甘藍型油菜細胞質雄性不育的細胞學觀察及不育胞質類型鑒定

收稿日期：2024-03-17

基金項目：國家自然科學基金項目（31860388），甘肅省科技重大專項（22ZD6NA009），甘肅省科技計劃項目（23CXJA0001）

作者簡介：翟利佳（1998-），女，河南洛陽人，碩士研究生，主要研究方向為作物遺傳育種。（E-mail）2779659163@qq.com

通訊作者：方彥，（E-mail）ffyv@163.com

摘要：為明確22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A3個細胞質雄性不育（CMS）系甘藍型冬油菜花粉敗育機理及不育胞質類型，本研究以3組甘藍型冬油菜細胞質雄性不育系及保持系為材料，通過觀察花器形態和細胞特征，并根據油菜育性相關基因orf138、orf222、orf224設計引物對3份甘藍型冬油菜不育胞質類型進行多重PCR分子鑒定。結果表明：3個不育材料花瓣平展、花藥不可正常散粉、花絲短小、柱頭較長。不育系花粉的發育受阻于四分體至單核小孢子期間；不育系常規壓片細胞學觀察結果顯示四分體之后未觀察到小孢子或者花粉粒；不育系石蠟切片顯微鏡觀察顯示花粉四分體時期絨氈層異常膨大，擠壓藥室里的四分體，使藥室變形，最終導致雄性不育。3個不育系的不育胞質類型均是OguNWSUAFCMS。

關鍵詞：甘藍型油菜；細胞質雄性不育；花器形態；細胞學觀察；育性鑒定

中圖分類號：Q343.3⁺4文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2025）01-0021-07

CytologicalobservationandsterilecytoplasmtypeidentificationofcytoplasmicmalesterileBrassicanapusL.

ZHAILijia，YANGFurui，LIUZigang，WEIJiaping，CUIJunmei，WUZefeng，FANGYan

（AgronomyCollege，GansuAgriculturalUniversity/StateKeyLaboratoryofAridlandCropScience/GansuKeyLabofCropImprovementandGermplasmEnhancement，Lanzhou730070，China）

Abstract：Inordertoclarifythepollenabortionmechanismandsterilecytoplasmtypeof22N317A，22N195R2Aand22LJ56A-22N286R1Acytoplasmicmalesterile（CMS）linesofwinteroilseedrape，threecytoplasmicmalesterilelinesandmaintainerlinesofwinteroilseedrapewereusedasmaterialsinthisstudy.Theflowermorphologyandcellcharacteristicswereobserved，andprimersweredesignedaccordingtothefertility-relatedgenesorf138，orf222andorf224ofoilseedrapeformultiplexPCRmolecularidentification.Theresultsshowedthatthepetalsofthethreesterilematerialswereflat，theantherscouldnotdispersepollennormally，thefilamentswereshortandthestigmaswerelong.Thedevelopmentofpollensofsterilelineswasblockedduringtheperiodfromtetradtomononuclearmicrospore.Theresultsofconventionalcytologicalobservationofsterilelinesshowedthatnomicrosporesorpollengrainswereobservedafterthetetrad.Paraffinsectionsofthesterilelineshowedthatthetapetumexpandedabnormallyduringthepollentetradperiod，squeezingthetetradintheantherchamber，causingtheantherchambertodeformandeventuallyleadingtomalesterility.ThesterilecytoplasmtypeofthethreesterilelineswasOguNWSUAFCMS.

