艱難梭菌tcdA和tcdB基因絕對定量PCR方法的建立及應用

摘要：目的 建立基于SYBR染料法的能夠精確定量艱難梭菌主要毒素tcdA和tcdB基因表達量的絕對定量PCR方法，并進行應用。方法 以CD12038艱難梭菌參考菌株為研究對象，擴增tcdA和tcdB基因的部分片段，然后將二者克隆到pUC57質粒載體中進行測序鑒定。采用梯度稀釋的重組質粒為標準品，SYBR熒光染料法進行qPCR擴增，建立標準曲線。然后在4種主要的產毒性艱難梭菌流行參考菌株中驗證菌株培養后tcdA和tcdB基因的拷貝數。結果 本研究建立了能夠精確定量產毒性艱難梭菌tcdA和tcdB基因拷貝數的絕對定量PCR方法，其中tcdA基因的線性范圍為（2.71×102～2.71×109）拷貝/μL，靈敏性為（324.70±33.42）拷貝/μL，批內變異系數（CV）為0.60%～1.12%，批間CV為0.57%～0.92%。tcdB基因的線性范圍為（2.59×102～2.59×109）拷貝/μL，靈敏性為（539.05±133.28）拷貝/μL，批內CV為0.37%～1.61%，批間CV為0.84%～1.76%。2個基因的溶解曲線均呈現單一峰值，特異性良好。對4種產毒性艱難梭菌參考菌株培養24 h后的tcdA和tcdB基因拷貝數研究結果顯示，R20291（ST1/RT027）菌株的tcdA和tcdB基因表達水平最高，而其余3個菌株的表達水平較為相似。結論 本研究建立了基于產毒性艱難梭菌tcdA和tcdB基因的絕對定量PCR方法，該方法具有線性范圍廣、靈敏性高、特異性和可重復性良好等特點，為后續艱難梭菌主要毒素基因的精確定量研究提供了技術支持。

關鍵字：艱難梭菌；tcdA；tcdB；絕對定量PCR

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Establishment and application of absolute quantitative PCR method for tcdA and tcdB genes of Clostridioides difficile

Gu Wenpeng1， Jia Senquan1， Zhou Yongming1， Yin Jianwen1， Zhao Shiwen1， Zhao Xiaonan1，

Wu Yuan2， and Fu Xiaoqing1

（1 Institute of Acute Infectious Disease Prevention and Control， Yunnan Centre for Disease Control and Prevention， Kunming 650500;

2 Institute of the Communicable Disease Control and Prevention， Chinese Centre for Disease Control and Prevention， Beijing 102206）

Abstract Objective To establish an absolute quantitative PCR method that can accurately quantify the expression of toxic tcdA and tcdB genes in Clostridioides difficile based on the SYBR and carry out preliminary application. Methods The reference strain of C. difficile （CD12038） was used as the research object， and fragments of tcdA and tcdB genes were amplified， then both of them were cloned into the pUC57 plasmid vector for sequencing and identification. Gradient dilution of recombinant plasmid was used as the standard， and qPCR amplification was performed by the SYBR method to establish the standard curve. The copy numbers of the tcdA and tcdB genes were verified in four major toxic C. difficile epidemic reference strains after bacterial culture. Results The study established an absolute quantitative PCR method capable of accurately quantifying the copy number of the tcdA and tcdB genes， in which the linear range of the tcdA gene was 2.71×102～2.71×109 copies/μL， the sensitivity was （324.70±33.42） copies/μL， and the coefficients of variation （CVs） within batch were 0.60%～1.12%， with inter-batch CVs of 0.57%～0.92%. The tcdB gene had a linear range of 2.59×102～2.59×109 copies/μL， sensitivity of （539.05±133.28） copies/μL， intra-batch CV of 0.37%～1.61%， and inter-batch CV 0.84%～1.76%. The melt curves for both genes showed a single peak with good specificity. The results of the tcdA and tcdB gene copy numbers of the four prevalent C. difficile reference strains after 24 h of incubation showed that the R20291 （ST1/RT027） strain had the highest expression level of both genes， while the other three strains showed no significant difference in both genes. Conclusions In this study， an absolute quantitative PCR method based on the tcdA and tcdB genes of C. difficile was established， which had the characteristics of a wide linear range， high sensitivity， good specificity and reproducibility. It provided technical support for the subsequent study of the precise quantification of major toxic C. difficile genes.

