嗜根考克氏菌與植物乳植桿菌復(fù)合發(fā)酵對香腸品質(zhì)及細(xì)菌群落的影響

摘 要：以嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila）AP1和植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）L復(fù)配接種發(fā)酵香腸，以自然發(fā)酵香腸為空白對照，通過測定發(fā)酵香腸的pH值、水分含量、水分活度、亞硝酸鹽含量、質(zhì)構(gòu)特性、色差、游離氨基酸含量及活菌數(shù)等指標(biāo)，探究嗜根考克氏菌AP1和植物乳植桿菌L復(fù)合發(fā)酵對香腸品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：接種發(fā)酵劑后，pH值、亞硝酸鹽含量顯著降低（P＜0.05），具有較高的安全性；提高了香腸的硬度和咀嚼性、提升了亮度和色澤，促進了發(fā)酵香腸游離氨基酸的釋放，提升了香腸的感官品質(zhì)；接種處理增強了優(yōu)勢菌的競爭力，抑制了有害菌的生長，嗜根考克氏菌AP1與多數(shù)游離氨基酸產(chǎn)量呈正相關(guān)。因此，考克氏菌與乳酸菌復(fù)配發(fā)酵可提升香腸品質(zhì)和安全性。

關(guān)鍵詞：嗜根考克氏菌；植物乳植桿菌；發(fā)酵香腸；細(xì)菌多樣性；游離氨基酸；理化特性；感官品質(zhì)

Effects of Co-fermentation with Kocuria rhizophila and Lactiplantibacillus plantarum on Sausage Quality and Bacterial Community

CHEN Junfei1， SHEN Hui1， ZHANG Keming2， TANG Huihua1， HU Yongjin2， XIAO Hua3， LI Hong2， LIU Biqin1，*， SHI Qiao1，*

（1. Institute of Agro-product Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650223， China;

2. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

3. Yunnan Xiwang Shuangsheng Supply Chain Group Co. Ltd.， Kunming 650223， China）

Abstract： In this study， a combination of Kocuria rhizophila AP1 and Lactiplantibacillus plantarum L was used as a starter culture for fermented sausages， and naturally fermented sausages were used as blank controls. The effects of co-fermentation with K. rhizophila AP1 and L. plantarum L on sausage quality were explored by measuring the pH value， moisture content， water activity， residual nitrite， texture， color difference， free amino acid content， and viable bacterial count. The results showed that after inoculation of the starter culture， the pH value， and nitrite content were significantly reduced （P lt; 0.05）， indicating high safety; the hardness and chewiness were improved as well as the brightness and color， and the release of free amino acids from fermented sausages was promoted， thus improving its sensory quality. Moreover， the inoculation treatment enhanced the competitiveness of dominant bacteria and inhibited the growth of harmful bacteria. K. rhizophila AP1 was positively correlated with the production of most free amino acids. Therefore， co-fermentation with Kocuria and lactic acid bacteria can improve the quality and safety of sausages.

Keywords： Kocuria rhizophila; Lactiplantibacillus plantarum; fermented sausages; bacterial diversity; free amino acids; physicochemical properties; sensory quality

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240914-243

中圖分類號：TS251.5" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2025）02-0001-10

引文格式：

陳駿飛， 申揮， 張珂銘， 等. 嗜根考克氏菌與植物乳植桿菌復(fù)合發(fā)酵對香腸品質(zhì)及細(xì)菌群落的影響[J]. 肉類研究， 2025， 39（2）： 1-10. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240914-243." " http：//www.rlyj.net.cn

CHEN Junfei， SHEN Hui， ZHANG Keming， et al. Effects of co-fermentation with Kocuria rhizophila and Lactiplantibacillus plantarum on sausage quality and bacterial community[J]. Meat Research， 2025， 39（2）： 1-10. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240914-243." " http：//www.rlyj.net.cn

目前，發(fā)酵香腸中常用的發(fā)酵劑有乳酸菌和凝固酶陰性球菌（coagulase-negative cocci，CNC），其中，CNC主要包括凝固酶陰性葡萄球菌（Staphylococcus spp.）和考克氏菌（Kocuria spp.）[1]。研究[2]表明，以植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）為代表的乳酸菌能通過糖酵解產(chǎn)生有機酸，有利于產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生和保證產(chǎn)品的安全性。CNC具有蛋白酶和脂肪酶活性，促進風(fēng)味形成，還具有硝酸鹽還原酶活性，能促進肉制品發(fā)色，具有過氧化氫酶活性，能緩解脂質(zhì)氧化[3]。

