3類健康人群抗生素耐藥基因分布特征及影響因素分析

摘要：目的 本研究旨在了解健康人群腸道中抗生素耐藥基因（antimicrobial resistance genes，ARGs）分布特征及影響因素，為耐藥防控工作提供數據支撐。方法 應用基于qPCR的TaqMan陣列卡技術檢測孕婦、藥廠工人和兒童3類人群中常見ARGs的攜帶情況，并采用多元線性回歸模型分析ARGs檢出數量的影響因素。結果 兒童與孕婦和藥廠工人中ARGs檢出數量存在統計學差異（P=0.005、P=0.004），兒童ARGs平均檢出數量最低為19種，其余兩組人群為22種。研究共檢測到12大類45種ARGs亞型，其中β-內酰胺類、大環內酯類、四環素類、磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類-林可酰胺類-鏈陽性菌素B類（MLSB）、萬古霉素類ARGs是腸道ARGs中占比最豐富的類型，硝基咪唑類、多重耐藥類和黏菌素類ARGs檢出率最低（11.46%，19.79%，20.83%）。tetM、tetS、qnrS、blaTEM和mefA等5種亞型檢出率高達100%，未檢出nimE。多元線性回歸分析中，年齡（β=0.365，Plt;0.001）與ARGs檢出數量呈正相關，食用水產品（β=0.247，P=0.009）的ARGs檢出數量高于未食用者。結論 健康人群腸道中ARGs普遍存在且檢出率較高，需要加強孕婦、藥廠工人和兒童3類人群的ARGs監測及成因研究，制定更有針對性的防控策略，以降低耐藥性發展的風險。

關鍵詞：TaqMan陣列卡；健康人群；耐藥基因；影響因素

中圖分類號：R211；R378 文獻標志碼：A

Characterization of the distribution of antimicrobial resistance genes in three groups of health populations and analysis of influencing factors

Wu Meng1，2， Guo Yumei2， Wang Ke1，2， Gao Weili2， Dong Xinyan2， and Tian Huifang2

（1 College of Public Health， North China University of Science and Technology， Tangshan 063200; 2 Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention， Hebei Key Laboratory of Intractable Pathogens， Shijiazhuang 050011）

Abstract Objective To understand the distribution characteristics and influencing factors of antimicrobial resistance genes （ARGs） in the intestines of healthy populations and provide data support for drug resistance prevention and control. Methods "The qPCR-based array card technique was applied to detect the carriage of ARGs in three representative groups of populations， namely pregnant women， drug factory workers and children， and a multiple linear regression model was used to analyze the factors influencing the number of ARGs detected. Results "There was a statistically significant difference in the number of ARGs detected in the children versus the pregnant and factory worker populations （P=0.005， P=0.004）， with the lowest mean number of ARGs detected in the children at 19 and 22 in the remaining two groups. A total of 45 subtypes of ARGs from 12 major classes were detected in the study， of which β-lactam， macrolide， tetracycline， sulfonamide， quinolone， macrolide-lincoamide-streptogramin B （MLSB）， and vancomycin ARGs were the most abundant types of intestinal ARGs， and nitroimidazole， multidrug-resistant and polymyxin ARGs had the lowest detection rates of ARGs （11.46%， 19.79% and 20.83%）. tetM， tetS， qnrS， blaTEM， and mefA 5 subtypes were detected up to 100%， and nimE was not detected. In multiple linear regression analysis， age （β=0.365， Plt;0.001） was positively correlated with the number of ARGs detected， and the number of ARGs detected was higher in aquatic product consumers （β=0.247， P=0.009） than in those who did not consume. Conclusion "The prevalence and high detection rate of ARGs in the intestinal tract of healthy populations proved the requirement of enhancing surveillance and causation studies of ARGs in three types of populations， which were pregnant women， drug factory workers and children， in order to develop more targeted prevention and control strategies to reduce the risk of bacterial resistance development.

