玉米ZmIMPα基因的生物信息學分析及其在鹽脅迫下的表達模式分析

關鍵詞：玉米；IMPα基因；生物信息學分析；鹽脅迫；原核表達載體；表達模式

中圖分類號：S153：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0001-10

土壤鹽堿化對植物生長發育造成嚴重影響，一般土壤含鹽量在0.2%～0.5%時對植物生長已經不利，嚴重時導致農作物產量大幅下降，對全球糧食安全構成威脅。根據全國第二次和第三次土壤普查數據統計，我國土地包含有各類鹽堿地約9900萬公頃，約是世界鹽堿地面積的10%，目前還有蔓延趨勢，預計到2050年全球有50%的耕地面積面臨鹽堿化問題。但同時鹽堿地又是一種重要的土地資源，隨著對農作物耐鹽新品種的培育和對鹽堿地的治理與改良，鹽堿地中可耕地面積逐漸增加。

核轉運蛋白（KAP）超家族由輸入蛋白α（im-portin α）家族和輸入蛋白p（importin β）家族組成，是一類廣泛分布于真核生物、結構相對保守的蛋白。輸入蛋白α和β在細胞內共同起作用，將核糖體蛋白、轉錄因子、RNA剪接因子、DNA修復因子和病毒衣殼蛋白等通過核孔復合體運輸到核內。輸入蛋白α家族主要由3個保守結構域組成，其中，IBB結構域能與import-in β亞基結合；ARM結構域由10個串聯重復序列組成，能與含有核定位信號（NLS）的蛋白質結合，把“貨物”蛋白運往核內，而在這個過程中，GTP酶Ran被水解為RanGDP，為復合物的運輸提供了能量；第三個結構域為C-端保守結構域，與核內輸出蛋白CAS相結合，使輸入蛋白α運往胞質，重新進行下一輪的運輸。輸入蛋白α除了與輸入蛋白β共同運輸蛋白外，也可以單獨運輸蛋白，例如運輸鈣調蛋白激酶Ⅳ或人類免疫缺陷病毒Ⅰ型的Vpr蛋白；或者作為核輸入的負調節劑，例如Snail蛋白可與輸入蛋白β1結合，但輸入蛋白α也可與Snail蛋白結合，從而形成了競爭，降低運輸速度，最終負調控轉運復合物的形成。

輸入蛋白α在動物生理和病理活動中扮演著重要角色。IMPα1自身的IBB結構域可以與ARM結構域結合，精確且定向控制著蛋白的核運輸，因此其表達水平被認為是一種腫瘤細胞的標志物。輸入蛋白也與外來蛋白質轉運至宿主有關，有研究表明委內瑞拉馬腦炎病毒衣殼蛋白的核定位信號通過與importinα結合轉運至細胞核中，在核內完成組裝后感染宿主的中樞神經系統。

植物中輸入蛋白α也參與多種生理生化過程。孫瑩研究發現StCRK2與Stlmportinα2存在互作關系，推測Stlmportin α2很可能參與了馬鈴薯中水楊酸介導的抗病防御途徑：張敬奧研究發現，擬南芥核轉運蛋白AtIMPα通過影響SA、JA通路以及質外體胼胝質積累來介導擬南芥對丁香假單胞桿菌番茄致病變種的抗性：彭湘君的研究通過沉默輸入蛋白α3，導致番茄果實葉綠素降解加快和乙烯合成加速，并發現輸入蛋白α3通過調控乙烯信號轉導、色素代謝等途徑介導番茄果實成熟衰老進程；Wang等研究發現，擬南芥維持細胞壁完整性的蛋白SWO1與IMPα1和IMPα2之間存在相互作用，IMPal和IMPα2雙突變體植株根系生長受到抑制且植株對鹽脅迫更加敏感。

玉米（Zeamays）是重要的糧食作物，屬于中度耐鹽植物，土壤鹽堿化是造成其減產的主要因素之一。目前玉米KAP超家族基因中只有一個成員（importin-1）的功能被鑒定：Opaque2（O2）是一種重要的bZIP轉錄因子，在玉米籽粒發育中可以促進蛋白的生物合成，importin -1可與其相互作用從而增加Opaque2的核定位能力。關于玉米KAP超家族其他基因的功能仍然未知。本試驗對玉米輸入蛋白α家族基因進行生物信息學分析，并克隆了一個玉米輸入蛋白α基因ZmIMPα，通過實時熒光定量PCR技術分析其在鹽脅迫環境下的表達模式，同時構建pET28a-ZmIMPα重組大腸桿菌菌株，分析菌株在鹽脅迫下的生長情況，以期深入探究ZmIMPα在玉米響應鹽脅迫中的作用，并為深入研究輸入蛋白α家族基因的功能提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試玉米自交系B73、鹽敏感材料齊319和耐鹽材料81162種子由青島農業大學玉米分子育種實驗室提供，試驗中用到的大腸桿菌DH5α菌株、BL21菌株和質粒pCE2、pET28a也均由該分子育種實驗室提供。