發(fā)酵劑不僅可以提高發(fā)酵食品的感官特性，而且可以提升食品安全性和商品標(biāo)準(zhǔn)化。肉類發(fā)酵劑主要是由乳酸菌和CNC進行復(fù)配[4]，利用兩者間的協(xié)同作用改善發(fā)酵肉品質(zhì)，能彌補單一菌種的局限性[3]。考克氏菌是食品發(fā)酵功能性CNC的重要成員，共26 個種[5]，廣泛存在于乳制品[6]、海鮮[7]和發(fā)酵肉制品[8]中。變異考克氏菌（Kocuria varians）是肉制品中報道最多的考克氏菌，可以改善發(fā)酵肉類的感官特征并減少生物胺的產(chǎn)生[9]。研究[10-11]表明，變異考克氏菌和清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）及嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）復(fù)配均可顯著提高火腿中氨基酸含量并改善感官特性，和植物乳植桿菌復(fù)配可顯著改善臘腸的顏色，減少生物胺生成[9]。嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila）常見于發(fā)酵乳肉制品中，且對發(fā)酵肉制品風(fēng)味發(fā)揮積極作用[12-13]，

然而，目前關(guān)于該菌接種發(fā)酵香腸的研究嚴(yán)重不足，尚無嗜根考克氏菌作為輔助發(fā)酵劑發(fā)酵肉品的報道。目前，國內(nèi)對CNC的研究僅限于凝固酶陰性葡萄球菌，2022年8月25日，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》中的CNC菌株僅有3 種（小牛動物球菌（Mammaliicoccus vitulinus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）），對考克氏菌的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于歐美等西方國家，因此開展以考克氏菌為代表的新型發(fā)酵劑研究有利于挖掘并利用本土菌種資源、彌補國內(nèi)該領(lǐng)域的空白、豐富肉類發(fā)酵菌劑種類。

本課題組前期從傳統(tǒng)發(fā)酵諾鄧火腿中分離出具有蛋白水解活性和硝酸還原酶活性、能改善發(fā)酵肉制品色澤、增強風(fēng)味且安全的嗜根考克氏菌株[13]，接種于發(fā)酵肉中能顯著提高發(fā)酵肉的紅度值（a*），改善發(fā)酵肉制品的色澤和整體風(fēng)味[1]。本課題組前期通過發(fā)酵性能實驗，從發(fā)酵肉制品中篩選得到低溫生長性能好的植物乳植桿菌L和嗜根考克氏菌AP1，并設(shè)置不同比例進行復(fù)配（植物乳植桿菌L、嗜根考克氏菌AP1的體積比分別為3∶1、1∶1、1∶3），發(fā)現(xiàn)植物乳植桿菌L、嗜根考克氏菌AP1體積比為1∶1時，2 種菌長勢較好且不會因微生物產(chǎn)酸過多導(dǎo)致香腸口感變差。在此基礎(chǔ)上，本課題組將2 種菌株進行復(fù)配制成發(fā)酵菌劑，以自然發(fā)酵為對照，初步探究復(fù)配菌劑對發(fā)酵香腸品質(zhì)和菌群的影響，為開發(fā)香腸專用菌劑提供一種新參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生豬肉采自云南昆明本地市場三元豬后腿肉。所用菌株植物乳植桿菌L和嗜根考克氏菌AP1均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室保藏，來源于云南本地火腿樣品，于－80 ℃保存。

亞鐵氰化鉀、氯化鈉、鹽酸、乙酸鋅、酚酞、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；膠原蛋白腸衣

廣西神冠膠原生物集團有限公司；食鹽 云南省鹽業(yè)有限公司；葡萄糖（食品級） 河南萬邦實業(yè)有限公司；黑胡椒 上海味好美食品有限公司；單山蘸水 昆明市單山食品有限公司；復(fù)合磷酸鹽（食品級） 徐州添安食品添加劑有限公司；亞硝酸鈉（食品級） 天津市

盛鑫源化工有限公司；DP812 DNA提取試劑盒 天根

生化科技（北京）有限公司；Agencourt AMPure XP Beads試劑盒 Accelerating answers生命有限公司；Qubi dsDNA HS Assay試劑盒 美國賽默飛世爾科技公司；建庫試劑盒（SMRTbell prep kit 3.0） 美國Pacific Biosciences公司。

