豬lncRNA5791的表達模式及互作蛋白質分析

收稿日期：2024-06-25

基金項目：國家自然科學基金項目（32172696）；國創中心先導項目（NCTIP-XD/B01）；黑龍江省農業科學院創新工程重大項目（CX23ZD06）

作者簡介：張冬杰（1980-），女，黑龍江佳木斯人，博士，研究員，主要從事民豬資源研究。（E-mail）djzhang8109@163.com

通訊作者：劉娣，（E-mail）liudi1963@163.com

摘要：為了揭示冷刺激下lncRNA5791的應答模式，本研究利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）、核質分離技術、RNA沉降（Pulldown）技術全面分析lncRNA5791生物功能。結果表明，lncRNA5791在冷刺激處理的民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對表達量較高，在臀部脂肪中相對表達量較低。冷刺激處理后豬不同部位脂肪中lncRNA5791的相對表達量均極顯著高于常溫對照（Plt;0.01）。lncRNA5791定位于豬的9號染色體，其在細胞核和細胞質中均有分布。在脂肪細胞增殖期，lncRNA5791的表達持續受到抑制；在脂肪細胞分化期，lncRNA5791的相對表達量呈現先升高后下降的趨勢。質譜分析結果表明，lncRNA5791可能與膜聯蛋白A2（ANXA2）、泛素A52殘留核糖體蛋白融合產物1（UBA52）和組蛋白H4（H4）互作。本研究結果為揭示lncRNA5791在冷刺激應答中的具體調控機制奠定了重要基礎。

關鍵詞：豬；lncRNA5791；相對表達量；亞細胞定位；互作蛋白

中圖分類號：S828文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2025）01-0112-07

ExpressionpatternsandinteractingproteinanalysisofpiglncRNA5791

ZHANGDongjie，MAShouzheng，WANGLiang，LIUDi

（InstituteofAnimalHusbandry，HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150086，China）

Abstract：InordertorevealtheresponsepatternoflncRNA5791undercoldstimulation，thisstudycomprehensivelyanalyzedthebiologicalfunctionsoflncRNA5791byusingreal-timefluorescencequantitativePCRtechnology（qRT-PCR），nuclear-cytoplasmicseparationtechnologyandRNApull-downtechnology.TheresultsshowedthattherelativeexpressionleveloflncRNA5791wasrelativelyhighinthebackfatandinguinalfatofMinpigstreatedwithcoldstimulation，andrelativelylowintheglutealfat.TherelativeexpressionlevelsoflncRNA5791inthefatsofdifferentpartsofpigstreatedwithcoldstimulationwereallextremelysignificantlyhigherthanthoseofthenormaltemperaturecontrolgroup（Plt;0.01）.lncRNA5791waslocatedonchromosome9ofpigsandwasdistributedinboththenucleusandthecytoplasm.Duringtheproliferationperiodofadipocytes，theexpressionoflncRNA5791wascontinuouslyinhibited.Duringthedifferentiationperiodofadipocytes，therelativeexpressionleveloflncRNA5791showedatrendofincreasingfirstandthendecreasing.TheresultsofmassspectrometryanalysisindicatedthatlncRNA5791mightinteractwithannexinA2（ANXA2），ubiquitinA52residueribosomalproteinfusionproduct1（UBA52）andhistoneH4（H4）.TheresultsofthisstudylayanimportantfoundationforrevealingthespecificregulatorymechanismoflncRNA5791intheresponsetocoldstimulation.

Keywords：pig；lncRNA5791；relativeexpression；subcellularlocalization；interactingprotein

在哺乳動物中，僅有1%～2%的DNA被轉錄成編碼蛋白質的信使RNA（mRNA），而其余的DNA則被轉錄成非編碼RNA（Non-codingRNA，ncRNA）^[1]。長度小于200nt的ncRNA被稱為小ncRNA（SmallncRNA，sncRNA），長度大于200nt的則被稱為長ncRNA（lncRNA）。lncRNA廣泛存在于真核生物中，具有較強的時間和空間特異性以及組織特異性^[2]。lncRNA在物種間保守性較差，參與調控基因轉錄、組蛋白修飾、DNA甲基化修飾等重要生命活動^[3]。

