基于轉錄組挖掘葉用萵苣中花青素生物合成代謝關鍵基因

收稿日期：2024-06-27

基金項目：青海省科學技術廳重點研發與轉化計劃項目（2024-NK-106）

作者簡介：姜永強（1998-），男，安徽滁州人，碩士研究生，主要研究方向為蔬菜生理與分子育種。（E-mail）jiangyongqiang0951@163.com

通訊作者：孫雪梅，（E-mail）13997091543@163.com

摘要：為探究調控葉用萵苣葉片花青素合成的主效基因，本研究對葉用萵苣大速生（綠色）和紫霞（紫色）的轉錄組數據進行分析。結果表明，大速生和紫霞比較組中共檢測到7232個差異表達基因，其中相對表達量上升基因4214個，相對表達量下降基因3018個。KEGG數據庫富集分析結果表明，富集到代謝過程中的差異表達基因最多，花青素生物合成和次生代謝產物-其他抗生素生物合成通路中差異表達基因富集程度較高。在大速生和紫霞比較組中共鑒定到55個轉錄因子家族，差異表達基因大多數屬于MYB、bHLH、C2C2和AP2/ERF轉錄因子家族基因。從MYB轉錄因子基因中篩選出log2FC絕對值較大的LOC111917799，命名為LsMYB1基因。瞬時表達試驗結果驗證了LsMYB1基因可以調控花青素的生物合成。本研究結果為葉用萵苣葉色的分子遺傳機理及進一步的基因功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：葉用萵苣；花青素；轉錄組；差異表達基因

中圖分類號：S636.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2025）01-0150-11

IdentificationofkeygenesinvolvedinanthocyaninbiosynthesisinLactucasativaL.basedontranscriptomeanalysis

JIANGYongqiang^1，2，WANGLihui^1，2，SUNXuemei^1，2

（1.AcademyofAgricultureandForestrySciences，QinghaiUniversity，Xining810016，China;2.QinghaiKeyLaboratoryofVegetableGeneticsandPhysiology，Xining810016，China）

Abstract：InordertoexplorethemajoreffectivegenesregulatinganthocyaninsynthesisinLactucasativaL.，thisstudyanalyzedthetranscriptomedataofDasusheng（green）andZixia（purple）.Theresultsshowedthatatotalof7232differentiallyexpressedgenesweredetectedinthecomparisongroupofDasushengandZixia，including4214geneswithincreasedrelativeexpressionand3018geneswithdecreasedrelativeexpression.TheresultsofKEGGdatabaseenrichmentanalysisindicatedthatthemostdifferentiallyexpressedgeneswereenrichedinthemetabolicprocess，andtheenrichmentdegreesofthedifferentiallyexpressedgenesinanthocyaninbiosynthesisandsecondarymetabolite-otherantibioticbiosynthesispathwayswererelativelyhigh.Atotalof55transcriptionfactorfamilieswereidentifiedinthecomparisongroupofDasushengandZixia.MostofthedifferentiallyexpressedgenesbelongedtotheMYB，bHLH，C2C2andAP2/ERFtranscriptionfactorfamilygenes.LOC111917799withalargerabsolutevalueoflog2FCwasscreenedoutfromtheMYBtranscriptionfactorgenesandnamedasLsMYB1.ThetransientexpressionexperimentverifiedthattheLsMYB1genecouldregulatethebiosynthesisofanthocyanins.Theresultsofthisstudylayafoundationforthemoleculargeneticmechanismofleafcolorinleaflettuceandfurtherresearchongenefunction.