Keywords：BrassicanapusL.;cytoplasmicmalesterility;shapeofflowerorgans;cytologicalobservation;fertilityidentification

雜種優勢是生物界普遍存在的現象，利用雜種優勢進行新品種選育已經成為作物產量和品質提高的主要途徑。雄性不育系在作物雜種優勢利用中發揮著重要作用。雄性不育按基因型可分為細胞核雄性不育、細胞質雄性不育和核質互作雄性不育。其中，細胞質雄性不育（Cytoplasmicmalesterility，CMS）表現為花粉囊和小孢子發育異常，導致不能產生花粉或花粉敗育，但卵細胞發育正常，可接受外來花粉而正常結實，是母性遺傳，即細胞質遺傳^[1]。細胞質雄性不育是植物界普遍存在的現象，揭示作物細胞質雄性不育的敗育機理、鑒定其不育類型對不育系的利用具有重要意義。

傳統的作物細胞質雄性不育類型的培育與鑒定方法是雜交試驗，這種方法工作量大、鑒定周期長。蔡明等^[2]從甘藍型油菜（BrassicanapusL.）和埃塞俄比亞芥（BrassicacarinataBr）的遠緣雜交后代中選育出NCa細胞質雄性不育型（NCaCMS）材料。Wan等^[3]通過對野生芥菜雄性不育系的不斷連續回交，然后將該不育的細胞質導入到甘藍型油菜中，進而成功地選育出HauCMS材料。李殿榮^[4]在甘藍型油菜S74-3×（豐收4號+7207）的復交后代中發現了不育植株，并成功培育出不育系陜2A、保持系陜2B及其恢復系墾C1、墾C2等。隨著分子生物學的發展，根據特異性基因序列進行PCR標記成為作物細胞質雄性不育類型鑒定新的手段和工具。多重PCR能夠通過使用多對引物同時擴增許多靶基因^[5]，該技術已用于鑒定小麥同源糯性位點的突變類型^[6]、洋蔥細胞質類型^[7]。Zhao等^[8]利用多重PCR方法在油菜OguNWSUAFCMS不育胞質材料中同時擴增出orf138和orf222基因的條帶。舒暢^[9]利用多重PCR方法實現了NRO4270ACMS、PolCMS、OguCMS、KosCMS和WNJ01ACMS5種細胞質不育材料的分子區分。

22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A是甘肅農業大學培育的3個甘藍型油菜細胞質雄性不育材料。為促進上述材料的生產應用，本研究以上述3個材料的不育系和保持系為材料，通過花器形態觀察、花粉細胞常規壓片和石蠟切片觀察及多重PCR方法，鑒定3個材料細胞質雄性不育類型，明確其敗育時期和敗育原因，為3個不育材料的合理利用提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料與方法

本試驗所用的雄性不育系材料22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A及其保持系材料22N317B、22N195R2B、22LJ56A-22N286R1B均由省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室油菜課題組提供。試驗材料種植于甘肅省平涼市南湖鎮農業技術推廣中心油菜育種研究基地，每個材料種植2m²，60株，行距為30cm，株距為15cm，按當地常規措施進行田間管理。于油菜現蕾期和開花期取不育系與保持系材料的油菜花朵各3朵，進行花器形態觀察；根據花蕾長度與花粉發育階段的關系（表1），于油菜現蕾期取花蕾長度0～1.0mm、1.1～2.0mm、2.1～3.0mm、3.1～4.0mm、4.1～5.0mm不育系與保持系材料各10個花蕾新鮮樣品進行不育系花粉細胞學觀察；于油菜3葉期，隨機選取不育系與保持系材料各10株取葉片進行總DNA（gDNA）和線粒體DNA（mtDNA）提取，并通過多重PCR鑒定不育系的不育類型。

1.2細胞學觀察

1.2.1常規壓片將現蕾期獲得的不育系與保持系不同長度的花蕾，用鑷子將花蕾剝開，取出1～2個花藥，置于載玻片上，并反復地輕輕擠壓花藥，使花粉母細胞溢出。使用吸管吸取1%的醋酸洋紅對花粉母細胞進行染色2～3min，并去除花藥壁上的殘留雜質。然后用蓋玻片蓋好染色花粉母細胞，使得染色液正好充滿載玻片和蓋玻片之間的間隙，形成一薄層，利用濾紙吸除蓋玻片四周的染料。在RVL-100-G正倒置一體熒光顯微鏡（美國ECHO公司產品）下進行觀察。