試驗于2023年4—6月開展。選取飽滿的各品系玉米種子，經過2%次氯酸鈉消毒并于常溫下泡發，將萌發后的種子種植在青島農業大學玉米分子育種實驗室的培養箱內。培養箱內溫度為（25±2）℃，光照強度8000lx，16h光照、8h黑暗，空氣濕度70%。

1.2試驗所用引物

引物使用Primer Premier 5軟件設計，由擎科生物公司合成。引物序列如表1所示。

1.3試驗方法

1.3.1玉米IMPa基因家族的生物信息學分析通過NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.ruh.gov）、EnsemblPlants數據庫（https：//plants.ensem-bl.org/index.html）下載玉米及擬南芥、小麥、高粱、水稻和二穗短柄草的全部蛋白序列、基因組注釋文件和全部DNA序列等。擬南芥的輸入蛋白α序列使用文獻中已確定的9個序列，ZmIMPα（PF16186、PF01749、PF00514）數據模型通過Pfam數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）下載；其余物種的輸入蛋白分別利用Blastp和HMM search查找（閾值設置為Elt;10^-5），將兩者的查找結果結合起來，通過基因注釋篩選最終序列。利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析玉米IMPa編碼蛋白分子量、等電點；利用Plant-mPLoc（http：／／www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行亞細胞定位預測：利用MEGA 11中鄰接法構建序列進化樹，并利用iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）進行美化；利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）分析序列保守基序，查找基序數量為10;利用NCBI中Batch-CD search分析序列保守結構域信息。利用TBtools中Biosequence structure illustrator功能完成可視化。利用TBtools得到所有IMPα基因啟動子序列，提交PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件分析并利用TBtools進行可視化。

1.3.2 ZmIMPa基因在鹽脅迫后的表達分析 在三葉一心期時，利用200mmol/L NaCl 70 mL對齊319和81162幼苗進行灌根處理，分別在處理0、12、24、36h后取樣，放人盛有液氮的研缽中冷凍研磨。使用諾唯贊RNA提取試劑盒提取RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，使用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，以玉米actin1為內參，參考文獻[21]的方法，使用儀器Rotor-GeneQ采用三步法進行熒光定量PCR。PCR體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA 1μL，ddH₂O 8.2μL。PCR程序：95℃10 min；95℃10 s，55℃30 s，72℃30s，40個循環。采用2-^-ΔΔCt相對定量法計算基因表達量，使用DPS軟件進行數據差異性分析。

1.3.3 ZmIMPα基因的克隆 取三葉一心期的B73幼苗葉片，按1.3.2中的方法提取RNA并反轉錄為cDNA。根據NCBI網站公布的該基因（GenBank登錄號NC_050103.1）的CDS序列設計特異性引物（表1），以cDNA為模板進行體外擴增。擴增體系：2x Phanta Max Master Mix 25μL，上、下游引物各2μL，cDNA 1μL，ddH2O 20μL。PCR程序：95℃3 min；95℃15s，56℃15s，72℃48 s，35個循環；72℃5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后回收，產物連接中間載體pCE2并轉化DH5α菌株，隨后進行菌液PCR驗證及陽性克隆測序。

1.3.4原核表達載體pET28a-ZmIMPα的構建 利用快切酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切質粒pET28a，以1.3.3中構建的pCE2-ZmIMPa為模板，利用表1中一步克隆引物進行擴增并回收，通過一步克隆將回收產物連接至pET28a（pET28a 8L，回收產物1μ，Sx Ce Buffer 4μL，Exnase 2μL，ddH205μL），轉化BL21菌株并進行菌液PCR驗證。提取陽性克隆質粒進行雙酶切驗證，驗證體系包括質粒8μL、Xba Ⅰ1 μL、Sac Ⅰ lμL、10×buffer 2μL、無菌水8μL。

1.3.5 pET28a-ZmIMPα重組菌株BL21的鹽脅迫處理 分別配制含有0.6 mol/L和0.8mol/LNaCl的LB液體培養基，接種重組菌株和僅含有空載質粒的菌株，待菌液OD600值為0.6～0.8時加入100mmol/L IPTG 100μL，過夜培養，以誘導蛋白表達；次日，在37℃搖床上以200r/min振蕩培養，每小時測定一次吸光度，共測定12h。使用Microsoft Excel 2021進行數據整理與分析。