MRS培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol salt agar，MSA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（nutritional broth，NB）培養(yǎng)基、肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基均于118 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TMS-Touch質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司；EXceed-ad-50純水機 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；DW-86L626超低溫冰箱（－80 ℃） 海爾智家股份有限公司；CM-5臺式色差儀 日本柯尼卡-美能達公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；HR/T20MM冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；DL-CJ-2NDI超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YXQ-75SL高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；JA3003C電子天平 濟南歐萊博電子商務(wù)有限公司；WPL-125BE電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特設(shè)備有限公司；S210 pH計 梅特勒-托利多科技（中國）有限公司；HHWS-111-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌株的活化與制備

將植物乳植桿菌L、嗜根考克氏菌AP1分別接種至MRS和NB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件均為37 ℃、18 h，菌株活化培養(yǎng)2 次后，在6 399×g、4 ℃條件下離心10 min，去除上清液，用無菌生理鹽水洗滌沉淀2 次，備用。

1.3.2 發(fā)酵香腸的制作

發(fā)酵香腸的制作參考鞏洋[14]的工藝并稍作修改。

配方：選擇飼養(yǎng)1 年后出欄的外三元母豬當(dāng)天屠宰的新鮮后腿肉為原料，將后腿豬肉（肥瘦肉質(zhì)量比2∶8）絞碎后，每1.00 kg肉中添加輔料：食鹽20.00 g、葡萄糖10.00 g、亞硝酸鈉0.10 g、復(fù)合磷酸鹽0.03 g、單山蘸水10.00 g、黑胡椒粉10.00 g。其中，復(fù)合磷酸鹽為商業(yè)產(chǎn)品，其主要成分如下：三聚磷酸鈉24%、焦磷酸鈉21%、六偏磷酸鈉14%、磷酸三鈉4%、聚磷酸二氫二鈉3%、磷酸鈉7%、磷酸銨鈉8%、氯化鉀3%、食用鹽15%、食用葡萄糖1%（m/m）。接菌組的菌種總接種量為2%（以鮮肉質(zhì)量計），確保最終在香腸中的總活菌數(shù)達到107 CFU/g。

工藝流程：原料肉→漂洗→絞肉→攪拌（發(fā)酵劑、輔料）→灌腸→發(fā)酵→成熟。

發(fā)酵條件：發(fā)酵初期（0～1 d）：溫度20 ℃，相對濕度75%；發(fā)酵中期（2～3 d）：溫度13 ℃，相對濕度60%；發(fā)酵后期（4～5 d）：溫度11 ℃，相對濕度60%。

處理組：分為AP1L和CK 2 組。CK組：不接種發(fā)酵劑的空白對照組；AP1L組：植物乳植桿菌L、嗜根考克氏菌AP1共同接種（體積比為1∶1），總接種量為2%（以鮮肉質(zhì)量計）。接種菌液濃度：植物乳植桿菌1.3×109 CFU/mL、嗜根考克氏菌2.1×109 CFU/mL。

1.3.3 pH值測定

按照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[15]進行測定。

1.3.4 水分含量測定

按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》[16]中的直接干燥法進行測定。

1.3.5 水分活度測定

按照GB 5009.238—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品水分活度的測定》[17]中的水分活度儀擴散法進行測定。

1.3.6 亞硝酸鹽含量測定

按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定》[18]中的分光光度法進行測定。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.004x＋0.044 9（R2＝0.999 0）。

1.3.7 色差測定

參考范鑫洋等[19]的方法并稍作修改，剝?nèi)ツc衣，將香腸攪碎壓成直徑約為2 cm、厚度約為1 cm的薄片，選取6 個不同位置測定樣品的亮度值（L*）、a*、黃度值（b*）。色差儀使用標(biāo)準(zhǔn)板Y＝94.0、X＝0.315 6、y＝0.332 1校正，并引入色度值（C），按式（1）計算：

（1）

1.3.8 質(zhì)構(gòu)特性測定

參考王寧寧等[20]的方法并稍作修改，剝?nèi)ツc衣后，將香腸切成邊長1 cm的正方體，使用質(zhì)構(gòu)儀通過質(zhì)地剖面分析模式測定樣品硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性。測試條件：圓盤直徑7.5 cm，探頭P/36R，最大力500 N，起始力0.75 N，試樣受壓形變75%，探頭回升高度15 mm，檢測速率120 mm/min。

