猴痘病毒進化及檢測技術研究進展

2025-03-12 00:00:00周萍祝賀趙曉娜蘇志同陸冠亞

新農民 2025年5期

摘要：猴痘是一種人畜共患的以皮膚出疹為特征的病毒性傳染病。隨著全球對猴痘病毒的關注度不斷提高，對猴痘病毒檢測技術的需求也日益增強。本文將對猴痘病毒演變過程及目前主要使用的猴痘病毒的檢測方法，進行歸納并對其檢測技術的優缺點和發展方向進行概述。

關鍵詞：猴痘；進化；檢測方法；優缺點

猴痘（MPXV）是一種脫氧核糖核酸病毒，國際病毒分類委員會將猴痘病毒分類為脊索病毒亞科、正痘病毒屬。猴痘潛伏期通常為7～14 d，最多可達21 d。猴痘病毒的感染期有三個階段，分別是潛伏期、發病期和皮疹期。從MPXV發現以來，病原學和血清學的檢測方法占主導地位，本文將對猴痘病毒演變過程及重點介紹常見的猴痘病毒檢測方法，并對其優缺點進行歸納總結，最后對猴痘病毒檢測技術的發展方向進行闡述。

1 猴痘病毒的進化

1.1 病毒的起源與分類

1958年首次在實驗猴體內分離得到，嚙齒類動物包括非洲松鼠、睡鼠、岡比亞袋鼠等都疑似是其自然宿主。1970年首次在剛果的一名男嬰體內發現，隨后確認了人與人之間的傳播。猴痘病毒是由兩個遺傳支系組成：支系I（中非或剛果盆地支系）和支系II（西非支系），后者被認為是2022年全球非地方性流行區暴發的主要亞型，病死率較低，而其中剛果盆地分支毒力更強，更容易導致人際傳播。據記載，猴痘病毒西非分支的病死率約為1%，其剛果盆地分支的病死率可能達10%。支系II又分為lla和llb，Clade l分為傳統的l和最新出現的變異株lb。

1.2 病毒的傳播與變異

猴痘病毒主要通過直接接觸感染動物的病變滲出物、血液、其他體液，或被感染動物咬傷、抓傷而傳播給人類。人與人之間則主要通過密切接觸傳播，也可通過飛沫傳播，接觸被病毒污染的物品也有可能感染。猴痘病毒暴發主要集中在男男性行為者，截至2024年7月31日，在WHO報告中，85.5%為男性（見

圖1），2024年2月1日—8月27日報告的病例報告表中，95%（367/386）的病例自稱是與男性發生性行為的男性。在已報告的所有傳播類型中，性接觸傳播最為常見，占所有報告的388起傳播事件中的363起（93.6％）（見圖2）。

2023年，猴痘病毒出現了新的變異株，如“分支Ib”變異株。變異株lb出現在DRC，并迅速傳播到鄰國，這是譚德塞第二次宣布PHEIC的主要原因。根據非洲CDC的報告，DRC報告的猴痘病例中，有2.9%的病死率。這種變異株的傳播能力更強，甚至可以通過呼吸道飛沫傳播，增加了防控的難度。

1.3 全球疫情的發展

猴痘病毒起初在非洲西、中部的熱帶雨林地區流行，直到2003年第一次在美國報道，這是第一次在除非洲以外的地方暴發的猴痘疫情。2022年5月開始，許多國家陸續通報了猴痘確診病例，區域范圍遍布于歐洲、美洲、非洲以及東南亞。至此，人們才真正意義上認識到猴痘。WHO數據顯示，2022年1月1日開始，非洲20個會員國向世衛組織報告了猴痘病例。截至2024年9月1日，共6 294例實驗室確診病例，包括54例死亡，已向世衛組織報告。新毒株分支lb比2022年流行的分支ll毒株更具傳播性。不僅在剛果內部傳播，還擴散至布隆迪、肯尼亞、盧旺達和烏干達等先前從未報告過猴痘病例的國家或地區。