Keywords：LactucasativaL.；anthocyanins;transcriptome；differentiallyexpressedgenes

葉用萵苣（LactucasativaL.）俗稱生菜，屬于菊科萵苣屬，為一年生或二年生草本植物，起源于地中海沿岸。葉用萵苣的種植面積逐年擴大，現已成為全球消費量最大的蔬菜之一，深受消費者喜愛^[1-2]。葉用萵苣葉片富含維生素C、維生素E、葉酸、多酚和膳食纖維等營養成分^[3-4]，能夠刺激胃液分泌，促進腸道蠕動，增強消化吸收功能，預防便秘，因此它被譽為“減肥蔬菜”^[5]。根據葉片顏色，葉用萵苣可分為綠葉葉用萵苣和紫葉葉用萵苣兩大類，其中紫葉葉用萵苣富含花青素^[6]，這種天然色素不僅賦予了葉片獨特的紫色，還具有抗氧化功能^[7-10]。

花青素是類黃酮的一種，是廣泛存在于高等植物中的水溶性次生代謝物。它不僅為果實與花朵增添了鮮艷的色彩，還能吸引傳粉昆蟲和鳥類，促進花粉與種子的傳播，從而為植物的繁殖和遺傳多樣性做出貢獻^[11]。花青素主要分布于植物細胞的液泡中，能提高植物抗逆能力，如耐寒、耐旱及耐鹽能力^[12]。花青素的生物合成經過苯丙烷生物合成途徑^[13]，涉及多個結構基因^[14]。同時，轉錄因子MYB、bHLH和WD40通過相互作用形成MYB-bHLH-WD40（MBW）復合體，該復合體能夠調控花青素生物合成途徑中關鍵結構基因的轉錄，在多種植物中具有高度保守性^[15]。

轉錄組測序（RNA-seq）技術利用高通量測序方法，對細胞或組織內的mRNA、小RNA（SmallRNA）以及非編碼RNA（No-codingRNA）等轉錄本進行全面或部分測序與分析，從而揭示基因表達的動態變化及其調控網絡^[16-17]。轉錄組測序技術能夠解析基因與生物性狀之間的關聯性，是研究基因表達調控機制強有力的工具^[18-20]。目前花青素的生物合成途徑已被深入研究。Zong等^[21]通過轉錄組數據找到調控枸杞花青素合成的MYB轉錄因子，該轉錄因子能夠促進花青素的生物合成，在轉基因番茄中，MYB轉錄因子的功能也得到了驗證。Li等^[22]對比了獼猴桃紅肉品種與綠肉品種的轉錄組數據，篩選出6種與花青素生物合成途徑密切相關的基因。Tian等^[23]通過分析海棠葉片的轉錄組數據，篩選出在低溫和高光照脅迫條件下誘導花青素積累的差異表達基因。第二代測序技術以其高通量和高效率的特點，極大地推動了不同顏色植物組織中差異表達基因的篩選。本研究擬以葉用萵苣大速生和紫霞為試驗材料，利用IlluminaNovaSeq進行轉錄組測序分析，探究葉用萵苣葉片顏色形成的關鍵基因。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗選用大速生（綠色葉用萵苣）和紫霞（紫色葉用萵苣）2個萵苣品種，種植于青海大學園藝創新基地（36°43′6″N，101°45′15″E）。在萵苣成熟期，選取長勢一致的植株，取莖基部向上第4片葉，每個品種設3個生物學重復。葉片立刻用液氮冷凍，于-80℃冰箱保存。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取利用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit總RNA提取試劑盒，提取大速生和紫霞葉片的總RNA。利用Nanodrop濃度測定儀測定提取到的RNA濃度。并通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和純度，確保提取的RNA的質量滿足文庫構建和高通量測序試驗的要求。

1.2.2轉錄組文庫的構建和測序利用含胸腺嘧啶的Oligo（dT）磁珠技術，從總RNA中選擇性富集真核生物mRNA。富集的mRNA被隨機打斷形成一系列mRNA短片段，隨后以這些mRNA短片段作為模板，合成雙鏈cDNA。利用PCR技術對雙鏈cDNA片段進行擴增，構建cDNA文庫。新構建的cDNA文庫經Qubit2.0熒光定量儀進行定量分析，并使用Agilent2100生物分析儀檢測插入片段的大小。完成這些步驟后，使用IlluminaNovaSeq6000平臺進行高通量測序。轉錄組文庫的構建和測序工作由南京集思慧遠生物科技有限公司完成。