1.3.9 感官評定

選擇12 名經(jīng)驗豐富的發(fā)酵肉類產(chǎn)品研發(fā)人員，對蒸煮后的發(fā)酵香腸外觀、色澤、風(fēng)味、口感和組織狀態(tài)5 個方面進行感官評分，并在去除最高分與最低分后計算平均分，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表1[21]。

1.3.10 氨基酸測定及營養(yǎng)價值評價

1.3.10.1 氨基酸的測定

按照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》[22]進行測定。

1.3.10.2 氨基酸呈味效果評價

滋味活性值（taste activity value，TAV）為樣品中呈味物質(zhì)含量與其閾值的比值，當(dāng)TAV＞1時，認(rèn)為該物質(zhì)對樣品滋味有貢獻，且數(shù)值越大，貢獻越顯著；TAV＜1時，認(rèn)為該物質(zhì)對呈味貢獻較小，由此確定主要呈味氨基酸。TAV按式（2）計算：

（2）

式中：C1為物質(zhì)在樣品中的含量/（mg/g）；C2為該物質(zhì)呈味閾值/（mg/g）。

1.3.11 細(xì)菌群落測定

1.3.11.1 活菌數(shù)測定

將植物乳植桿菌L稀釋涂布于MRS固體培養(yǎng)基上進行菌落計數(shù)（培養(yǎng)條件：37 ℃、2 d）；嗜根考克氏菌AP1稀釋涂布于MSA固體培養(yǎng)基上進行菌落計數(shù)（培養(yǎng)條件：30 ℃、2 d）。

1.3.11.2 細(xì)菌多樣性測定

使用TGuide S96磁珠法DNA提取試劑盒提取各樣品的總DNA，檢測DNA濃度、純度和提取質(zhì)量。所用細(xì)菌16S rRNA引物為通用引物27F（5’-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3’）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物使用1.8%瓊脂糖凝膠回收，用Agencourt AMPure XP Beads試劑盒進行回收產(chǎn)物純化，并使用Qubit dsDNA HS Assay試劑盒進行定量。單個量化后將等量產(chǎn)物合并，通過建庫試劑盒制備SMRTbell文庫并進行測序。PCR擴增、PCR產(chǎn)物混合、純化、文庫構(gòu)建及上機測序流程均由北京百邁客生物科技有限公司完成。

使用Trimmomatic軟件（version 0.33）進行原始數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾，使用Cutadapt軟件（version 1.9.1）進行引物序列的識別與去除，然后使用USEARCH軟件（version 10）

對雙端reads進行拼接并去除嵌合體（UCHIME軟件，version 8.1）。對原始下機數(shù)據(jù)subreads文件進行校正得到CCS（circular consensus sequencing）序列（SMRT Link軟件，version 8.0），然后使用Lima軟件（version 1.7.0）對CCS序列進行Barcode識別、長度過濾、去除嵌合體，得到有效CCS序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌群落多樣性及物種差異分析等一系列統(tǒng)計學(xué)及可視化分析均在百邁客云平臺BMKCloud （www.biocloud.net）上完成。其他實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用IBM SPSS Statistics 26軟件進行單因素方差分析，然后利用沃勒-鄧肯方法分析數(shù)據(jù)的顯著性，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異；使用Graphpad Prism 8.2.1軟件進行計算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株對香腸常規(guī)理化性質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵過程的進行，2 組香腸的pH值均呈現(xiàn)先下降后維持的趨勢，發(fā)酵開始時（0 d），AP1L組和CK組之間的pH值差異不顯著；發(fā)酵結(jié)束時，AP1L組的pH值明顯低于CK組。AP1L組在發(fā)酵初期，pH值迅速降至最低值（5.85）；隨后pH值略有上升，與馮美琴等[23]對復(fù)配植物乳植桿菌與模仿葡萄球菌混合發(fā)酵香腸的研究結(jié)果一致，這是由于菌株能產(chǎn)生有機酸，使香腸的pH值迅速下降，隨著發(fā)酵的進行，微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生一些游離氨基酸、胺、氨等堿性物質(zhì)，使發(fā)酵香腸的pH值上升[24]。

大寫字母不同表示同一處理、不同發(fā)酵時間之間差異顯著（P＜0.05）；小寫字母不同表示同一發(fā)酵時間、不同處理之間差異顯著（P＜0.05）。圖2～3、5同。