世界衛生組織最新全球猴痘趨勢報告顯示，全球受影響最嚴重的10個國家合計占80%全球報告的病例。自2022年1月1日起，世衛組織所在的6個區域已有121個成員國向世界衛生組織報告了猴痘病例。截至2024年7月31日，共向世衛組織報告了103 038例實驗室確診病例和186例可疑病例，包括53例死亡。

2 MPXV的檢測方法

2.1 電鏡觀察

電子顯微鏡（EM）可用來觀察皮疹、水皰液和結痂中的病毒顆粒，在電子顯微鏡下，猴痘病毒直徑（200～250 nm）相對較大，被脂蛋白包膜和線性雙線DNA基因組包裹。因此，使用電子顯微鏡對新病毒的發現是非常重要的，可以為進一步鑒定作出指示。

電鏡觀察的優點也在于不需要使用特異性生物試劑就可直接觀察，但其敏感度較低，且要求樣本中有足夠量的病毒顆粒，另外，電鏡技術需要配備昂貴的儀器設備并需要專業操作人員，且考慮到樣品制備不僅耗時還復雜，大規模樣品檢測上不適用。因此，該方法不適合用作MPXV的常規檢測技術。

2.2 病毒分離培養

病毒分離培養法是檢測病毒性疾病的傳統方法。病毒分離培養方法主要用于動物接種、雞胚接種和組織培養，該方法可以確定病毒的分類。猴痘病毒可來源自兔子、大鼠、老鼠和非人類靈長類動物等。研究表明，MPXV在哺乳動物細胞和組織中生長良好，接種病毒后通過EM進行觀察，隨后可使用免疫熒光和特異性抗體識別病毒顆粒。因此，病毒分離與鑒定對于研究新疾病、新病毒以及疫苗的研發有一定的研究意義。

病毒分離培養的結果雖然準確，但檢測周期較長。MPXV對實驗室的生物安全要求較高，需要有專業技術人員在生物安全三級實驗室中進行分離培養操作。因此，一般不建議開展MPXV病毒培養。

2.3 血清學檢測方法

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）在多種細菌和病毒等疾病的診斷中應用最廣。ELISA可用作檢測MPXV血清抗體的首選方法。雖然ELISA方法操作簡單，不需要特殊設備，但操作時也需要注意抗體濃度、孵育時間以及環境溫度等對結果會產生影響的因素。有關研究表明，ELISA對于檢測猴痘病毒感染的5 d和8 d后血清中的特異性IgM和IgG抗體相對較好。但MPXV與痘病毒之間存在抗原交叉反應，其特異性較差，該方法對于大規模高危人群的血清流行病學調查有一定的指導性作用。

早在1971年，ELISA首次被報道建立。ELISA對于醫護人員等保護性較好，而且操作簡便，能夠快速檢測大量樣本，而缺點是特異性相對較低，容易受到其他病毒感染的干擾，出現假陽性或假陰性結果。

2.4 分子生物學檢測方法

2.4.1 PCR檢測技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是猴痘病毒確診的“金標準”。它具有靈敏度高、定量準確、反應速度快等優點。早在1995年，Ropp等[1]就發現編碼血凝素（HA）蛋白的基因組序列可以作為靶標，利用該區域特異性的PCR引物鑒定正痘病毒（OPV）。然而，由于所有OPV都含有血凝素，因此該方法不能特異性地鑒定MPXV。為了改進傳統PCR對MPXV的檢測，Meyer