2結果與分析

2.1玉米IMPα基因家族生物信息學分析

2.1.1玉米IMPα家族基因鑒定 由表2可見，從玉米中鑒定出7個IMPa基因共15個轉錄本，其編碼蛋白的序列長度為297～625aa，分子量在32.5～64.0kDa之間，等電點（pl）為3.95～7.27。亞細胞定位預測結果顯示，有10個IMPα蛋白同時在細胞質和細胞核中定位到，其余5個僅定位在細胞質中，這與輸入蛋白α的功能相符，即定位在細胞質和細胞核的輸入蛋白α能與帶核輸入信號的“貨物蛋白”和輸入蛋白β相結合形成復合物，從而實現蛋白質從細胞質到細胞核的運輸：而只定位在細胞質中的輸入蛋白α則僅通過與細胞質中的其他蛋白質相互作用來發揮功能。

其中，Zm00001eb001150_TO01基因與其他IMPα基因不同，不屬于SPR1超家族，但其基因注釋標識為Importin subunit alpha-5，因此也將其歸類為輸入蛋白α家族成員之一。

2.1.2玉米IMPa家族成員系統發育分析與序列比對 本研究分別從玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、二穗短柄草（Brachypodium dis-tachyon）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定到7、13、5、4、5個和9個IMPα家族基因，分別有15、17、8、6、5個和9個轉錄本。利用鄰接法構建其蛋白序列的系統進化樹（圖1），可以看出除Zm00001eb001150_T001單獨聚在一個分支外，其余IMPα蛋白被分為3個亞家族，這與前人的研究相符，即IMPα家族根據其主要氨基酸相似性可分為3個亞家族。3個亞家族中，最大的亞家族包含34個蛋白，而最小的亞家族僅有10個蛋白，6個物種的IMPα蛋白在各個亞家族中都有分布：玉米和擬南芥的IMPα蛋白主要集中在最大的亞家族內，它們之間的相似性較高。其中，與本研究目的基因ZmIMPα（Zm0000leb346120_ T002）處于同一分支的成員里，擬南芥和小麥的相關基因最為豐富，尤其與Zm00001eb282820_T001、EES19061.1、XP_044460332.1、XP_044390729.1關系較近，它們可能具有相似的功能。通過DNAMAN比對部分序列，結果如圖2所示，其中紅色框為IMPa蛋白IBB結構域的3個保守基序，具有結合核定位信號的功能。

2.1.3保守基序與保守結構域分析 通過MEME網站獲得玉米IMPα家族蛋白序列的保守基序，基序查找設置為10，結合NCBI中得到的序列保守結構域信息，利用TBtools中的Gene Struc-ture View進行可視化分析，結果（圖3）顯示，玉米IMPα家族蛋白之間保守基序差異不大，不同基因之間至少有2個保守基序相同，這與前人研究發現的擬南芥IMPα基因家族在結構和功能上都比較保守相一致。Motif 3和Motif 5分別位于N端和C端，可能分別是輸入蛋白α與輸入蛋白β結合的位點或結合CAS蛋白運出細胞核進行下一輪運輸的位點。

2.1.4啟動子順式作用元件分析 通過對玉米gff3文件提取得到所有IMPα基因的啟動子序列，用PlantCare分析發現，共有35種順式作用元件，包括赤霉素和脫落酸等植物激素響應元件、低溫等非生物脅迫響應元件、水楊酸和茉莉酸甲酯響應元件、參與防御和壓力反應的作用元件以及與分生組織表達相關的元件等，預示著這些IMPα基因可能在玉米逆境脅迫響應中發揮重要作用。挑選其中有功能注釋的元件進行可視化分析，結果見表3和圖4。

2.2鹽脅迫下ZmIMPα基因的表達分析

用200 mmol/L NaCl處理三葉一心期玉米植株后，ZmIMPα在耐鹽材料81162中的表達量顯著上升，在脅迫24h達到最大值，為處理0h的1.79倍；而在鹽敏感材料齊319中，鹽脅迫后ZmIMPα的表達量顯著下降（圖5）。說明該基因在玉米中的表達受到鹽脅迫的顯著調控，而且在耐鹽材料中上調表達，在鹽敏感材料中下調表達。

2.3轉ZmIMPα基因大腸桿菌在鹽脅迫下的生長情況分析

2.3.1 ZmIMPα基因的克隆與鑒定 提取的玉米葉片RNA經瓊脂糖凝膠電泳，可以清楚地看到3個條帶且RNA完整性較好（圖6A）。ZmIMPα基因的擴增結果如圖6B所示，該基因CDS全長1590 bp；由于引物采用M13 Primer Mix，菌液PCR的最終產物長度應為1750 bp左右，由圖6C可見確實擴增得到1750 bp的條帶，而且其測序結果（圖7）也表明與NCBI公布的序列相似性為100%，證明準確克隆到ZmIMPα基因。