較低的水分含量是確保發(fā)酵香腸保質(zhì)期和安全性的關(guān)鍵，隨著發(fā)酵的進行，2 組香腸水分含量和水分活度均顯著降低（P＜0.05），這可能是由于發(fā)酵過程中的水分蒸發(fā)[24-26]，其中，AP1L組的水分含量和水分活度較低，除發(fā)酵過程中水分蒸發(fā)外，還因乳酸菌增殖導(dǎo)致酸的產(chǎn)生和pH值的降低，導(dǎo)致肌肉蛋白變性、肌束收縮和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的水分流失[27]。此外，發(fā)酵香腸在制作過程中，隨著時間的延長，水分含量整體呈下降趨勢，尤其是在發(fā)酵2 d后2 組香腸水分含量迅速降低且顯著低于發(fā)酵0 d（P＜0.05），可能是由于腸衣直徑小，水分流失快[25]。接菌發(fā)酵可以降低香腸的水分含量和水分活度，從而抑制在發(fā)酵過程中的有害菌生長，為延長香腸的保質(zhì)期提供了可能性。

隨著發(fā)酵過程的進行，香腸亞硝酸鹽含量呈下降趨勢，發(fā)酵結(jié)束時，香腸樣品的亞硝酸鹽含量均遠(yuǎn)低于GB 2760—2024《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[28]中規(guī)定的亞硝酸鹽殘留量上限30 mg/kg，且發(fā)酵5 d時，AP1L組的亞硝酸鹽含量為5.51 mg/kg，顯著低于CK組（10.00 mg/kg，P＜0.05），說明接種植物乳植桿菌和嗜根考克氏菌有利于亞硝酸鹽的降解。

2.2 發(fā)酵菌株對香腸顏色的影響

由圖2可知，接種發(fā)酵對發(fā)酵香腸色差值有一定的影響，其中，香腸L*均呈降低趨勢，這與植物乳植桿菌與其他CNC復(fù)配發(fā)酵香腸的變化一致[12，22]，可能是由于在發(fā)酵過程中水分含量減少，導(dǎo)致香腸的L*減小[29]；香腸a*、b*均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，這與植物乳植桿菌與其他CNC復(fù)配發(fā)酵香腸的變化一致[7，22]；香腸C總體略有降低趨勢，發(fā)酵結(jié)束時，AP1L組的L*和C均顯著高于CK組（P＜0.05）；b*顯著低于CK組（P＜0.05），表明接種復(fù)合發(fā)酵菌株有助于香腸形成良好的色澤，可能由于CNC具有發(fā)色功能，同時低pH值促進亞硝基肌紅蛋白生成[30]。

2.3 發(fā)酵菌株對香腸質(zhì)構(gòu)特性的影響

由圖3可知，在發(fā)酵過程中，各組香腸的硬度、咀嚼性均有不同程度的上升，彈性變化不明顯，內(nèi)聚性呈下降趨勢。發(fā)酵結(jié)束時，AP1L組的硬度和咀嚼性均顯著高于CK組（P＜0.05），表明接菌能顯著提高香腸的硬度和咀嚼性，可能的原因為香腸水分含量減少，從而使香腸的結(jié)構(gòu)更致密[29]；在發(fā)酵過程中，pH值的降低導(dǎo)致蛋白質(zhì)的展開和疏水性基團的暴露，促進疏水相互作用[31]，并削弱蛋白質(zhì)與水之間的相互作用。隨著酸化程度的增加，疏水相互作用可能在接種香腸的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中起主導(dǎo)作用，蛋白質(zhì)分子通過疏水相互作用順序連接形成彈性凝膠，增強了香腸的彈性和凝聚力[32]。

2.4 香腸感官評價

感官特性在決定最終產(chǎn)品的可接受性方面是至關(guān)重要的。香腸的感官特性容易受到發(fā)酵過程中pH值、水分含量和蛋白質(zhì)水解變化的影響[33]。如圖4所示，通過感官對發(fā)酵香腸的外觀、色澤、風(fēng)味、口感和組織狀態(tài)進行評價，發(fā)現(xiàn)AP1L組均優(yōu)于CK組，其中，AP1L色澤好可能是由于菌種組合具有較好的發(fā)色作用[1]；口感好可能是由于其水分含量低且菌劑的加入增強了香腸的彈性和凝聚力；風(fēng)味好可能是由于復(fù)合菌株組合通過蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分解代謝產(chǎn)生游離氨基酸、醛、酮、酯類等風(fēng)味化合物，有利于改善香腸的風(fēng)味[34]，且復(fù)配后不會導(dǎo)致過酸，影響口感。