1.2.2石蠟切片參照文獻[10]的方法對現蕾期不育系與保持系不同長度的花蕾進行石蠟切片觀察。切片時，打開展片機并將其預熱至恒定的37℃，然后將包埋組織的蠟塊精確地切成4μm厚的均勻蠟片。展片時，將處理好的載玻片放入37℃的烘箱中過夜晾干，保存。封片時，用中性樹膠滴在封片后將其放入37℃的烘箱中過夜晾干。使用RVL-100-G正倒置一體的熒光顯微鏡進行花蕾石蠟切片觀察。

1.3不育系不育胞質類型鑒定

采用CTAB法提取3個不育系3葉期葉片總DNA（gDNA），采用線粒體DNA（mtDNA）提取試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司產品）提取線粒體DNA（mtDNA）。以3個不育系的mtDNA為模板及orf138、orf222、orf224、orf139等基因的引物^[11]（表2）對不育系不育胞質類型進行鑒定。其中，引物1～3分別用于鑒定OguCMS、PolCMS和NapCMS3種不育胞質類型，引物4用于檢查總gDNA樣本中是否混有mtDNA。根據NCBI報道的油菜核不育基因MS2Bnap和BnMS1分別設計引物5和引物6，檢測mtDNA樣品中是否混有gDNA。單一引物PCR反應體系總體積為11.0μL，包括不育材料mtDNA1.0μL，2×ProTaqMasterMix5.0μL，上下游引物各0.9μL，3.2μLddH2O。多重PCR反應體系總體積亦為11.0μL，包括mtDNA1.0μL，2×ProTaqMasterMix5.0μL，OguCMS、PolCMS和NapCMS不育類型擴增基因orf138、orf222和orf224的上下游引物各0.3μL，3.2μLddH2O。單一引物PCR和多重PCR反應程序均為：95℃預變性3min；94℃變性30s、54℃退火30s、72℃延伸2min，35個循環；72℃延伸10min。反應結束后，取10μLPCR產物在1×TAEbuffer中使用1.5%瓊脂糖凝膠進行平板電泳分離。應用溴化乙錠對條帶進行染色，并在紫外線下觀察、拍照。

2結果與分析

2.1花器形態特征

從圖1可以看出，3組甘藍型冬油菜不育系與保持系之間花器官形態差異顯著。保持系和不育系花蕾數量相差不大，花瓣均較為平展。但保持系花絲較長，花藥飽滿其中有很多成熟花粉粒，大部分花粉可以正常開裂并散出；不育系花絲短小，柱頭高于花藥，花藥干癟弱小，發育異常，不能正常散粉，導致不育。

2.2花粉細胞的形態結構特征

2.2.1常規壓片觀察的花粉細胞保持系22N317B和不育系22N317A花粉細胞常規壓片如圖2所示。保持系22N317B花粉母細胞經過2個減數分裂周期形成四分體（圖2A），四分體周圍充滿了胼胝質，胼胝質逐漸消解后，四分體進入單核早期，四分體釋放出單個圓形的小孢子，但細胞核不清晰（圖2B），接著進入單核靠邊期，細胞核在細胞一側，細胞核此時清晰可見，整個細胞呈現三瓣狀構造（圖2C），最后細胞核經過有絲分裂，形成大小不等的2個核，進入雙核期，較大的細胞核位于細胞的中心，較小的細胞核位于細胞一側（圖2D），小孢子繼續生長進入花粉成熟期，花粉粒顏色較深，細胞核不清晰，形態趨于圓潤充實（圖2E）。不育系22N317A經2輪減數分裂形成規整的四分體結構（圖2F），但在四分體之后并沒有觀察到小孢子或者花粉粒（圖2G），可能是四分體時期之后發生了降解，表明花藥很有可能在四分體至單核小孢子期間敗育。另外2組材料的花粉細胞發育的細胞形態學特征與其相似。

