某綜合性醫院血液病患者艱難梭菌感染分子流行病學回顧性研究

摘要：目的 回顧性調查4年期間某綜合性醫院血液病患者艱難梭菌感染發生情況及臨床特征，用核糖體分型技術分析艱難梭菌的分子流行病學及院內傳播的風險。方法 2019年7月—2023年7月，從血液病房患者腹瀉糞便樣本中分離出艱難梭菌；用聚合酶鏈式反應（PCR）檢測毒素基因tcdA、tcdB和二元毒素基因（cdtA、cdtB）；毛細管凝膠電泳核糖體分型技術對產毒菌株進行分型研究。結果 共分離得到130株產毒艱難梭菌，其中毒素A和B均陽性（A+B+）菌株116株（116/130，89.2%）；毒素A陰性而毒素B陽性（A-B+）菌株14株（14/130，10.8%）；130株產毒菌株中二元毒素陽性菌株7株（A+B+CDT+）（7/130，5.4%）。PCR核糖體分型將130株產毒艱難梭菌分為9個克隆群，同源性分析發現產毒素艱難梭菌在不同樓層病房之間以及同一病房不同時間有一定的流行。結論 針對免疫功能低下患者，如血液惡性疾病患者，應提高臨床醫生對艱難梭菌感染的診療意識；同時可應用相應的分子流行病學分析監測聚集性病例菌株，對污染的醫療環境進行嚴格消毒，醫護人員嚴格執行手衛生，實施有效的感染控制，從而減少艱難梭菌院內暴發流行。

關鍵詞：艱難梭菌感染；血液病；PCR核糖體分型；分子流行病學

中圖分類號：R378.8， R9 文獻標志碼：A

A retrospective study on the molecular epidemiology of Clostridium difficile infection in hematologic patients from a comprehensive hospital

Zheng Lisi1， Zhao Fan1， Zhu Jialiang2， and "Lyu Tao1

（1 State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310003; 2 Laboratory Medicine College of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035）

Abstract Objective To retrospectively investigate the occurrence and clinical characteristics of Clostridium difficile （C. difficile） infection in hematology patients in a comprehensive hospital over four years and to analyze the molecular epidemiology of C. difficile and the risk of nosocomial transmission using ribotyping. Methods " "C. difficile was isolated from diarrheal fecal samples of patients in the hematology ward from July 2019 to July 2023. Detection of toxin genes （tcdA， tcdB， cdtA， and cdtB） by polymerase chain reaction （PCR）. Toxigenic strains were typed by capillary electrophoresis （CE） ribotyping. Results A total of 130 strains of toxin producing C. difficile were isolated， of which 116 strains （89.2%） were positive for both tcdA and tcdB （A+B+）; tcdA-negative but tcdB-positive （A-B+） strains were 14 （10.8%）; and 7 strains （5.4%） were positive for binary toxin genes （A+B+CDT+） among the 130 toxin producing strains. PCR ribotyping classified the 130 toxigenic C. difficile strains into nine clonal groups， and homology analysis revealed that toxigenic C. difficile strains were prevalent between wards on different floors and at different times in the same ward. Conclusion For immunocompromised patients， such as patients with hematologic malignant diseases， clinicians' awareness of C. difficile infections should be improved. Meanwhile， molecular epidemiological analyses can be applied to monitor the strains of clustered cases， contaminated healthcare environments can be strictly disinfected， healthcare workers can strictly perform hand hygiene， and effective infection control can be performed to reduce nosocomial outbreaks of C. difficile.

Key words Clostridium difficile infection; Hematological disease; PCR ribotyping; Molecular epidemiology

艱難梭菌（Clostridioides difficile，C. difficile）是嚴格厭氧的革蘭陽性芽胞桿菌，主要通過糞-口傳播，是引起抗生素相關腹瀉（antibiotic associated diarrhea，AAD）最常見的病原體，嚴重腹瀉患者可引起偽膜性腸炎（Pseudomembranous colitis，PMC）、中毒性巨結腸甚至死亡[1]。艱難梭菌引起感染主要是由毒素介導的，其主要產生兩種毒力因子，腸毒素A（TcdA）和細胞毒素B（TcdB），此外還有一些菌株能夠產生二元毒素（CDT）[2-3]。艱難梭菌感染（C. difficile infection，CDI）目前已構成全球公共衛生緊迫威脅，歐洲國家每年約新發15萬例CDI病例，發病率約每10，000住院日3.5例，造成醫療經濟負擔高達30億歐元[4]；國內關于CDI的監測和流行病學認識尚不完全，根據國內一項薈萃研究分析，腹瀉患者中CDI發病率高達14%[5]。因此實時監測艱難梭菌感染的流行病學，及早預防控制其院內交叉傳播，對臨床治療預后，減輕醫療負擔具有重要意義。