2.5 發(fā)酵菌株對香腸游離氨基酸的影響

游離氨基酸來源于肉類內(nèi)源性酶和微生物蛋白水解酶對肌肉蛋白的降解，在發(fā)酵肉制品的風(fēng)味形成中起著重要作用[1]。為進一步研究復(fù)合菌株在發(fā)酵香腸感官特性和營養(yǎng)價值中起到的作用，對發(fā)酵成熟的CK組和AP1L組進行氨基酸測定。如表2所示，發(fā)酵香腸中共檢測出17 種氨基酸，其中必需氨基酸8 種，且經(jīng)過發(fā)酵后，AP1L組中11 種氨基酸和總氨基酸含量均顯著高于CK組（P＜0.05），這與植物乳植桿菌與CNC復(fù)配發(fā)酵香腸的報道[23，29]相似。AP1L組的氨基酸總含量為289.21 mg/g，顯著高于CK組（P＜0.05）。氨基酸總含量的增加可能與乳桿菌和CNC的蛋白水解活性有關(guān)[35]，說明菌劑具有較高的蛋白酶活性。

游離氨基酸按照呈味特性可分為鮮味、甜味和苦味三大類[1]。經(jīng)接菌發(fā)酵后，香腸中大部分的鮮、甜、苦味氨基酸含量均顯著升高（P＜0.05），其中，含量最高的是谷氨酸，其次是賴氨酸、絲氨酸和丙氨酸。AP1L組中除蘇氨酸（甜味）、脯氨酸（甜味）、精氨酸（苦味）、酪氨酸（苦味）和苯丙氨酸（苦味）外，其余11 種呈味氨基酸均顯著高于自然發(fā)酵的CK組（P＜0.05）。

天冬氨酸和谷氨酸具有鮮味，這可能有助于香腸的整體味道[1]。AP1L組的天冬氨酸含量（7.32 mg/g）顯著高于CK組（1.25 mg/g；P＜0.05），表明接種菌株可能在增強香腸鮮味方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用；AP1L組的谷氨酸含量（84.33 mg/g）顯著高于CK組（15.19 mg/g，P＜0.05），有助于鮮味的表達。AP1L組的精氨酸含量顯著低于CK組（P＜0.05），表明接種菌株可以降低苦味氨基酸的含量。此外，某些支鏈氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，可以轉(zhuǎn)化為甲基支醇、醛和酸，從而形成干香腸的獨特風(fēng)味[10]。

香腸經(jīng)過發(fā)酵處理后，絕大多數(shù)氨基酸對香腸的滋味形成做出了貢獻（TAV＞1），AP1L組中15 種氨基酸對滋味形成均有貢獻，其中，谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、纈氨酸、組氨酸和蛋氨酸對香腸滋味的貢獻較大；CK組中對滋味貢獻較大的是谷氨酸、精氨酸。研究[36-37]表明，含有植物乳植桿菌的發(fā)酵劑可以利用纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸分別生成在腌制肉制品中產(chǎn)生成熟香氣的2-甲基丙醛、3-甲基丁醛和2-甲基丁醛。乳酸菌具有通過轉(zhuǎn)氨酶活性將纈氨酸和亮氨酸轉(zhuǎn)化為各自的α-酮酸的能力，而α-酮酸可形成多種產(chǎn)香化合物，從而賦予發(fā)酵香腸特征風(fēng)味[27]。因此，接菌發(fā)酵可促進呈味氨基酸的釋放，影響發(fā)酵香腸的風(fēng)味和口感。氨基酸除本身呈味外，部分還可作為風(fēng)味化合物的前體，進一步轉(zhuǎn)化為更多的揮發(fā)性風(fēng)味成分，從而增強發(fā)酵香腸的風(fēng)味。

2.6 發(fā)酵過程中的細(xì)菌演化

2.6.1 乳酸菌、CNC的活菌數(shù)分析

由圖5可知，發(fā)酵過程中接菌組的乳酸菌數(shù)顯著高于CK組（P＜0.05），說明植物乳植桿菌的接種可使乳酸菌在香腸中迅速成為優(yōu)勢菌。AP1L組發(fā)酵前期（0～2 d），乳酸菌菌落總數(shù)顯著上升至7.60（lg（CFU/g））（P＜0.05），對抑制發(fā)酵香腸內(nèi)不良微生物的生長繁殖具有積極作用。AP1L組的CNC菌落數(shù)均顯著高于CK組（P＜0.05），且在整個發(fā)酵過程中CNC數(shù)量維持在較高水平；在發(fā)酵后期略有降低，一方面可能是由于CNC活性受到營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝產(chǎn)物積累、水分流失等不利因素影響；另一方面可能是由于植物乳植桿菌具有較強的競爭能力，產(chǎn)生的乳酸抑制了其他微生物的生長[38]。CK組中能檢測出少量的乳酸菌和CNC，這可能是由于鮮肉中含有微球菌、葡萄球菌和乳酸菌等多種細(xì)菌。