1.2.3測序數據組裝與分析對原始測序數據進行質量過濾，去除測序過程可能引入的低質量序列和低復雜性區域。僅保留高質量的序列用于后續的數據分析。剔除低質量數據后，對剩余的高質量序列進行數據組裝。利用HISAT2軟件^[24]將過濾后的高質量序列與參考基因組和基因注釋文件（基因登錄號：GCF_002870075.4）進行比對，對比對結果進行基因注釋。

1.2.4差異表達基因分析本研究利用DESeq2軟件^[25]對轉錄組數據進行定量分析，得到大速生與紫霞之間的差異表達基因。設定的篩選閾值為，log2FC的絕對值≥1，假發現率（FDR）＜0.05。FC表示差異倍數。

1.2.5差異表達基因功能注釋、分類和花青素合成代謝通路分析為了對篩選出的差異表達基因進行全面分析，結合多個公共數據庫資源，對差異表達基因的功能進行注釋和分類。數據庫主要包括非冗余蛋白氨基酸序列數據庫（NR）、蛋白質氨基酸序列數據庫（SwissProt）、真核生物蛋白相鄰類的聚簇（KOG）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）、基因本體（GO）、同源蛋白簇（COG）和Pfam。將大速生與紫霞品種間顯著差異表達的基因進行功能定位，并進一步利用GO數據庫和KEGG數據庫對差異表達基因進行分類和通路分析，重點篩選和收集與花青素生物合成密切相關的基因。對花青素生物合成途徑中關鍵基因的每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數（FPKM）值進行分析，比較它們在品種中的表達水平，并計算基因表達差異倍數。

1.2.6結構基因相對表達量測定從2個品種的葉用萵苣中提取總RNA，通過凝膠電泳技術檢測RNA質量，以確保其完整性和純度。提取的總RNA使用天根反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，并將濃度稀釋50倍。設計各基因引物，以葉用萵苣18SrRNA作為內參標準，各引物序列如表1所示。以綠色葉用萵苣大速生品種作為對照，利用2^-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。為確保試驗結果的可靠性，進行3次生物學重復，利用Graphpadprims9.5軟件繪制圖表。

1.2.7候選基因瞬時表達驗證以紫霞品種RNA反轉錄得到的cDNA為模板，通過PCR技術擴增目標基因并將其克隆。隨后，利用雙酶切法將目標基因插入過表達載體pCAMBIA2300s，構建重組質粒。將重組質粒轉入農桿菌感受態細胞GV3101中備用。將含有目的基因的農桿菌在LB液體培養基中培養，培養液的OD600調至0.6～0.8。選擇5周齡的Samsun煙草幼苗，注射培養液。

2結果與分析

2.1RNA-Seq測序數據統計分析

如表2所示，各品種高質量read的堿基數≥5.67Gb，質量值≥20的堿基所占的百分比（Q20）和質量值≥30的堿基所占的百分比（Q30）＞92%，比對到參考基因組的高質量read所占比例為89.05%～96.16%。結果表明，Illumina測序數據質量合格，可靠性較高，可用于下一步分析。

2.2差異表達基因

FPKM值是轉錄組分析中的重要參數，可揭示基因表達的豐度差異，從而幫助篩選出在不同品種間差異顯著的表達基因。以log2FC絕對值≥1且錯誤發現率（FDR）＜0.05作為篩選標準，共篩選出差異表達基因7232個，其中相對表達量上升基因4214個，相對表達量下降基因3018個。相對表達量無顯著差異基因16295個。對差異表達基因進行層次聚類分析，如圖1所示，每個品種的3個生物學重復聚成一簇，表明重復性較好，數據的可靠性高。