Key words Clostridioides difficile; tcdA; tcdB; Absolute quantitative PCR

艱難梭菌（Clostridioides difficile）是一種產芽胞的厭氧菌，產毒性艱難梭菌通過分泌腸毒素A（TcdA）和細胞毒素B（TcdB）引起患者產生抗生素藥物相關性腹瀉、結腸炎或是致死性偽膜性腸炎，統稱為艱難梭菌感染（Clostridioides difficile infection， CDI）[1-3]。雖然大部分CDI感染后都有敏感的抗生素進行治療，但艱難梭菌常見的問題是治療后的復發。近年來，隨著抗菌藥物的普遍應用，艱難梭菌耐藥性增強，高致病菌株的出現，導致CDI的發病及致死率不斷升高[4]。艱難梭菌最初開始流行于發達國家和地區，近年來，隨著臨床和科研人員對艱難梭菌的日益關注、其診斷技術和水平不斷得到改進和提高，艱難梭菌的感染已在全世界呈廣泛流行的態勢，發展中國家和地區CDI的發病和死亡率等也顯示了上升的趨勢[5]。

艱難梭菌的致病機制主要與其毒素的產生有關，其致病性基因座（PaLoc）通常編碼5種蛋白質[6]。而主要毒素則是TcdA和TcdB，它們是2個大分泌蛋白，包含4個同源結構域[7]。TcdA和TcdB在氨基末端包含RHO和RAC葡萄糖基轉移酶結構域（GTD），并通過糖基化介導毒性作用，從而使目標細胞的細胞質中RHO和RAC GTPases失活。這種作用破壞了細胞骨架，并導致結腸上皮細胞之間緊密連接的分離和上皮完整性的喪失，進而導致腹瀉的發生[8-9]。對毒素基因的表達進行精確定量是研究病原體致病機制的關鍵環節。目前尚未有關于艱難梭菌tcdA和tcdB基因的絕對定量PCR方法的報道，本文旨在建立能精確定量產毒性艱難梭菌tcdA和tcdB的絕對qPCR方法，并在艱難梭菌參考菌株中對該方法進行驗證，以期為二者在艱難梭菌感染研究中提供精確定量的技術手段。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及培養

艱難梭菌參考菌株R20291（ST1/RT027，GenBank accession： CP029423）、CD12038（ST11/RT-，GenBank accession： CP033214）、CD630（ST54/RT012，GenBank accession： CP010905）和CD21062（ST11/RT078，GenBank accession： CP033216）為本實驗室保存。菌株的復蘇和培養均采用腦心浸液瓊脂（BHI）培養基（英國Oxoid公司）。艱難梭菌劃線接種于BHI平板，于37 ℃置于強塑厭氧盒（日本三菱）中厭氧培養。

1.2 試劑與儀器

BHI培養基（英國Oxoid公司）；厭氧產氣袋（日本Mitsubishi公司）；Premix Taq預混液、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ、內切酶BamHI和EcoRI（日本TaKaRa公司）；2×TSINGKE Master SYBR Green I qPCR mix-UDG、氨芐西林和引物合成（擎科公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒和細菌基因組DNA核酸提取試劑盒（北京天根公司）；CFX96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 標準質粒的構建

復蘇CD12038艱難梭菌于BHI平板，37 ℃培養后，采用細菌基因組DNA核酸提取試劑盒提取菌株的全基因組。采用tcdA和tcdB擴增引物，擴增2個基因的部分片段，引物見表1所示。其中，tcdA基因擴增（克隆）的長度為801～1580 nt之間的780 bp；tcdB基因擴增（克?。┑拈L度為3201～4000 nt之間的800 bp。擴增體系為Premix Taq 10 μL，無酶水8 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板1 μL。擴增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴增產物采用1.5%的瓊脂糖電泳，電泳條帶經切膠回收后用于后續質粒的克隆。

采用pUC57克隆載體進行質粒的構建，質粒和擴增產物采用BamHI和EcoRI分別在30和37 ℃酶切之后，超薄DNA產物純化試劑盒純化酶切后的片段。采用T4 DNA連接酶分別連接tcdA，tcdB基因片段和質粒，16 ℃連接4 h。然后轉化進入Top10感受態細胞，采用氨芐西林（Amp）平板進行陽性克隆的篩選。LB（Amp）平板置37 ℃培養24 h后，挑取陽性克隆。采用質粒提取試劑盒提取重組質粒，送擎科公司進行重組質粒的測序，驗證克隆成功。