2.6.2 微生物多樣性分析

2.6.2.1 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計和細(xì)菌α多樣性分析

對原始測序數(shù)據(jù)進行雙端剪接、質(zhì)量控制和去除嵌合體，共得到211 702 條CCS序列，平均序列長度為1 479 bp。共獲分類注釋14 門、20 綱、60 目、112 科、204 屬、279 種。與自然發(fā)酵香腸[39]相比，發(fā)酵劑明顯降低了發(fā)酵香腸中細(xì)菌群落的多樣性，這與Xiao Yaqing等[40]的研究結(jié)果一致。

由圖6可知，樣品稀釋曲線趨于平緩，樣品序列充分，樣品中已包含絕大多數(shù)細(xì)菌物種信息。等級豐度曲線在橫軸上的范圍較大，在垂直方向漸進平緩，表明所測樣品中物種豐富度較高且分布均勻。根據(jù)97%相似性水平下的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）信息，采用α多樣性指標(biāo)中的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示樣品中細(xì)菌的多樣性和豐富度。由表3可知，發(fā)酵0 d樣品的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最高，說明發(fā)酵0 d時，細(xì)菌物種多樣性和豐富度最高。各樣品的覆蓋率均為1，表明測序結(jié)果可以代表樣品中微生物的真實情況。

2.6.2.2 接種發(fā)酵香腸過程中細(xì)菌群落變化

如圖7所示，在屬水平上，接種的乳植桿菌屬和考克氏菌屬在整個發(fā)酵過程中始終處于主導(dǎo)地位（相對豐度高于1%），這表明復(fù)合發(fā)酵劑的使用改變了香腸中的微生物群落結(jié)構(gòu)[23]。發(fā)酵劑通過對腐敗菌、致病菌的抑制，有效提高了發(fā)酵香腸的安全性，延長了發(fā)酵香腸的保質(zhì)期。整個發(fā)酵過程中，乳桿菌屬隨發(fā)酵的進行先增加后減少，考克氏屬呈先減少后增加并穩(wěn)定的趨勢。接種的香腸中乳桿菌屬和考克氏屬的相對豐度明顯高于其他屬，這可能表明發(fā)酵劑在發(fā)酵的香腸中生長良好并且發(fā)酵劑可導(dǎo)致細(xì)菌群落構(gòu)成的顯著變化[41]。與這些細(xì)菌相比，其他大多數(shù)細(xì)菌（如葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬（Weissella）等）在發(fā)酵前期較為豐富，而隨著發(fā)酵的進行，細(xì)菌種類和豐度逐漸減少。考克氏菌與植物乳植桿菌組合的適應(yīng)性與其他葡萄球菌和植物乳植桿菌復(fù)合菌劑相類似[40-41]。假單胞菌是與腐敗有關(guān)的微生物，會產(chǎn)生不良代謝物和異味化合物[42]，其在接種的香腸中被抑制，這可能是發(fā)酵劑產(chǎn)生的抗菌代謝物及對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭加劇所致，與Xiao Yaqing等[40]的研究結(jié)果一致。

在種水平上，接種的植物乳植桿菌和嗜根考克氏菌在整個發(fā)酵過程中始終處于主導(dǎo)地位（相對豐度高于1%），表明兩者在混合發(fā)酵時，仍然具有很強的生長性能。在發(fā)酵過程中，植物乳植桿菌相對豐度隨著發(fā)酵時間延長先上升再下降，發(fā)酵2 d時，樣本中相對豐度占比最高，達到96.54%，發(fā)酵結(jié)束（發(fā)酵5 d）時達到71.24%；嗜根考克氏菌隨著發(fā)酵時間的變化波動較大，發(fā)酵3 d時樣本中相對豐度占比最高，達到41.73%，發(fā)酵結(jié)束（發(fā)酵5 d）時達到21.06%。此外，類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）等廣泛存在于早期發(fā)酵階段[43]，