等[2]報道，在PCR檢測中，可以利用編碼A型包涵體蛋白（ATI）的基因將MPXV與其他 OPV區分開來。后來，Neubauer等[3]在ATI基因中發現每個MPV毒株均含有8bp缺失，并通過實驗證明，該缺失可用于PCR對MPXV的特異性檢測。孔玉方等[4]利用猴痘病毒的靶基因片段F3L保守區域，設計出一對特異性引物和一條探針，成功建立了RT-PCR檢測方法，其重組質粒標準品的最低檢測限為36.5 copies/μL，實驗結果表明，該方法能有效檢測MPXV，與其他正痘病毒無交叉反應。與傳統PCR相比，實時PCR具有更高的檢測速度、靈敏度和特異性。疑似病例樣本的實驗室確認是通過核酸擴增測試完成的[5]。結合感染MPXV患者的癥狀，就可以對此進行初步診斷。然而，對于采集皮損以外的標本對MPXV的診斷作用還不明確，但實驗數據顯示對多個部位樣本進行檢測可以提高靈敏度并減少假陰性檢測結果。目前已經有許多實驗室開始優化實時PCR平臺的檢測能力。Chelsky等[6]開發了一種無核酸提取的PCR方法，以提高MPXV檢測的可擴展性。這種方法可減少與傳染源進行直接接觸以及提取試劑盒使用的問題。該方法保留了原始PCR檢測的準確性和靈敏度，使其更適用于大規模檢測MPXV。2022年9月，FDA授權Quest Diagnostics生產檢測猴痘試劑盒，這是FDA批準的第一個MPXV檢測試劑盒，同時為預防和控制猴痘疫情提供了及時和有效的支持。

2.4.2 LAMP檢測技術

環介導等溫擴增技術（LAMP）能在等溫（60～65℃）

條件下，檢測時間大約為1 h內進行核酸擴增，LAMP方法是2000年后才新起，其結果只需要目或視比濁檢測，這種方法具有操作簡單、快速、特異性強、靈敏度高等的特點，提高了檢測的準確性和靈敏性，目前已在疫病防控、檢驗檢疫和食品安全等領域廣泛研究與推廣。雖然LAMP檢測技術簡單，但一般需要2對或3對引物，對于引物設計要求較高且復雜，也會引起非特異性擴增和假陽性結果，會造成污染風險提高，且與PCR方法不同的是它對儀器要求低，不需要大型或昂貴的儀器進行操作，檢測成本與PCR方法相比較低。許曉琳等[7]利用MPXV保守區OPG002 基因片段設計特異性引物，其MPXV 保守區OPG002基因片段設計特異性引物，使用LAMP技術在64℃恒溫反應60 min即可完成DNA檢測，該方法能特異性地檢出MPXV，其檢測限均為25 copies/μL，其靈敏度比傳統PCR方法高約20倍，為臨床檢測MPXV提供了有效的靶標。研究表明，LAMP技術可用于檢測MPXV的快速鑒定診斷。

3 結論

早在1958年，從最初的在猴子中發現猴痘病毒到逐漸傳播至人類，再到全球范圍內的疫情暴發，猴痘病毒不斷挑戰著人類的公共衛生體系，同時很多研究學者對其進行了很多檢測方法的研究與探索。WHO建議用PCR檢測病毒DNA作為MPXV的首選實驗室檢測方法。通過檢測方法的比較分析，從實驗室“人、機、料、法、環”等的角度考慮，最終也推薦PCR檢測方法用作實驗室檢測，但現有的PCR檢測方法依然存在著一些缺陷，未來希望有更方便、更快速的檢測方法能應用到檢測中來。具體可根據樣品及來源地去選擇不同的MPXV檢測方法，國內有GB/T 14926.64-2001和SN/T 3487-2013發布的ELISA、PCR和熒光PCR的檢測方法，適用于猴痘的流行病學調查和口岸檢疫。

參考文獻

[1] Ropp S L，Jin Q，Knight J C，et al.PCR strategy for

identification and differentiation of small pox and other

orthopoxviruses[J].Clin Microbiol，1995，33（8）：2069-2076.

[2] Meyer H，Ropp S L，Esposito J J.Gene for A-type

inclusion body protein is useful for a polymerase

chain reaction assay to differentiate orthopoxviruses[J].Virol Methods，1997，64（2）：217-221.

[3] Neubauer H，Reischl U，Ropp S，et al.Specific detection

of monkeypox virus by polymerase chain reaction[J].Virol Methods.1998，74（2）：201-207.

[4] 孔玉方，王慧煜，呂繼洲，等.猴痘病毒熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫科學，2023，53（4）：448-454.

[5] Altindis M，Puca E，Shapo L.Diagnosis of monkeypox

virus - An overview[J].Travel Med Infect Dis，2022（50）：102459.