血液系統疾病患者由于長期住院，抗菌藥物使用以及放化療引起腸道黏膜屏障破壞等原因，其CDI發生率較非血液系統疾病住院患者高6倍[6]，在不同的血液系統疾病中發生率不同，約4.8%～30.4%，尤其是血液惡性疾病（hematological malignancy，HM）患者，發生CDI的風險極高[6]。因此重視血液系統疾病患者CDI發病情況，特別是HM患者，同時監測CDI患者的艱難梭菌分子流行病學，是避免患者復發感染和交叉感染的有效手段。但根據國內目前的研究發現，臨床醫生對CDI認識度不高，對患者之間艱難梭菌交叉傳播不夠重視。

隨著分子技術的發展，目前用于艱難梭菌分子流行病學的分子分型方法較多，包括PCR核糖體分型（PCR ribotyping）和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）等；WGS方法雖然精準全面，但是其費用昂貴且費時耗力[7]；因此，歐洲疾病控制中心推薦成本低且更為快速便捷的PCR核糖體分型為艱難梭菌分子分型的參考方法[1]，該分型方法可區分具有非常相似DNA圖譜的核糖型，其中毛細管凝膠電泳（capillary electrophoresis，CE）技術被歐洲推薦為參考技術[8-9]。

基于上述因素，本研究針對發生腹瀉的血液系統疾病住院患者進行艱難梭菌檢測，明確CDI在該類患者人群中的發生情況；利用毛細管凝膠電泳PCR核糖體分型方法進行分子流行病學研究，分析潛在的傳播，為CDI監測和預防提供基礎。

1 材料和方法

1.1 艱難梭菌感染實驗室診斷和患者信息收集

對浙江大學醫學院附屬第一醫院2019年7月—2023年7月4年間血液科住院腹瀉患者進行艱難梭菌檢測，實驗室診斷方法為兩步法即谷氨酸脫氫酶（GDH）聯合毒素檢測，采用法國BioMérieux和泰科萊博試劑盒，其中GDH和毒素A/B均陽性的診斷為產毒素艱難梭菌檢測陽性；對臨床檢測為陽性的樣本，進行艱難梭菌分離和鑒定。方法如下：將約500 mg （0.5 mL）糞便與等體積的95%乙醇混合，振蕩混勻后室溫下靜置2 h；孢子選擇過后，在環絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂（CCFA，英國Oxoid公司）平板上進行篩選培養，37 ℃厭氧環境中孵育48 h；挑選淡黃色，邊緣不規則，表面粗糙有特殊氣味的菌落，通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（德國Bruker Daltonics公司）鑒定并保存；通過電子病例系統收集該菌株相關臨床信息。

1.2 相關定義

腹瀉定義：24 "h內出現3次或3次以上不成形糞便[10]。

CDI定義：腹瀉患者的糞便樣本艱難梭菌培養和毒素（TcdA和/或TcdB）均呈陽性，并排除其他腹瀉病原體（包括志賀菌、非傷寒沙門菌、彎曲桿菌和產生志賀毒素的大腸埃希菌）被診斷為CDI[10]。

社區獲得性CDI（CA-CDI）：入院48 h內且入院前12周內無住院病史或從醫療機構出院12周后發生的CDI[11]。

醫療機構相關性CDI（HA-CDI）：住院患者入院48 h后出現CDI癥狀以及醫療機構出院后4周內發生的CDI[11]。

復發CDI（rCDI）：距離上次診斷CDI后的8周內再次出現艱難梭菌感染診斷為復發CDI[10]。

1.3 聚合酶鏈反應（PCR）檢測毒素基因

分離得到的艱難梭菌，在哥倫比亞血瓊脂平板上37 ℃厭氧孵育48 h后，挑取3～5個菌落，懸浮在含500 μL蒸餾水的微量離心管中，采用簡化的堿性裂解法提取細菌基因組，即將細菌懸液在100 ℃煮沸10 min后短暫高速離心取上清液。在Mastercycler梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）中用引物NK9和NK11擴增毒素基因tcdA、NK104和NK105擴增毒素基因tcdB、cdtA-pos和cdtA-rev擴增二元毒素A基因、cdtB-pos和cdtB-rev擴增二元毒素B基因，詳細引物序列如表1所示。PCR反應體系50 μL；反應條件如下：毒素基因tcdA 95 ℃ 20 s、56 ℃ 2 min，35個循環；75 ℃延伸5 min；毒素基因tcdB 95 ℃ 20 s、65 ℃ 2 min，35個循環；75 ℃ 延伸5 min；二元毒素基因cdtA 95 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 45 s、52 ℃ 1 min、75 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃延伸 10 min；二元毒素基因cdtB 95 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 45 s、45 ℃ 1 min、75 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸 10 min[12-13]。