Key words TaqMan array card; Healthy population; ARGs; Influencing factor

抗生素耐藥性（anti-microbial resistance， AMR）是當前最大的全球公共衛生危機之一[1]。據估計至2050年，由抗生素耐藥性細菌感染造成的死亡人數將超過1000萬[2]。而AMR與抗生素耐藥基因（antimicrobial resistance genes， ARGs）密切相關，ARGs的污染狀況引起了人們廣泛關注后被認定為新興環境污染物[3]，同時日益受到重視。研究發現抗生素應用日漸增多，其造成的選擇壓力極大促進了ARGs的產生[4]。目前環境、動物中已有多種ARGs被檢出，而動物中的ARGs可以通過肉類、魚類、蛋類以及乳制品等食物傳播到人體，含有ARGs的動物糞便也會作為肥料被擴散到環境中[5-6]。加之ARGs可以通過可移動遺傳元件進行水平基因轉移[7]，進一步造成其在“環境-動物-人群”遷移鏈中的傳播，嚴重威脅人群健康。然而令人擔憂的是，在健康人中已被報道發現了可抵抗多黏菌素的超級耐藥基因mcr-1變體，而多黏菌素被視為抗生素中對抗革蘭陰性菌“最后一道防線”[8-9]。值得注意的是，健康人相較于患者，更容易在不被覺察的情況下傳播超級ARGs，但是目前針對人群的耐藥性研究大多集中在醫院患病人群，健康人群中的ARGs攜帶情況極容易被忽視，尤其像孕婦、兒童和藥廠工人這些面臨更高抗性組風險的3類人群。因為孕婦和兒童對營養有更高需求從而可能會攝入更多蛋白質豐富的動物源性食品、水產品等，而耐藥細菌和ARGs在食物鏈中廣泛存在并傳播[10]，且這兩類人群屬于弱勢群體，免疫力相對普通成年人較低，更容易感染病原體。藥廠工人因為長期暴露于抗生素環境中，通過長期積累和環境選擇性壓力的不斷誘導，可能會產生大量ARGs。這些環境、飲食因素都可能會增加耐藥性風險。目前針對這些3類人群的ARGs分布情況的研究較少，尤其對于集約化生產抗生素的源頭制藥廠工人尚無調查研究數據。更重要的是，對這3類健康人群的ARGs攜帶情況目前尚無研究進行綜合表征。

目前耐藥性檢測最經典的方法是抗菌藥物敏感性試驗[11]。然而這種常規表型檢測需要先分離培養出純細菌培養物，耗時可長達3～7 d，并且不能應用于難培養的病原微生物[12]。隨著技術的發展，新興的基因型檢測包括qPCR、基因芯片和測序技術，通過鑒定ARGs來間接推測耐藥性，這種快速且靈敏的方法為臨床抗菌治療提供更早期的依據，吸引了更多研究者的目光[13]。基于qPCR的陣列卡檢測技術是依托微流控技術和qPCR技術平臺，采用384孔TaqMan探針陣列卡（TaqMan array card，TAC）的一種新型檢測技術，單卡可支持384個基因靶標同時檢測[14-15]。因為陣列卡上已預分裝包埋了所定制的干態引物和探針組，既降低人為誤差和環境污染又可以靈活地根據需求自定靶標。該技術兼具了qPCR的高靈敏度及特異性和基因芯片的高通量的優點[16]，又避免了多重PCR引物探針可能相互影響的問題，成本也遠低于測序技術。但目前國內外對此技術大多應用于檢測病原體[17-18]，在ARGs檢測領域的應用數據極為匱乏。

因此本次研究旨在應用基于qPCR的陣列卡檢測技術開展孕婦、兒童和藥廠工人3類健康人群的ARGs檢測，并選擇可能對ARGs多樣性產生影響的志愿者基本信息變量、飲食等相關因素進行多元線性回歸分析，提供帶有健康人群耐藥性水平的數據和ARGs攜帶情況及其影響因素，對耐藥防控工作和完善國家ARGs監測體系建設從而保護公眾健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本信息

本研究自2023年4月—2023年10月收集了96份石家莊市的3類代表性人群健康志愿者的糞便樣本，其中包括三甲醫院孕檢孕婦，制藥廠工人和市區小學的學齡兒童各32名，并就其年齡、性別、身高、體重、用藥史以及飲食習慣等信息進行了問卷調查。研究獲得石家莊市疾病預防控制中心倫理委員會批準，所有志愿者均簽署知情同意書且3個月內未服用或注射過任何抗生素藥物。

1.2 儀器和試劑

Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器、QuantStudioTM 7 Flex Real-Time PCR儀、384孔TaqMan Array Card，高速離心機、NanoDrop? 2000c型紫外分光光度計、Qubit4熒光定量儀和TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Thermo Fisher，美國）；QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（Qiagen，德國）。