2.3差異基因功能注釋統計

通過蛋白質氨基酸序列數據庫（SwissProt）、基因本體（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）、同源蛋白簇（COG）、真核生物蛋白相鄰類的聚簇（KOG）、Pfam和非冗余蛋白質氨基酸序列數據庫（NR）對差異表達基因進行分析，分別注釋到4874、4523、2187、1868、2749、4913和5846個蛋白質。

2.4差異基因GO注釋

對差異表達基因進行GO注釋分析，如圖2所示，這些基因根據其功能和屬性被分為生物過程（Biologicalprocess，BP）、細胞組分（Cellularcomponent，CC）、以及分子功能（Molecularfunction，MF）。在生物過程中，共注釋到12622個基因；在細胞組分中，共注釋到15302個基因；在分子功能中，共注釋到6031個基因。紫霞和大速生的差異表達基因富集到52個GO條目，其中43個GO條目為差異表達基因顯著富集條目。在生物過程中，3039個基因與細胞過程相關，2908個基因與代謝過程相關。在分子功能中，3516個基因與亞細胞結構的調控相關，3511個基因與細胞成分相關，2499個基因與細胞器功能相關。

2.5差異基因KEGG富集分析

如圖3所示，KEGG通路富集分析將差異表達基因分為6個類別。在細胞過程中，共注釋到55個基因。在環境信息處理過程中，共注釋到122個基因。在遺傳信息處理過程中，共注釋到403個基因。在代謝過程中，共注釋到830個基因。在有機系統類別中，共注釋到71個基因。在人類疾病中，僅注釋到6個基因。如表3所示，通過KEGG數據庫富集分析，從篩選出的顯著差異表達基因中確定其所屬的代謝通路或生物學過程，最終篩選出富集程度最高的前20條通路。其中花青素生物合成和次生代謝產物-其他抗生素生物合成通路中差異表達基因富集程度最高。

2.6轉錄因子分析

轉錄因子在植物生長和代謝過程中具有重要的調控作用。如圖4所示，在大速生和紫霞比較組中，共鑒定到55個轉錄因子家族，對應442個差異表達基因。其中差異表達基因數量較多的轉錄因子家族為AP2/ERF（44個）、MYB（39個）、C2C2（32個）和bHLH（30個）。而VOZ、TUB、SRS、Rcd1-like等轉錄因子家族對應的差異表達基因數量最少，僅1個。

2.7花青素合成代謝相關基因的表達差異分析

如表4所示，通過轉錄組數據分析，篩選到19個可能與花青素合成相關的候選基因，包括bHLH基因（2個）、MYB基因（8個）以及關鍵結構基因（9個）。這些基因在紫葉葉用萵苣中的表達量高于綠葉葉用萵苣。通過數據庫篩選、比對發現，對于bHLH基因，LOC111892911的功能已知，LOC111920837在紫葉葉用萵苣和綠葉葉用萵苣中表達差異不顯著。對于MYB基因，LOC111893240的log2FC絕對值最大，但是該基因的功能已知。LOC111917799的log2FC絕對值較大，為2.4441，且LOC111917799幾乎不在綠葉葉用萵苣中表達。因此最終選擇LOC111917799作為候選基因，命名為LsMYB1。

通過計算FPKM值，對花青素合成途徑中基因表達差異進行分析。以大速生的轉錄組數據作為基準，紫霞中，涉及花青素合成的關鍵結構基因表達量顯著高于大速生。如圖5所示，紫霞DFR基因的相對表達量是大速生的3729.83倍。紫霞CHS基因的相對表達量是大速生的55.89倍。花青素合成途徑中關鍵基因的高表達可能是紫霞葉用萵苣花青素積累顯著高于大速生葉用萵苣的主要原因。

