀察并記錄發病情況。

待山藥塊莖明顯發病后采用1.2.1的方法進行病原菌的分離，觀察其菌落和分生孢子的形態與接種菌株是否一致，若一致則證明該接種菌株為紫山藥干腐病的病原菌。

1.2.3 " "病菌形態特征觀察 " "觀察病原菌在PDA培養基上的菌落形態、顏色及生長狀況。使用BA210-T生物顯微鏡觀察病原菌在PDA培養基上的分生孢子及產孢結構的形態特征并拍照，使用VHX-7000超景深顯微鏡（KEYENCE）測量病原菌的100個分生孢子大小。參照相關參考文獻[10]，初步確認病菌的分類地位。

1.2.4 " "分子生物學鑒定 " "按照真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取新鮮菌絲的DNA并進行PCR擴增。選擇引物ITS1/ITS4對核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacer， rDNA-ITS）[11]和RPB2-5F/RPB2-7cR對RNA聚合酶II第二大亞基（second largest subunit of RNA polymerase II， RPB2）[12]進行PCR擴增，擴增反應體系25 μL：Taq mixture 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，委托生工生物工程（上海）有限公司測序。

將所得的序列與GenBank核酸數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中的相關序列進行一致性比較。利用Phylosuite 1.2.2軟件進行序列的比對與拼接，再手動對結果進行校正，通過MEGA 7.0軟件對代表性菌株進行系統發育分析，通過最大似然法（maximum likelihood，ML）構建多基因聯合系統發育樹對其分類地位進行確認。

2 結果與分析

2.1 發病癥狀與分離結果

該病害多從傷口侵入，向內擴展，患病部位變褐，腐爛壞死，嚴重部位表面密生綠色霉層。干燥條件下病原菌侵入速度慢，壞死部位呈干腐狀，病斑形狀不規則，病健交界明顯（圖1）。

通過對紫山藥根莖發病組織的病原菌進行分離與純化，共獲得15株純培養物，菌落形態基本一致（圖2）。在PDA培養基上菌落近圓形，正面有綠色霉層，背面白色，散射狀生長，致密，有輪紋。

2.2 分離物的致病性測定

隨機選取代表菌株SY2-2進行接種。3 d后在山藥根莖橫切面即可長出霉狀物，7 d后病部密生灰綠色霉層，傷口部位變褐壞死，沿著傷口處縱切，山藥表皮下組織腐爛成深褐色（圖3-C～D），對照組山藥無明顯發病癥狀（圖3-A～B）。采用組織分離法對接種山藥發病部位進行再分離，發現分離物與接種菌株的菌落形態及孢子形態一致，確認接種菌為紫山藥干腐病的病原菌。

2.3 病原菌的形態學鑒定

菌株SY2-2于PDA培養基上25 ℃恒溫培養，生長初期菌絲呈絨毛狀、白色，后期正面菌絲為綠色，邊緣呈黃白色。分生孢子梗經過多次分枝，產生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，其上有2～3個分生孢子，分生孢子橢圓形或球形，長2.42～4.56 μm，寬2.32～4.01 μm，分生孢子平均大小為3.82 μm×3.11 μm（圖4）。參考《真菌鑒定手冊》[10]，初步將菌株SY2-2鑒定為青霉菌屬Penicilliumi spp.。

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

對菌株SY2-2的基因組DNA進行ITS和RPB2基因的PCR擴增，分別獲得長度為566 bp和982 bp的序列。以Penicillium herquei為外群通過多基因聯合構建的系統發育樹（圖5）結果可知，SY2-2與Penicillium sclerotigenum聚在一枝上，且支持率為100%。結合形態學鑒定，將紫山藥干腐病病原菌鑒定為產核青霉菌Penicillium sclerotigenum。

3 討論與結論

由P. sclerotigenum引起的薯蕷干腐病在尼日利亞、印度、日本等多個國家已有報道，是薯蕷采后病害的病原菌之一[13-15]。晏衛紅等[7]于2007年在國內首次報道P. sclerotigenum侵染薯蕷引起干腐病在廣西桂平縣金田鎮的發生和危害。筆者將貴州省興義市送檢的紫山藥病害的病原菌鑒定為產核青霉菌P. sclerotigenum，與姚甜甜[8]報道的山藥青霉腐爛病及日本報道的山藥藍霉病病原中的一種病菌一致[16]。因病害發生后，癥狀主要表現為干腐，因此筆者確定該病害為紫山藥干腐病。產核青霉菌P. sclerotigenum除了能引起山藥腐爛病外，還能引起栗仁、蘋果和梨等果樹的腐爛病[17-18]。

山藥塊莖表面的外皮具有保護作用，病原物很難穿透外皮進入山藥內部，但是山藥塊莖在采收貯運的過程中很容易損傷，出現傷口，而產核青霉菌多數通過傷口進行侵染。霍佳歡等[17]通過對P. sclerotigenum的不同培養條件的研究，結果表明，產核青霉菌菌絲生長和產孢的溫度為25 ℃，建議將山藥置于低溫環境下貯藏。Plumbley等[19]報道了用苯菌靈、抑霉唑兩種藥劑處理薯蕷可以抑制或減少貯藏期由P. sclerotigenum引起的塊莖腐爛。姚甜甜[8]研究表明，戊唑醇1000～2000倍液、嘧菌酯200～400倍液、咪鮮胺200～300倍液、氟硅唑2000～4000倍液、抑霉唑硫酸鹽200～500倍液、苯醚甲環唑200～400倍液、丙環唑100～400倍液對防治山藥青霉腐爛病效果最好，其中在室內接種測定和冷庫試驗的防治效果均為100%，并建議在山藥種莖貯藏期采用上述藥劑對該病害進行防控；該研究還對石灰與黏土的9種不同配比對青霉菌的抑制活性和冷庫貯藏效果進行篩選評價，發現熟石灰和深層黏土按照體積比2∶5 處理山藥切口的效果最好。

筆者通過對貴州省黔西南州興義市發生的紫山藥干腐病病菌的分離純化、致病性測定、形態學和分子生物學鑒定，將該病害的病原菌鑒定為產核青霉菌P. sclerotigenum。

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