1.3 樣品采集及基因組DNA提取

采用一次性無菌糞便采集管采集每名志愿者至少2 g糞便樣本，采集后即刻儲存至冰盒2 h內送至實驗室進行DNA提取。按照制造商的說明，使用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit提取每個樣本的微生物基因組DNA。提取后經Qubit4.0和Nanodrop 2000分光光度計評估DNA質量，符合PCR檢測要求的DNA儲存于-80 ℃。

1.4 基于qPCR的TaqMan陣列卡技術的ARGs檢測

1.4.1 TaqMan陣列卡設計

委托Thermo Fisher公司定制了48對靶標的TaqMan陣列卡，其中包括2對質控對照（16S rRNA、18S rRNA）以及46對人類腸道微生物群常見的ARGs的引物探針，基本涵蓋了大多數典型的抗生素種類，包括β-內酰胺類（20種）、四環素類（5種）、磺胺類（2種）、萬古霉素類（4種） 、MLSB類（3種）、硝基咪唑類（5種）、喹諾酮類（2種）、氨基糖苷類（2種）、甲氧芐啶類（1種）、黏菌素類（2種）、大環內酯類（1種）、多重耐藥類（1種），共12大類46種亞型。詳細亞型及內參在TaqMan陣列卡的布局如圖1所示，每張芯片可同時檢測8個樣本，每個加樣孔連通著48個獨立的PCR反應小孔，即每張微流體芯片可同時進行384個PCR反應，分別檢測8份樣本的48個靶標基因。

1.4.2 陣列卡上樣及質控

按TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix 25 μL，樣本DNA 75 μL配制PCR體系，總體積為100 μL。混合液經渦旋混勻后上樣到TAC每個加樣孔后，將其以1200 r/min離心1 min，離心兩次后密封并剪掉384孔板多余部分。將處理好的TAC放入QuantStudioTM 7Flex系統，使用以下PCR程序進行分析：25 ℃ 2 min，50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 3S、60 ℃ 1 min 40個循環。運行時間共1.5 h。當TAC測定的循環閾值（CT）值為≤34，空白對照無擴增并且內參基因全部檢出時，樣品靶向ARGs判為陽性。

1.5 統計學分析

應用SPSS 26.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（x±s）表示，正態分布的計量資料采用t檢驗和ANOVA檢驗，非正態分布的計量資料采用秩和檢驗，雙變量之間的相關性采用Spearman相關性分析。將有統計學意義的變量納入多元線性回歸模型分析影響因素，以ARGs檢出數量為因變量，以下11個因素為自變量：不同人群、年齡、性別、BMI、地區、是否食用水產品、蛋類、奶、蜂蜜、畜肉、禽肉。以逐步法為自變量的篩選方法進行分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同人群中ARGs的檢測結果

2.1.1 不同人群中ARGs檢出數量分布

96個個體的腸道樣本中ARGs檢出數量分布情況如圖2A所示，虛線為ARGs檢出數量平均值，每個個體攜帶13種以上甚至高達32種ARGs亞型，平均檢出數量為21種。其中孕婦和工人分別有21和19人超出平均值，兒童僅8人。孕婦和工人人群ARGs平均檢出種數為22種，兒童人群ARGs平均檢出種數為19種。對不同人群的ARGs檢出數量進行ANOVA檢驗分析（圖2B）可知，3組人群ARGs檢出種數總體均數存在統計學差異（P＜0.001）。兩兩比較結果為兒童人群與孕婦和工人人群存在統計學差異（P=0.005、P=0.004），兒童人群ARGs檢出數量最低。孕婦、工人、兒童人群分別檢出40、42、40種ARGs（圖2C）。

2.1.2 不同人群中ARGs檢出種類分布

3類健康人群中各ARGs種類檢出分布情況如圖3所示，共檢測到隸屬于12類抗生素的ARGs，其中與β-內酰胺類、大環內酯類、四環素類、磺胺類、喹諾酮類、MLSB類和萬古霉素類抗生素相關的ARGs是3類健康人群腸道微生物中最豐富的ARGs類型，前5種檢出率為100%。硝基咪唑類、多重耐藥類和黏菌素類ARGs較其他類型檢出率明顯偏低（11.46%、19.79%和20.83%）。