脂肪是重要的代謝和內分泌組織，也是機體主要的能量儲存部位。目前，對人類脂肪組織的研究主要集中在肥胖和糖尿病的治療方面，對家養動物脂肪組織的研究主要集中在背膘厚^[4]、肌內脂肪含量^[5]和抗逆性^[6]等方面。研究結果表明，lncRNA參與許多重要生物過程，包括脂肪分泌、脂質代謝等。如lncRNAU90926可以通過調控PPAR信號通路及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）調控脂肪沉積^[7]。lncRNAGm15290可以競爭性吸附miR-27b，促進脂肪關鍵轉錄因子PPARγ和CCAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα）基因表達，從而調控脂質代謝^[8]。與mRNA相比，lncRNA表達水平較低，且在物種間保守性較差；與miRNA相比，lncRNA序列較長，能夠形成更為復雜的空間結構，lncRNA調控靶基因轉錄的機制也更復雜多樣。目前lncRNA的作用機制尚未完全闡明。

民豬是中國華北型豬的主要代表之一，具有高繁殖力、產仔數多、抗寒和抗病力強、耐粗飼料、肉質優良的特點。本課題組利用轉錄組測序技術對冷刺激民豬的脂肪組織中差異表達的lncRNA進行鑒定與篩選，發現了1個表達量上調7.8倍的lncRNA，與NCBI數據庫比對后，將其命名為lncRNA5791^[9]。冷刺激會促進脂肪細胞的能量代謝，改變其增殖分化模式。本研究擬利用分子生物學技術對冷刺激民豬的生物學特征進行分析，為揭示lncRNA5791在豬低溫應答中的作用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

6頭6月齡體重相近的雌性民豬購自黑龍江省農業科學院民豬保種場。6頭民豬隨機分為常溫對照和冷刺激處理，每處理3頭。民豬均在室內飼養，室內溫度控制在（18±2）℃，當室外平均溫度降至-20℃時，將冷刺激處理民豬放于室外飼養，對照豬仍在室內飼養。試驗期間保證充足的飼糧和飲水，冷刺激3d后，集中屠宰所有民豬，分別取民豬背部脂肪、臀部脂肪、頸部脂肪、胸部脂肪、腹股溝脂肪和腹部脂肪，于-80℃冰箱保存。

1.2試劑

主要試劑有Trizol、SYBRPremixExTaqⅡ（TliRNaseHPlus）、RNA反轉錄試劑盒、膠回收純化試劑盒，UniversalDNA純化回收試劑盒、脂肪組織胞質胞核分離試劑盒、TranscriptAidT7高產率轉錄試劑盒。

1.3RNA提取及反轉錄

使用Trizol試劑提取民豬不同部位脂肪組織的RNA，利用NanoDrop2000amp;8000微量分光光度計檢測純度，利用安捷倫生物分析儀2100檢測RNA的濃度及完整性，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。

1.4lncRNA5791在民豬不同部位脂肪組織中的表達情況

為檢測冷刺激3d后lncRNA5791在民豬背部脂肪、臀部脂肪、頸部脂肪、腹股溝脂肪及腹部脂肪組織中的表達水平，本研究利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）進行檢測。依據NCBI數據庫中已公布的lncRNA5791基因序列（GenBank登錄號：XR_002335791），通過Primer5.0軟件設計引物（lncRNA5791F：5′-GACGCCTTGCTTGTACCTGA-3′；lncRNA5791R：5′-TGTGCCCTTTGACTCTTCCA-3′），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。PCR反應體系：cDNA模板0.5μL，2×SYBRGreenPCRMixture10.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，滅菌水8.5μL。PCR反應程序：95℃10min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，其引物序列為GAPDHF：5′-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′；GAPDHR：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。通過2^-△△Ct法計算lncRNA5791的相對表達量，△△Ct=△Ct冷刺激處理-△Ct對照，其中△Ct=CtlncRNA5791-CtGAPDH。

1.5lncRNA5791的染色體定位

依據NCBI數據庫中已公布的lncRNA5791序列，利用Primer5.0軟件設計PCR擴增引物（lncRNA5791LF：5′-CCGAGGGAACCACCTACCGA-3′，lncRNA5791LR：5′-ACAACGATCATCACAACCCA-3′）。采用PCR擴增目標序列后進行克隆測序，并與NCBI數據庫中的序列進行比對分析，以確認lncRNA5791在染色體上的定位。