1.4 PCR核糖體分型

采用毛細管凝膠電泳技術進行PCR核糖體分型[14-15]。引物序列參考Bidet等[16]的方法，引物序列（CD1和CD2）見表1。PCR反應條件：反應體系50 μL；95 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 1 min、57 ℃ 1 min、75 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。擴增后的產物用全自動多功能毛細管電泳儀（Bioptic Qsep100，中國臺灣Bioptic公司）檢測，選用S1卡夾（中國臺灣Bioptic公司），根據檢測條帶導出圖譜，圖譜導入BioNumerics7.6軟件進行比對。根據系統算法進行聚類分析，將相似度100%條帶認定為同一核糖體核型。

1.5 統計學分析

采用SPSS 26.0統計學軟件進行分析。正態分布資料，計量數據用（x+s）表示；非正態分布資料，計量數據用M（Q1， Q3）表示；率的比較用χ2檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 艱難梭菌菌株毒素基因及臨床信息

2019年7月—2023年7月從血液科住院腹瀉患者進行艱難梭菌檢測的1822份不成形糞便樣本中，共分離得到130株產毒艱難梭菌，陽性率為7.1%（130/1822），其中45株來自血液病房（45/130，34.6%），85株來自骨髓移植中心病房（85/130，65.4%），病例中有1例為CA-CDI，其余都是HA-CDI。CDI患者中女性61例（46.9%），男性69例（53.1%），中位數年齡47（31.8，59）歲，其中12.3%為18歲以下患者（16/130），79.2%為18歲至65歲患者（103/130），8.5%為65歲以上患者（11/130），平均住院時間35.5（26，47.3） d；CDI患者中96.9%（126/130）診斷為血液惡性疾病，最常見疾病類型為急性髓系白血病（45/130，34.6%）、急性淋巴細胞白血病（28/130，21.5%）和多發性骨髓瘤（14/130，10.8%）。根據2019—2023年CDI病例數變化趨勢顯示，2019年開始只有零星CDI病例，隨后CDI病例數不斷增加，且分離率總體呈上升趨勢（2019年：1.8%；2020年3.1%；2021年：4.4%；2022年：8.1%；2023年：10.9%；Plt;0.001，5年分離率差異有統計學意義），具體見圖1。

分離得到130株產毒素艱難梭菌中，116株菌株毒素A和毒素B基因均陽性（A+B+）（116/130，89.2%），14株菌株只產毒素B（A-B+）（14/130，10.8%），130株產毒艱難梭菌中二元毒素CDT陽性共7株（A+B+CDT+）（7/130，5.4%）。

2.2 PCR核糖體分型結果

130株艱難梭菌遺傳多樣性豐富，未發現核糖體型聚集暴發流行；經同源性分析發現，130株產毒艱難梭菌可分為9個克隆群，其中大部分菌株屬于1克隆群（34/130，26.2%），其次為2克隆群（24/130，18.5%）、3克隆群（22/130，16.9%）和4克隆群（21/130，16.2%），77.7%的菌株屬于這4個克隆群。其中患者P2在2023年共發生3次CDI，并從糞便樣本中分別分離得到C110、C111和C115菌株，其中C110和C111菌株具有同源性，而C115菌株卻與2022年從患者P1分離的A90菌株具有同源性，提示該患者第二次復發感染其他型別菌株；但患者P1和P2無直接接觸證據。

另外菌株C94和C141、C101和C106、C139和C142之間存在同源性；經回顧患者臨床信息發現，菌株C141和C94菌株分離自同一樓層不同時期的患者P3和P4；菌株C101和C106分離自同一樓層不同病床患者P7和P8；菌株C139和C142菌株分離自同一時期不同樓層患者P5和P6；在不同時空不同患者分離菌株之間存在同源性，由此我們推測分析，可能有多個艱難梭菌克隆群在時空上發生傳播（圖2～4）。

3 討論

CDI目前仍然是常見的醫院相關感染之一，在北美地區艱難梭菌已經超越耐甲氧西林金黃色葡萄球菌成為醫源性感染最重要的病原菌[17-18]。由于HM患者的基礎疾病復雜，特別是骨髓移植化療患者有多種已知CDI危險因素，如住院時間長、抗菌藥物暴露和免疫功能抑制等，其CDI發生率遠高于其他患者，并且HM患者合并CDI會增加患者的醫療負擔，使其治療復雜化[19-20]。因此針對發生腹瀉的HM患者進行艱難梭菌感染的臨床檢測，以明確診斷和實行早發現、早治療的原則；同時加強該人群的艱難梭菌分子流行病學監測，強化院內感染防控措施，減少CDI的流行和暴發。