在檢測的46種ARGs中，除nimE基因未檢出外，其余45種均在不同人群中有不同比例檢出。其中tetM、tetS、qnrS、blaTEM和mefA 5種亞型檢出率高達100%。在β-內酰胺類ARGs中檢出率最高的種類為產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）類ARGs，其中blaTEM檢出最多（100%），其次是blaCTX-M（95.83%）。MLSB類ARGs中ermB檢出率最高（98.96%）。不同ARGs型的檢出率詳見表1。

2.2 3類人群中ARGs檢出數量影響因素分析

2.2.1 ARGs檢出數量影響因素的單因素分析結果

對滿足正態分布的自變量進行方差分析或t檢驗，由表2可知，不同人群、年齡、是否食用水產品、是否食用蜂蜜的ARGs檢出數量均存在組間差異。孕婦和工人人群ARGs平均檢出種數為22種，兒童人群ARGs平均檢出種數為19種，3組人群ARG檢出種數總體均數存在統計學差異（P＜0.001），兩兩比較得到：兒童人群與孕婦人群和工人人群有差異（P=0.005、P=0.004），兒童人群ARGs檢出種數最少。食用水產品和食用蜂蜜組ARGs檢出種數高于未食用組（P=0.025、P=0.025）。

2.2.2 ARGs檢出數量影響因素的相關性分析結果

Spearman相關性分析法研究ARGs檢出數量與單因素分析存在組間差異的4個影響因素，其間的相關關系及強弱情況如表3，不同人群、年齡、是否食用水產品和蜂蜜均與ARGs檢出數量之間存在相關性（Plt;0.05）。4個影響因素經共線性診斷VIF＜2，不存在多重共線性，但由于不同人群和年齡間相關系數為0.866，存在較強相關關系，故下文多元線性回歸將剔除不同人群變量，將剩余3種影響因素納入多元線性回歸模型中分析。

2.2.3 ARGs檢出數量影響因素的多元線性回歸分析結果

多元線性回歸分析結果顯示，回歸方程顯著（F=11.235，Plt;0.001），方差膨脹因子VIF=1，不存在多重共線性。D-W檢驗值為1.754，說明殘差具有獨立性。標準化殘差正態p-p圖中點在對角線直線附近分布，殘差圖中散點均勻分布，且未超過正負3，表明殘差服從正態分布且方差齊性。由表4可知，年齡（β=0.365，Plt;0.001）與ARGs檢出數量呈正相關，差異有統計學意義；食用水產品（β=0.247，P=0.009）的ARGs檢出數量高于未食用者。是否食用蜂蜜對ARGs檢出數量的影響無顯著性。這些變量共解釋ARGs檢出數量17.7%的變異（調整R2= 0.177）。

3 討論

目前在環境、動物、人類生物樣本等中均有多種ARGs檢出[19-20]，而微生物可以通過水平轉移使其在“環境-動物-人群”遷移鏈中進行傳播[21]。研究報道人類腸道微生物群已成為ARGs的重要儲存庫[22-23]。腸道中細菌種類和數量極多，尤其是具有多重耐藥基因的細菌[24-25]，它們可以通過污水等介質進入環境，從而造成更大范圍的耐藥性傳播[26]。但迄今為止，仍有多達70%的人類腸道微生物是目前技術無法成功培養的[27]。本研究應用的基于qPCR的陣列卡技術，無需經過培養直接從糞便樣本中提取DNA，避免上述問題的同時，能夠快速、靈敏、高通量地進行ARGs檢測，不僅對適用于常規人群檢測，在亟需快而準的危重患者耐藥性篩查以制定最佳治療方案上也具有重要意義。研究中定制使用的TAC檢測了46種ARGs，這些基因可以賦予如前所述12大類抗生素耐藥性，較之前呼吸道感染的危重患兒研究中使用的TAC納入的25種ARGs范圍更廣，種類更多[28]。