2.8紫霞和大速生比較組中花青素合成關鍵結構基因的相對表達量

依據差異基因篩選結果，以葉用萵苣的18SrRNA作為標準化的內參，采用實時熒光定量RT-qPCR測定大速生和紫霞中花青素合成相關結構基因的相對表達量。以大速生相對表達量作為對照，結果表明，紫霞中苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）、查爾酮合成酶基因（CHS）、查爾酮異構酶基因（CHI）、黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）、二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）和類黃酮3′5′-羥化酶基因（F3′5′H）相對表達量均高于大速生。其中，DFR基因的相對表達量差異最大，表明其在花青素合成途徑中具有關鍵作用，F3′5′H基因的相對表達量差異最小，該結果與轉錄組數據一致（圖6）。

2.9候選基因功能驗證結果

將LsMYB1基因注射到Samsun煙草葉片的特定區域，注射點周邊區域呈現紫色。這一結果表明，LsMYB1基因在花青素合成中具有關鍵作用（圖7）。

3討論

高通量轉錄組測序技術能夠深入探究基因表達的差異性，并揭示其背后的調控機制，從而幫助理解這些變化如何影響細胞功能^[26]。在生物體面臨應激反應時，差異表達基因表達水平會發生顯著的變化。對這些基因進行深入研究，不僅有助于闡明其生物學功能，還能為揭示相關的分子機制提供重要的數據支持^[27]。葉用萵苣種植面積較廣，據2018年統計數據，全球葉用萵苣的收獲面積超過1.27×106hm2，總產量達到2.73×107t^[28]。紫色葉用萵苣富含花青素，花青素不僅可以增加植物自身的抗逆性，還在藥用和保健領域具有重要價值^[29]。

花青素是類黃酮代謝途徑的重要分支產物，其生物合成受到多個轉錄因子的調控。轉錄因子的分離和功能鑒定完善了花青素生物合成的調控網絡，并為花青素的應用提供了理論依據^[30]。花青素的生物合成調控涉及多個關鍵轉錄因子，其中包括MYB、bHLH和WD40。這些轉錄因子通過相互作用和協同效應，構成了一個錯綜復雜的調控網絡^[31]。MBW復合體在花青素合成調控中起著至關重要的作用，WD40蛋白是構成MBW復合體的核心部分。研究結果表明，所有已知的WD40蛋白均參與MBW復合體的組裝。bHLH轉錄因子主要通過與MYB轉錄因子的相互作用，調控二氫黃酮醇還原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）等關鍵酶的表達。在MBW復合體中，bHLH轉錄因子能夠同時與MYB轉錄因子和WD40蛋白發生相互作用，調控花青素的生物合成。MYB轉錄因子在植物不同組織，如葉片^[32]、果實^[33]和花朵^[34]中的表達模式表現出顯著特異性。果實外皮與內部的花青素積累以及花瓣的色彩變化，均受到特異性MYB轉錄因子的精確調控。此外，果實內花青素的累積不僅由遺傳因素決定，還受到光照、溫度等非生物因素的影響。這些環境因子通過信號轉導途徑激活特定的MYB和bHLH轉錄因子，從而參與花青素生物合成的調控，使植物能夠響應外界環境變化。深入研究非生物因子如何通過轉錄因子影響花青素代謝，對于揭示植物環境適應機制以及創新作物改良策略具有重要意義。

4結論

本研究以大速生（綠色葉用萵苣）和紫霞（紫色葉用萵苣）為試驗材料，對轉錄組數據進行分析。結果表明，大速生和紫霞比較組中共檢測到7232個差異表達基因，其中相對表達量上升基因4214個，相對表達量下降基因3018個。KEGG數據庫富集分析結果表明，富集到代謝過程中的差異表達基因最多，花青素生物合成和次生代謝產物-其他抗生素生物合成通路中差異表達基因富集程度較高。在大速生和紫霞比較組中共鑒定到55個轉錄因子家族，差異表達基因大多數屬于MYB、bHLH、C2C2和AP2/ERF轉錄因子家族基因。從MYB轉錄因子基因中篩選出log2FC絕對值較大的LOC111917799，命名為LsMYB1基因。瞬時表達試驗結果驗證了LsMYB1基因可以調控花青素的生物合成。

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（責任編輯：成紓寒）