1.6lncRNA5791的亞細胞定位

按照脂肪組織胞質胞核分離試劑盒（Invent）說明書分離細胞核和細胞質。取120～150mg民豬背部脂肪組織，37℃解凍后切成2～3mm³小塊，放入無RNA酶的1.5mL離心管中，加入600μLN/C緩沖液和15μLRNA抑制劑，研磨2～3min后，全部轉移至預冷的離心管柱中，-20℃孵育20min，4℃、500g離心5min，棄離心管柱，4℃、100g離心5min，小心吸取上清液，加入1.5mL離心管中（無RNA酶），30μLPBS溶液重懸細胞核，完成細胞核和細胞質的分離。使用MiniUniversalRNA提取試劑盒分別提取細胞核和細胞質RNA。通過qRT-PCR檢測lncRNA5791在脂肪細胞中的核質分布情況，以GAPDH（主要在細胞質表達）和Neat1（主要在細胞核表達）作為對照，引物序列為Neat1F：5′-AGAGTGATGCCTGGTAGATGG-3′；Neat1R：5′-GTGGCTTCCTGTGAGTATTGG-3′。

1.7lncRNA5791在豬脂肪細胞增殖和分化階段表達特征分析

取實驗室凍存的民豬前脂肪細胞，37～39℃溫水復蘇后接種至完全培養基培養。培養12h首次收集細胞，之后每隔12h收集1次細胞，直到培養48h，待細胞匯合度達到90%～100%時，加入脂肪細胞誘導培養基Ⅰ（5.0μg/mL胰島素，1.0μmol地塞米松，1.0μmol吲哚美辛，0.5μmol磷酸二酯酶抑制劑），誘導2d后，將脂肪細胞誘導培養基Ⅰ更換為脂肪細胞誘導培養基Ⅱ（5μg/mL胰島素），并于4d、6d、8d同一時間更換新的脂肪細胞誘導培養基Ⅱ，在每次更換培養基時收集細胞，直至誘導第8d。將所提RNA反轉錄成cDNA，保存于-20℃。以cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測lncRNA5791在脂肪細胞增殖期和分化期的表達情況。

1.8lncRNA5791互作蛋白的篩選與分析

以材料與方法1.5中克隆獲得的lncRNA5791片段為模板，通過PCR擴增獲得含有T7啟動子的DNA粗產物，引物序列如下：lncRNA5791-正義鏈-F：5′-taatacgactcactatagggCCGAGGGAACCACC￣T￣A￣C￣C￣G￣A￣C￣C￣C￣A￣G￣C￣G￣G￣C-3′，lncRNA5791-正義鏈-R：5′-CATTTTTTATTTTTATTTTTATTTATTTT-3′（小寫字母為T7啟動子序列）。擴增反義鏈的引物序列如下：lncRNA5791-反義鏈-F：5′-taatacgactcactatagggCATTTT￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣T-3′，lncRNA5791-反義鏈-R：5′-CCGAGGGAACCACCTACCGACCCAGCGGC-3′。擴增片段作為RNApulldown試驗的陰性對照。PCR反應體系：10×BufferforKOD-Plus10μL，2mmoldNTPs8μL，25mmolMgSO44μL，100μm上下游引物各2μL，DNA模板2μL，1.0U/μLKOD-Plus2μL，加高純度水（DEPC）補至100μL。使用UniversalDNA純化回收試劑盒回收目的條帶。

以回收的目的條帶為模板，使用高產率轉錄試劑盒進行體外轉錄。反應體系：DNA模板1μg，5×TranscriptAidReactionBuffer4μL，10mmolATP2μL，10mmol/LCTP2μL，10mmolGTP2μL，10mmolUTP2μL，T7enzymemix2μL。在37℃下反應40min后加入1μLDNaseI，37℃孵育15min以去除殘余DNA，加入28μLDEPC水，5mol醋酸銨5μL混合均勻。加入60μL無水乙醇和1μLEDTA，于-20℃靜置1h，然后16000g離心10min，棄上清液后用70%乙醇漂洗沉淀，沉淀物晾干后，將沉淀物溶于20μLDEPC水，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA片段的大小。

嚴格按照Pierce^TMMagneticRNA-ProteinPull-DownKit試劑盒的操作說明，獲取lncRNA5791與結合蛋白的復合物溶液。配制15mL分離膠（15%）和5mL濃縮膠（5%），進行復合物溶液SDS-PAGE電泳，電泳條件：濃縮膠，80V電壓電泳30min；分離膠，120V電壓電泳60min，電泳結束后，將膠置于去離子水中清洗5min，棄掉清洗液，加入固定液，室溫下固定30min，隨后棄掉固定液，加入去離子水清洗2次，加入致敏液浸泡30min，棄掉致敏液后，加入去離子水清洗2次，加入染色液，室溫下染色20min，棄掉染色液，加入去離子水清洗2次，加入顯色液，顯色2min左右，溶液變渾濁后棄掉顯色液，加入新的顯色液直至出現清晰的目的條帶，清洗后拍照留存。