2.2.2石蠟切片觀察的花粉細胞保持系22N317B和不育系22N317A花粉細胞發育過程中的石蠟切片如圖3所示。可育系22N317B花粉母細胞經過減數分裂形成四分體，絨氈層逐漸降解（圖3A），接著進入單核小孢子晚期，細胞核偏移（圖3B），隨著絨氈層的降解花粉進入成熟期，絨氈層消失，花粉粒變為橢圓形，顏色變深，可以觀察到4個花粉囊，花粉囊開裂，釋放花粉（圖3C）。不育株22N317A在四分體時期，絨氈層增大，絨氈層細胞內含有大液泡，液泡將細胞核和細胞質擠到細胞一邊，使得細胞質濃縮（圖3D），隨著進一步的發育，未形成小孢子，且絨氈層進一步增大，向內擠壓四分體，藥室體積變小（圖3E），最后絨氈層和四分體全部消失，整個花粉囊萎縮（圖3F）。根據石蠟切片結果可知，不育系22N317A花粉細胞四分體后小孢子不能被釋放出來，同時絨氈層異常膨大，向內擠壓四分體，致使藥室變形，最終導致敗育。另外2組材料的花粉細胞發育的結果與其類似。

2.3mtDNA和gDNA的分離純化

以任一不育系gDNA和3個不育系mtDNA為模板，利用引物4對orf139基因進行PCR擴增得到的電泳圖譜如圖4A所示，從圖中可以看出，泳道1～4均出現500bp左右的條帶，說明orf139的目標片段在所有的mtDNA和gDNA樣本中都被擴增到，因此說明分離的gDNA中含有mtDNA，基因的特異性可以通過mtDNA模板表達出來。利用引物5和引物6分別對核基因MS2Bnap和核基因BnMS1進行PCR擴增得到的電泳圖譜如圖4B和圖4C所示，從圖中可以看出，圖4B和4C結果是相同的，均是泳道1出現1000bp左右的條帶，泳道2～4均沒有出現條帶，說明以mtDNA作為模板沒有得到PCR產物，分離的mtDNA為gDNA的一部分。

2.4不育胞質類型

以不育系22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A的mtDNA為模板，利用引物1、引物2和引物3分別進行PCR擴增，擴增產物的電泳圖譜如圖5所示。從圖中可以看出，利用引物1進行PCR擴增，3個不育系材料擴增產物的電泳圖譜均出現465bp的條帶（圖5A）;利用引物2進行PCR擴增，3個不育系材料擴增產物的電泳圖譜中均出現1102bp的條帶（圖5B）;而3個不育系材料引物3擴增產物的電泳圖譜中均沒有出現條帶（圖5C）。由于465bp、1102bp和747bp條帶分別是OguCMS、NapCMS和PolCMS不育胞質類型的分子標記^[8]，因此單個引物PCR擴增產物的電泳圖譜無法判斷3個不育系材料的不育胞質類型。

以不育系22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A的mtDNA作為模板，以引物1、引物2與引物3進行多重PCR擴增，擴增產物的電泳圖譜如圖6所示。由圖可知，3個不育系材料都出現了465bp和1102bp特定組合的條帶。由于油菜不育胞質類型與各自PCR產物的特定組合有關，465bp和500bp條帶組合是OguCMS材料的特異性條帶組合，747bp和500bp條帶組合是PolCMS材料的特異性條帶組合，1102bp和800bp條帶組合是NapCMS材料的特異性條帶組合，465bp和1102bp條帶組合是OguNWSUAFCMS材料的特異性條帶組合^[8]。因此，本研究使用的3個不育系材料的不育胞質類型均為OguNWSUAFCMS。

泳道Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：依次以不育系22N317A、22N195R2A、22LJ56A-22N286R1A的mtDNA為模板；泳道Ⅳ：以ddH2O為模板的陰性對照。

3討論與結論

3.13組甘藍型油菜不育系和保持系的花器官形態特征

花器作為作物的生殖器官，在不育系和可育系之間存在明顯的差異。王開芳等^[12]研究結果表明，恢復系1831R植株開花時，花藥較大，正常散粉，柱頭高度與花藥高度幾乎一致；而不育系105A的花藥小且干癟，無花粉，但雌蕊發育正常，雄蕊長度不到花柱的一半。本研究的3個不育系材料花器官的形態與王開芳等^[12]的研究結果一致。