研究結果顯示，在3類健康人群中ARGs檢出率普遍較高，尤其是β-內酰胺類、大環內酯類、四環素類、磺胺類、喹諾酮類、MLSB類。Duan等[29]對中國健康個體和接受抗生素治療的患者的糞便樣本中的抗生素耐藥性的研究報告了類似的結果。在檢測的ARGs亞型中，tetM、tetS、qnrS、blaTEM和mefA等5種為所有樣本所共有，sul2（98.96%）、ermB（98.96%）、vanz（96.88%）和blaCTX-M（95.83%）僅次其后，表明它們在健康人腸道中十分常見。其中兒童人群中檢出13～25種ARGs，ermB檢出率為100%，遠高于英國Clark等[28]研究中60%（49/82）兒童至少檢出1種ARGs，檢出最多的ermB檢出率54%（45/82）的結果，原因可能是本研究檢測的ARGs種類更為豐富及不同地區抗生素使用模式的差異。ESBLs類ARGs檢出率最高的兩種亞型也與全球主要流行ESBLs類型為SHV、TEM和CTX-M的結果相對一致[30]。

值得注意的是，自1980年以來四環素類藥物一直被謹慎地用于治療人類疾病[31]，但本研究結果顯示四環素類ARGs在健康人群腸道中具有較高的檢出率，導致其在人類腸道中強優勢的原因可能如下：首先，抗生素耐藥性是一種固有和古老的現象，這通過在3萬年前的永久凍土中的測到四環素類ARGs得到了驗證[32]。因此推測，四環素ARGs的耐藥性可能不僅是抗生素選擇性壓力的結果，也有可能是由于ARGs通過水平轉移從而進入到人類腸道，因為在養殖場、水等環境中均出現了高水平的位于質粒上的四環素類ARGs[33]，這進一步印證了ARGs可能通過食物鏈或環境傳播給人類是導致健康人群腸道中四環素類ARGs普遍存在的重要原因。

考慮到多因素間可能會有相關性和互相作用影響，進行了多元線性回歸分析發現年齡是ARGs檢出數量的獨立影響因素，ARGs檢出數量隨著年齡的增長而增加（P＜0.01）。表明人類腸道微生物群中的ARGs可能從童年積累到成年，并隨著年齡的增長變得更加復雜。這與中國科學院的一項研究4個不同年齡組（學齡前兒童、學齡兒童、高中生、成人）的ARGs多樣性的結果一致[34]。王群等[35]發現不同年齡段患兒的病原菌種類和耐藥菌檢出率也存在明顯差異。雖然志愿者在過去3個月內未接觸過任何抗生素，但不排除他們以前接觸過的可能性，因為研究表明短期使用抗生素所選擇的耐藥細菌可以在腸道中持續數年[36]。除了年齡外，食用水產品也是ARGs檢出數量的影響因素之一，結果在Shen等[37]的多因素邏輯回歸研究中也得到了印證。該結果表明動物源性食品的消費、水產養殖發達程度和水產品的消費均為ARGs檢出風險的危險因素，對人群中ARGs的傳播發揮重要作用。盡管本研究中是否食用肉蛋奶等動物源性食品與ARGs檢出數量之間無統計學差異，與報告之間的差異可能歸因于不同地區抗生素使用模式的差異、樣本量較小、研究區域及研究人群相對集中。由于人、動物、環境中的ARGs可以互相傳播，更該應用好One Health理念，在檢測人群尤其是代表性人群中ARGs的同時關注與其相關的危險因素，因為僅通過一個部門的單一防控策略無法從根本上解決耐藥傳播問題，只有人類、動物、環境等多部門合作才能有效控制耐藥性。

目前大多數耐藥性研究多集中于臨床患病人群，由于健康人群的類型眾多，加之影響腸道耐藥基因組的因素非常復雜，使得目前對于健康人群中耐藥基因的研究數據較為匱乏，因此本研究選擇在該領域內特別關注一些特定3類人群的抗性組特征，并分析形成這種抗性組的影響因素，為更好地制定預防控制策略，評估健康人群中耐藥基因的潛在傳播風險提供了理論依據。

綜上所述，基于qPCR的陣列卡技術是同時檢測多種ARGs的重要工具，本研究應用此技術開展了健康人群腸道的ARGs檢測，結果發現在健康人腸道中ARGs普遍存在，尤其是孕婦、藥廠工人和兒童3類代表性人群中ARGs的流行情況亟需得到關注，年齡和是否食用水產品均為ARGs多樣性的獨立影響因素。故了解健康人群不同種類ARGs的分布特征及產生耐藥性的成因，對合理使用抗生素和各部門合作應對耐藥防控工作攜手保護公眾健康具有重要意義。

參 考 文 獻

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