切下lncRNA5791正義鏈編碼蛋白質與反義鏈編碼蛋白質間存在差異的條帶，送到武漢金開瑞生物工程有限公司進行質譜分析。

1.9數據統計分析

使用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析，每組3個生物學重復和3個技術重復。

2結果與分析

2.1lncRNA5791在不同部位脂肪組織中的表達情況

如圖1所示，lncRNA5791在冷刺激處理的民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對表達量較高，在臀部脂肪中相對表達量較低。冷刺激處理豬不同部位脂肪中lncRNA5791的相對表達量均極顯著高于常溫對照（Plt;0.01），但豬不同部位脂肪中lncRNA5791的相對表達量上升幅度存在差異。說明冷刺激會誘導lncRNA5791在脂肪中的表達。

2.2lncRNA5791的染色體定位

以lncRNA5791LF/lncRNA5791LR為引物，PCR擴增后獲得808bp目的片段，通過BLAST比對，在NCBI數據庫中獲得1段與其序列相似度達99%的非編碼RNA序列，該序列位于9號染色體，與序列相似家族72成員A（FAM72A）和雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶3（DYRK3）等基因相鄰（圖2）。

2.3lncRNA5791的亞細胞定位

亞細胞定位結果表明，lncRNA在細胞核和細胞質均有分布（圖3）。

2.4lncRNA5791在脂肪細胞增殖期和分化期的表達

由圖4可知，在細胞增殖期，lncRNA57910h時相對表達量最高，顯著高于12h、24h、36h、48h（Plt;0.05），隨著時間的延長相對表達量呈下降趨勢。在細胞分化期，lncRNA5791相對表達量呈先上升后下降的趨勢，在第4dlncRNA5791相對表達量達到最高，顯著高于0d、2d、6d、8d（Plt;0.05）。

2.5lncRNA5791互作蛋白的篩選

如圖5A所示，通過RNApulldown試驗獲得與lncRNA5791互作的蛋白。質譜分析結果（圖5B）表明，與lncRNA5791和陰性對照互作的蛋白質分別有91個和92個，與兩者共同互作的蛋白質有59個。將與lncRNA5791互作的91個蛋白質按照得分高低進行排序，排名前10的蛋白質如表1所示，從中去掉與陰性對照共有的蛋白質，獲得的3個特異性蛋白質分別為膜聯蛋白A2（ANXA2）、泛素A52殘留核糖體蛋白融合產物1（UBA52）和組蛋白H4（H4）。

3討論

脂肪組織是一種富含脂肪細胞的特殊結締組織，可分為白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）。脂肪組織不僅是儲存能量的場所，還是調控多種生理過程的重要代謝傳感器和內分泌器官^[10]。機體遭受冷刺激后，BAT通過線粒體內膜上的H⁺轉運蛋白——解偶聯蛋白1（UCP1），以非顫栗性產熱的形式將儲存的能量轉化為熱量，從而維持體溫平衡^[11]。WAT可通過褐變增強動物對寒冷環境的耐受性。Zhang等^[12]發現，在寒冷季節，耐寒的蒙古綿羊肩胛和皮下的白色脂肪細胞直徑顯著增加，脂肪生成基因相對表達量顯著升高，腹膜和腎周的白色脂肪組織（WAT）發生季節性褐變。本課題組在前期研究發現，冷刺激處理會改變民豬皮下脂肪組織基因的表達模式，且同一基因在不同部位脂肪中的表達存在差異^[13]。由于豬缺失UCP1基因，無法形成傳統意義上的褐色脂肪^[14]，其脂肪組織在冷刺激下的產熱機制仍有待進一步探究。

本研究進一步利用qRT-PCR技術檢測了lncRNA5791在不同部位脂肪的表達情況，結果表明其在民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對表達量較高，在臀部脂肪中相對表達量較低，這與潘建飛等^[15]對巴馬豬的研究結果一致。說明背部脂肪和腹股溝脂肪雖同為皮下脂肪，但對冷刺激的應答模式存在差異。李倩文等^[16]研究發現，低溫誘導冬季藏豬腹股溝和肩胛處脂肪細胞呈現多腔脂滴形態，同時脂肪細胞褐變基因相對表達量顯著提高。Engelhard等^[17]研究發現，冷刺激處理小鼠肩胛部棕色脂肪（iBAT）中lncRNAGm1555表達受到抑制，相對表達量較低，在肩胛部白色脂肪（iWAT）中相對表達量中等；lncRNAGm1555在附睪白色脂肪（eWAT）中相對表達量較高。結合本研究結果綜合分析，lncRNA對冷刺激產生了應答，但其在不同脂肪組織中的調控機制不同，導致其相對表達量存在差異。