3.2不育系花粉敗育發生的時期和敗育原因

花粉發育過程中，任何時期出現異常均會導致雄性不育花粉，花粉敗育發生的時期和原因存在較大差異^[13]。王開芳等^[12]采用石蠟制片法，對甘藍型油菜雜交種青雜5號的雄性不育系105A及其恢復系1831R的小孢子發生和花藥發育過程進行觀察，研究結果表明，在不育系105A花粉敗育過程中，一部分發生于造孢細胞時期；另一部分發生于單核晚期，其特點為單核晚期絨氈層細胞膨大向小孢子靠近，并逐步降解，其破裂胞質退化殘余物侵入藥室，與小孢子混合粘連在一起，甚至有些絨氈層細胞整塊脫落，成為染色很深的團塊狀物質，占據藥室一部分空間，最終小孢子降解，花粉敗育。劉燕等^[14]通過石蠟切片顯微鏡觀察，發現甘藍型油菜雄性不育系212A在孢原細胞階段遭受發育阻礙，沒有出現造孢細胞和花粉囊的分化。唐鑫等^[15]采用醋酸洋紅染色法和石蠟切片法對溫敏細胞核雄性不育系160S花藥進行細胞學觀察，結果表明160S屬花粉母細胞敗育型不育系，敗育時期發生在減數分裂期，絨氈層異常降解，絨氈層未向腺質型轉化，不能提供花粉母細胞發育所需要的營養物質，致使花粉母細胞發育受阻，無法形成四分體結構，從而導致小孢子無法形成，花藥形成空的花粉囊，產生雄性不育。本研究通過常規壓片及石蠟切片觀察結果顯示，3個不育系材料的敗育時期為四分體至單核花粉粒期間，敗育的原因主要在于四分體時絨氈層細胞大液泡化且徑向增大，向內擠壓四分體，最終導致藥室變形和花粉敗育。這與胡麗嬌^[16]研究的Ogura型細胞質雄性不育系大白菜的敗育機制一致。

3.33個不育系的不育類型鑒定

植物細胞質雄性不育的機理與線粒體上特異基因的表達密切相關，不同的細胞質雄性不育系都有其特有的不育基因^[17-18]。線粒體基因組中orf138基因編碼orf138蛋白，引起OguCMS^[19]；而orf222和orf224基因的表達分別引起NapCMS和PolCMS^[20]。利用不育基因進行引物設計并進行PCR擴增，可以得到該不育胞質類型特異性分子標記^[21]，但單引物PCR往往不能準確地確定油菜不育胞質類型，而通過多重PCR則可以快速區分不育胞質類型^[8]。張德雙^[22]用atp6基因和orf222基因引物組，通過多重PCR擴增，實現了3種大白菜不育系的區分。李建斌等^[23]在6個結球甘藍CMS植株中發現大多數單株中可以同時檢測到orf138基因和orf222基因，這結果表明該類不育系可能是OguraCMS和NapCMS兩種類型的雜合體。

本研究利用orf138、orf222、orf224基因的3對特異性引物，對22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A3個甘藍型冬油菜不育系mtDNA進行多重PCR擴增，擴增產物中都出現465bp和1102bp組合的條帶。因此，22N317A、22N195R2A和22LJ56A-22N286R1A3個不育系均為OguNWSUAFCMS。

參考文獻：

[1]姚鴻，謝緯武，李傳友，等.D-2型小麥細胞質雄性不育系及其保持系和恢復系線粒體DNA的比較研究[J].遺傳學報，1998，25（1）：1-7.

[2]蔡明，劉貴華，秦選佑.甘藍型油菜雄性不育的遺傳研究：I.NCa甘藍型油菜異核型雄性不育材料選育初報[J].中國油料，1993，15（4）：1-3，7.

[3]WANZJ，JINGB，TUJX，etal.Geneticcharacterizationofanewcytoplasmicmalesterilitysystem（hau）inBrassicajunceaanditstransfertoB.napus[J].TheorandApplGenet，2008，116（3）：355-362.