隨著發(fā)酵的進行，其會被其他乳酸菌所取代。結(jié)合圖5可知，隨著香腸發(fā)酵的進行，溫度、水分均不再適宜微生物的生長，但發(fā)酵結(jié)束時仍然能維持較高的活菌數(shù)，表明嗜根考克氏菌AP1與植物乳植桿菌L組合在整個發(fā)酵過程中維持較高活性。微生物分析結(jié)果表明，接種處理通過增強優(yōu)勢菌（植物乳植桿菌和嗜根考克氏菌）的競爭能力和限制有害菌（致病菌和腐敗菌）的生長，改善了香腸中的細(xì)菌群落構(gòu)成，這可能有助于香腸在成熟過程中風(fēng)味的發(fā)展。

2.6.3 接種發(fā)酵香腸優(yōu)勢菌種與氨基酸的相關(guān)性分析

為了進一步探索香腸優(yōu)勢微生物與游離氨基酸的關(guān)系，將發(fā)酵過程中的AP1L組樣品中優(yōu)勢微生物（前5 種）與游離氨基酸進行相關(guān)性分析（圖8）。在整個發(fā)酵過程中，不同的細(xì)菌與游離氨基酸的相關(guān)性存在差異，其中，嗜根考克氏菌與16 種氨基酸呈正相關(guān)，與2 種氨基酸（賴氨酸、異亮氨酸）呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001），與1 種氨基酸（酪氨酸）呈負(fù)相關(guān)；植物乳植桿菌與1 種氨基酸（酪氨酸）呈正相關(guān)，與11 種氨基酸呈負(fù)相關(guān)，與2 種氨基酸（賴氨酸、異亮氨酸）呈高度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），表明在發(fā)酵過程中，嗜根考克氏菌對于香腸中游離氨基酸的積累起積極作用，促進香腸風(fēng)味的形成，與本課題組前期對考克氏菌在發(fā)酵肉制品中產(chǎn)香的研究結(jié)果[1，13]一致。

3 結(jié) 論

以自然發(fā)酵香腸為空白對照組，主要研究嗜根考克氏菌AP1和植物乳植桿菌L復(fù)配發(fā)酵香腸在發(fā)酵周期內(nèi)（0～5 d）pH值、水分含量、水分活度、亞硝酸鹽含量、質(zhì)構(gòu)特性、游離氨基酸含量、活菌數(shù)及多樣性等指標(biāo)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程的進行，嗜根考克氏菌AP1與植物乳植桿菌L復(fù)配發(fā)酵香腸的品質(zhì)得到提升。發(fā)酵結(jié)束時（5 d），AP1L組較CK組亞硝酸鹽含量減少44.87%；C較CK組提高11.04%；硬度、咀嚼性和感官得分也優(yōu)于CK組，表明嗜根考克氏菌AP1和植物乳植桿菌L復(fù)配可以有效提升發(fā)酵香腸的安全性、色澤、質(zhì)構(gòu)及感官特性。對發(fā)酵香腸中游離氨基酸含量的研究結(jié)果表明，嗜根考克氏菌AP1和植物乳植桿菌L復(fù)配可顯著提高總游離氨基酸含量（P＜0.05），增強發(fā)酵香腸的風(fēng)味。活菌數(shù)及細(xì)菌多樣性分析結(jié)果表明，接種處理通過增強優(yōu)勢菌（尤其是對香腸中游離氨基酸的積累起積極作用的嗜根考克氏菌）的競爭能力和限制有害菌（致病菌和腐敗菌）的生長，改善了香腸中的細(xì)菌群落構(gòu)成，促進香腸風(fēng)味的形成，驗證了肉制品中常見的考克氏菌作為肉制品發(fā)酵輔助菌種的可行性。

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收稿日期：2024-09-14

基金項目：云南省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項目（202407AA110005）；

云南省創(chuàng)新引導(dǎo)與科技型企業(yè)培育計劃項目（202404BU090030；202404BI090013）

第一作者簡介：陳駿飛（1990—）（ORCID： 0009-0006-5441-9335），男，助理研究員，碩士，研究方向為發(fā)酵食品。

E-mail： cjf22118@163.com

*通信作者簡介：劉畢琴（1989—）（ORCID： 0000-0003-3718-3982），女，助理研究員，碩士，研究方向為發(fā)酵食品。

E-mail： 952002736@qq.com

史巧（1983—）（ORCID： 0000-0003-2457-4618），女，副研究員，博士，研究方向為發(fā)酵食品。

E-mail： sq@yaas.org.cn