lncRNA的調控作用與其亞細胞定位密切相關。大多數lncRNA定位于細胞核中，作為細胞核組織和功能的調節因子，參與基因轉錄、組蛋白修飾等生物過程；部分lncRNA則被輸出到細胞質中，通過調控mRNA的穩定性、調節翻譯效率發揮作用^[18]。此外，也有一些lncRNA可同時在細胞質和細胞核中表達。例如lncRNAPYCARD-AS1是一種靶向促凋亡基因PYCARD的反義lncRNA。在細胞核中，它將DNA甲基轉移酶1（DNMT1）和組蛋白甲基轉移酶（G9a）募集到PYCARD啟動子區，以促進DNA甲基化和組蛋白H3第9位賴氨酸殘基的二甲基化（H3K9me2）修飾。在細胞質中，它與PYCARDmRNA相互作用，抑制核糖體的組裝和PYCARD的翻譯^[19]。本研究發現，lncRNA5791同時定位于細胞核和細胞質中，但其具體作用機制尚不明確，仍需進一步探究。

前脂肪細胞通過增殖和分化最終形成成熟的脂肪細胞，這一過程受到多條信號通路的調控，其中包含多種轉錄因子^[20]。lncRNA的發現進一步完善了脂肪細胞調控網絡。有研究結果表明，lncBATE10通過與CUGBPElav樣家族成員1（Celf1）的競爭性結合，減少過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）的釋放，進而促進脂肪組織褐變^[21]。lncRNAMSTRG4710通過miR-29b-3p/IGF1軸正向調控脂肪細胞增殖和脂肪生成^[22]。在前脂肪細胞分化期，LncRNAAcart相對表達量迅速升高，LncRNAAcart過表達可加速脂肪細胞的增殖并減少細胞凋亡^[23]。本研究中，在脂肪細胞增殖期，lncRNA5791表達持續受到抑制；在脂肪細胞分化過程中，lncRNA5791相對表達量呈先上升后下降的趨勢，在第4d相對表達量達到最高。由此推測，lncRNA5791可能在抑制脂肪細胞增殖的同時，促進脂肪細胞早期分化。

RNApulldown技術是檢測RNA結合蛋白與其靶向RNA相互作用的主要技術。對于已知的互作蛋白，可通過免疫印記試驗（Westernblotting）進行驗證。對于未知的互作蛋白，則需采用質譜分析方法進行鑒定。lncRNA5791是1個新發現的lncRNA，本研究利用其反義鏈探針作為陰性對照，篩選到3個可能與其發生互作的蛋白。其中，ANXA2是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，屬于膜聯蛋白家族，在細胞質中以游離單體形式存在，參與跨膜轉運及鈣調蛋白調控的膜相關生物活動^[24]，泛素A52殘留核糖體蛋白融合產物1（UBA52）是一種高度保守的核質分布蛋白，具有維持染色質結構、調控基因表達及調控應激反應等多種功能^[25]。組蛋白H4（H4）是染色體中含量最少的組蛋白之一，主要位于染色體的軸心位置，對染色體的穩定性和DNA的包裝具有重要作用，同時還可結合特定轉錄因子以調節基因表達^[26]。本研究結果表明，在冷刺激下，lncRNA5791可能通過與這3種蛋白互作，參與調控鈣離子轉運以及維持染色質結構的穩定性。

4結論

lncRNA5791在冷刺激處理的民豬背部脂肪和腹股溝脂肪中相對表達量較高，在臀部脂肪中相對表達量較低。冷刺激處理后豬不同部位脂肪中lncRNA5791的相對表達量均極顯著高于常溫對照（Plt;0.01）。lncRNA5791定位于豬的9號染色體，其在細胞核和細胞質中均有分布。在脂肪細胞增殖期，lncRNA5791的表達持續受到抑制；在脂肪細胞分化期，lncRNA5791的相對表達量呈現先升高后下降的趨勢，在第4d時相對表達量最高。lncRNA5791可能與膜聯蛋白A2（ANXA2）、泛素A52殘留核糖體蛋白融合產物1（UBA52）和組蛋白H4（H4）互作。

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（責任編輯：成紓寒）