[4]李殿榮.甘藍型油菜三系選育初報[J].陜西農業科學，1980（1）：26-29.

[5]CHAMBERLAINJS，GIBBSRA，RAINERJE，etal.DeletionscreeningoftheDuchennemusculardystrophylocusviamultiplexDNAamplification[J].NuclAcidsRes，1988，16（23）：11141-11156.

[6]NAKAMURAT，VRINTENP，SAITOM，etal.RapidclassificationofpartialwaxywheatsusingPCR-basedmarkers[J].Genome，2002，45（6）：1150-1156.

[7]KIMS，LEEET，CHODY，etal.Identificationofanovelchimericgene，orf725，anditsuseindevelopmentofamolecularmarkerfordistinguishingamongthreecytoplasmtypesinonion（AlliumcepaL.）[J].TheorandApplGenet，2009，118（3）：433-441.

[8]ZHAOHX，LIZJ，HUSW，etal.Identificationofcytoplasmtypesinrapeseed（BrassicanapusL.）accessionsbyamultiplexPCRassay[J].TheorandApplGenet，2010，121（4）：643-650.

[9]舒暢.甘藍型油菜蘿卜甘藍細胞質雄性不育系NRO4270A的研究[D].武漢：華中農業大學，2011.

[10]金姣姣.基于生長錐和下胚軸分析甘藍型冬油菜的抗寒性機制[D].蘭州：甘肅農業大學，2020.

[11]危文亮，王漢中，劉貴華.甘藍型油菜新型細胞質雄性不育系NCa不育胞質類型的分子鑒定[J].中國農業科學，2005，38（10）：1965-1972.

[12]王開芳，張詠梅，張金文，等.甘藍型油菜細胞質雄性不育系105A花藥敗育的細胞學觀察[J].中國農學通報，2015，31（13）：76-80.

[13]WANGSP，ZHANGGS，SONGQL，etal.AbnormaldevelopmentoftapetumandmicrosporesinducedbychemicalhybridizationagentSQ-1inwheat[J].PLoSOne，2015，10（3）：e0119557.

[14]劉燕，董振生，張改生，等.甘藍型油菜CMS212A花藥發育的細胞學研究[J].西北農業學報，2005，14（2）：33-37.

[15]唐鑫，李圓圓，陸俊杏，等.甘藍型油菜溫敏細胞核雄性不育系160S花藥敗育的形態學特征和細胞學研究[J].作物學報，2021，47（5）：983-990.

[16]胡麗姣.基于RNA-seq對大白菜Ogura型細胞質雄性不育機制的研究[D].鄭州：鄭州大學，2022.

[17]HANSONMR，BENTOLILAS.Interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment[J].ThePlantCell，2004，16（S）：154-169.

[18]張祖新，方明鏡，杜何為，等.基于PCR技術的玉米CMS材料胞質類型的快速鑒定[J].作物學報，2005，31（10）：1386-1388.

[19]BELLAOUIM，PELLETIERG，BUDARF.Thesteady-statelevelofmRNAfromtheOguracytoplasmicmalesterilitylocusinBrassicacybridsisdeterminedpost-transcriptionallybyits3′region[J].TheEMBOJournal，1997，16（16）：5057-5068.

[20]俞咪娜，董媛媛，徐攀峰，等.油菜胞質不育類型相關基因研究進展[J].華北農學報，2008，23（增刊1）：7-11.

[21]陳黎明，柳李旺，晉萍，等.兩個蘿卜雄性不育材料胞質的細胞學與分子鑒定[J].分子植物育種，2009，7（4）：757-762.

[22]張德雙.大白菜CMS96細胞質雄性不育的分子特性及育種應用研究[D].北京：中國農業科學院，2006.

[23]李建斌，張海娟，余小林，等.結球甘藍細胞質雄性不育（CMS）類型的分子鑒定[J].分子植物育種，2009，7（6）：1149-1153.

（責任編輯：石春林）