本回顧性研究發現，產毒素艱難梭菌在發生腹瀉的血液系統疾病住院患者中的陽性率為7.1%，與其他報道血液系統疾病患者中CDI發生率相似[6]。由于不同實驗室檢測方法不一致，本實驗采用的毒素檢測方法靈敏度較核酸擴增技術（nucleic acid amplification testing， NAAT）略低[21]，可能會漏診部分CDI患者，真實陽性率可能更高。同時本研究發現，在研究期間CDI的陽性率呈上升趨勢，這可能與本院院感科不斷加強CDI的宣教，提升臨床醫生對CDI的認識，提高腹瀉患者艱難梭菌檢測率有關。CDI患者中，主要疾病類型為急性髓系白血病和急性淋巴細胞白血病；由于免疫抑制和放化療常被用于治療急性白血病和淋巴細胞白血病患者，導致這類疾病患者腸道菌群失調，腸道黏膜相關淋巴組織和細胞免疫產生負面影響，腸道黏膜受損，易發生CDI[6，19，22]；且以往研究報道年齡gt;65歲是CDI的獨立危險因素[1]，而我們的研究顯示在血液科CDI患者中79.2%為年齡18～65歲；因此對于這類特殊疾病患者，在排除明確的腹瀉原因后，都應加強艱難梭菌感染的實驗室診斷，避免漏診，對確診患者嚴格實行隔離措施，防止易感人群交叉感染。

此次研究分離的艱難梭菌以A+B+型菌株為主，與國內許多研究報道一致[6]，但與歐美國家相比，A-B+型菌株分離率明顯更高[23]，歸因于不同地區環境主要流行菌株的不同。艱難梭菌在染色體致病性決定區外的基因編碼產二元毒素，與疾病的嚴重程度、高復發率和死亡率有關[24-25]，此次分離7株產二元毒素菌株，但尚未明確是否為高產毒核型027或078菌株，需要后續進一步研究。

毛細管電泳PCR核糖體分型被認為是艱難梭菌基因分型的金標準，具有較高的特異性和靈敏度[26]，對遺傳親緣關系的解釋與WGS具有良好的一致性[9]。本研究中一共得到9個克隆群，其中1、2、3和4克隆群涵蓋大多數的菌株。通過進一步的同源性分析，發現部分菌株之間存在相關性。結合患者的臨床相關信息，發現艱難梭菌菌株在不同患者之間、不同時空之間有傳播的可能。有研究表明，艱難梭菌芽胞能夠抵抗常用的酒精消毒劑，能夠在環境中持續存在，成為持續的傳播源[1]，污染的醫療環境可能在間接傳播中發揮重要作用，同時醫護人員之間的間接傳播也是感染的主要途徑[27]。因此實時監測CDI患者，采取有效隔離措施和個人防護，對減少交叉傳播至關重要；本院的院感科十分重視艱難梭菌院內防控，對CDI患者嚴格實施接觸隔離和手衛生等措施，如醫護人員對CDI患者進行治療或護理時使用一次性防護手套和隔離衣，摘除手套后使用速干手消毒劑并根據指南建議使用肥皂水進行手衛生[28]；在醫療條件允許的情況下，首先推薦單人單間病房隔離CDI患者，解除隔離至腹瀉癥狀消失后繼續保持接觸預防措施至少48 h，并限制人員的進出，拒絕訪客，條件不允許的情況下將CDI患者安排在同一病房或實行區域隔離[28]；CDI患者出院或轉科后，對患者使用過的床邊、設備及環境使用含氯消毒劑進行徹底清潔和消毒，床單、衣物均使用含氯消毒劑進行有效浸泡，并用紫外對病房進行消毒。

本研究利用毛細管凝膠電泳技術進行PCR核糖體分型分析不同患者不同時空分離菌株之間的同源性，進而分析交叉傳播的可能途徑，為后期CDI監測以及感染預防控制提供基礎。但是本實驗存在局限性，缺少已知型別的參考菌株，無法確定是否有RT027及RT078菌株的流行，需要后續進一步利用其他分型方法分析遺傳多樣性。其次本次回顧性研究未采集環境樣本，無法確定感染來源以及確切的傳播途徑。

4 " 總結

對排除其他明確腹瀉原因的患者進行艱難梭菌的檢測是絕對有必要的，尤其是發生CDI風險較高的免疫功能低下患者，分析艱難梭菌分子流行病學及早發現病例的聚集，避免醫院內暴發。同時對污染的醫療環境進行嚴格消毒，醫護人員嚴格執行手衛生，減少CDI傳播實施有效的感染控制。此外，國內各大醫院實驗室缺乏常規檢測艱難梭菌，對于CDI流行病學的監測和認識尚不足，希望能夠有統一的實驗室檢測方法和基因分型方法，便于各實驗室之間數據比較，建立全國范圍內的監測CDI流行病學網絡。

參 考 文 獻

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