2.3.2重組載體pET28a-ZmIMPα的構建 目的基因ZmIMPα連接pET28a后的菌液PCR結果如圖8A所示，重組質粒pET28a-ZmIMPα的雙酶切（XbaⅠ、Sac Ⅰ）驗證結果如圖8B所示，證明目的基因已連接至原核表達載體。

2.3.3鹽脅迫下重組大腸桿菌的生長情況 將pET28a-ZmMPα重組菌株和pET28a空載菌株接種至分別含0.6 mol/L和0.8 mol/L NaCl的LB液體培養基上，于12h內每小時測一次OD600值，繪制生長曲線，結果（圖9）顯示，在鹽脅迫下，含有空載質粒的菌株能夠在含兩種濃度NaCl的培養基上正常生長，而含有重組質粒pET28a-ZmIMPα的菌株生長速度受到明顯抑制，推測ZmIMPα可能在玉米耐鹽響應時具有負調控作用。

3討論與結論

核膜將細胞質與細胞核分成兩個功能區域，保障了生命活動準確有序的進行。輸入蛋白α、β運送帶有核定位信號的“貨物”通過核孔復合體進入細胞核，從而完成信息交流。目前發現的輸入蛋白α的生物學功能主要是在抗病方面：研究發現核質運輸特別是蛋白質輸入在植物先天免疫中發揮重要作用；水稻OsWRKY62、Os-WRKY76和稻瘟病菌效應子通過新型核定位信號與OsIMala相關聯后被運輸至細胞核，以負調節防御反應；擬南芥中，IMPA2是立枯絲核菌的非宿主抗性基因，能夠喚起水楊酸途徑（SA）介導的早期免疫田；擬南芥AtIMPA接種丁香假單胞桿菌（PstDC3000）后，AtIMPα突變體中茉莉酸甲酯途徑和水楊酸途徑的合成相關基因表達受到抑制，外源MeJA處理下突變體根長較野生型受到更明顯抑制，推測輸入蛋白α可能參與到植物生長發育以及水楊酸和茉莉酸介導的抗病途徑中。輸入蛋白β被報道參與擬南芥非生物脅迫，例如擬南芥AtKPNB1基因，作為擬南芥importin β1的同源物，在ABA信號傳導中發揮作用，其無效突變增加了子葉發育過程中對脫落酸（ABA）的敏感性，而其失活顯著增強植株耐旱性；SAD2是一種輸入蛋白β家族蛋白，擬南芥sad2突變體比野生型更耐受UV-B輻射。但關于輸入蛋白α參與非生物脅迫的研究報道較少，因此對其進行研究有助于深入了解輸入蛋白家族功能機制。

本研究從玉米中鑒定出7個輸入蛋白α家族基因，共15個轉錄本，并對其進行了生物信息學分析，結果表明，這些基因編碼蛋白的序列長度為297～625aa，分子量在32.5～64.0 kDa之間，等電點在3.95～7.27之間，其中10個蛋白同時在細胞質和細胞核中定位到，其余5個蛋白僅在細胞質中定位到。另外，利用玉米、擬南芥、小麥、水稻、高粱、二穗短柄草的IMPα家族成員進行系統進化樹分析，結果表明，不同物種的IMPα家族基因數目不同，可能是因為IMPα基因在不同物種中的進化程度不同；除2m00001eb001150_T001單獨聚在一個分支外，其余ZmIMPα蛋白被分為3個亞家族，主要與擬南芥和小麥的IMPα蛋白聚在一起。啟動子區順式作用元件的分析結果顯示，在玉米IMPα基因啟動子區含有多種與激素響應、器官特異性、干旱和低溫等非生物脅迫響應等相關的順式作用元件，推測其可能在玉米激素和逆境脅迫響應中發揮重要作用。

有研究報道，擬南芥SWO1基因突變體在鹽脅迫下根伸長受到抑制，而SW01蛋白的核轉運需要IMPA1和IMPA2，因此impa1和impa2雙突變體在鹽脅迫下根的生長也受到了抑制。本研究成功克隆出一個ZmIMPα基因，熒光定量PCR分析結果顯示，鹽脅迫下，ZmIMPα基因在耐鹽玉米中表達量顯著上升，在鹽敏感玉米中幾乎不表達；構建其原核表達重組菌株，在含NaCl的培養基中生長受到明顯抑制。因此推測ZmIMPα可能在玉米幼苗響應鹽脅迫中發揮負調控作用。

輸入蛋白具有運輸蛋白、維持蛋白穩定性的功能，結合本試驗經驗，推測通過找到ZmIMPα的互作蛋白，利用反向遺傳學技術來探索ZmIMPα在鹽脅迫下的功能可能是一種有效方法。目前關于擬南芥輸入蛋白α/β在植物激素途徑中調節作用的研究取得了較大進展，這為深入了解輸入蛋白家族基因在其他調控路徑中的功能提供了方向。