1.4 標準曲線的建立

采用紫外分光光度計進行重組質粒的測定，根據公式：拷貝數（拷貝/μL）=6.02×1023（拷貝/mol）×質粒濃度（ng/μL）×10-9/[（載體分子量+插入片段分子量）×660]（g/mol），計算出重組質粒濃度后，連續進行10倍稀釋。tcdA的10個重組質粒梯度為（2.71～2.71×1010）拷貝/μL，tcdB的10個重組質粒梯度為（2.59～2.59×1010）拷貝/μL，以無酶水作為陰性對照進行qPCR測定。定量PCR的反應體系為2×TSINGKE Master qPCR Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol）各0.8 μL，模板1 μL，無酶水7.4 μL，總體積20 μL。擴增條件為50 ℃ 2 min；95℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 sec，40個循環；溶解曲線分析。qPCR每個樣本設置3個復孔。引物序列見表1。

1.5 定量方法的應用

R20291、CD630、CD12038和CD21062艱難梭菌參考菌株復蘇后，以PBS調節菌液濃度為1.5×

108 CFU/mL。每個菌株接種200 μL菌液于BHI液體培養基，37 ℃培養24 h。采用RNAiso Plus試劑提取4個菌株的總RNA，One Step TB Green PrimeScrip RT-PCR Kit II擴增tcdA和tcdB基因培養24 h的mRNA，引物序列見表1。根據兩個基因的標準曲線計算4個參考菌株的基因拷貝數。

1.6 評價指標

1.6.1 線性范圍

計算2個基因的曲線回歸方程，r值維持在0.99以上，以判斷方法的線性范圍。

1.6.2 靈敏性

以重組質粒進行連續10倍稀釋，并將無酶水作為陰性對照進行qPCR檢測，能區別于陰性對照的最低質粒濃度為該方法的檢測靈敏性。

1.6.3 特異性

通過對CD12038的tcdA和tcdB基因的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷該方法的特異性，同時qPCR溶解曲線進一步驗證該方法的特異性。

1.6.4 重復性

對2個高濃度（CT值在13～15）和低濃度（CT值在27～28）標準品進行相同樣本間的重復檢測3次，計算均值及變異系數（coefficient of variation，CV），計算批內重復性；連續測量7 d，在每天的不同時間進行相同樣本間的重復檢測，計算均值及CV，計算批間重復性。

1.7 統計學分析

采用GraphPad Prim 8.0軟件進行分析，數據采用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗。Plt;0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 標準質粒的構建和鑒定

對tcdA和tcdB基因進行克隆片段的PCR產物瓊脂糖電泳，結果如圖1所示。二者的擴增產物片段大小分別為780和800 bp。質粒構建完成后的測序結果經過比對，用SnapGene展示重組質粒的克隆片段特征，如圖2～3所示。圖中紅色區域分別表示pUC57質粒克隆的tcdA和tcdB基因。

2.2 建立tcdA和tcdB基因的標準曲線

以線性范圍內的tcdA基因的重組質粒為標準品，以2.71×102～2.71×109拷貝/μL，共8個濃度的標準品分別進行qPCR擴增，得到擴增曲線和標準曲線方程：Y=-3.146X + 41.31（以擴增起始拷貝數取10為底的對數值為橫坐標X，對應的循環數為縱坐標Y），擬合曲線的R2為0.9967（圖4）。以2.59×102～2.59×109拷貝/μL，共8個濃度的標準品分別進行qPCR擴增，得到tcdB擴增曲線和標準曲線方程：Y=-4.054X+ 47.53，擬合曲線的R2為0.990（圖5）。通過上述方法，成功建立了艱難梭菌tcdA和tcdB基因的絕對定量PCR方法。

2.3 評價指標

2.3.1 線性范圍

tcdA重組質粒的稀釋度在2.71×102～2.71×109拷貝/μL時，r=0.9967。tcdB重組質粒的稀釋度在2.59×102～2.59×109拷貝/μL時，r=0.990。

2.3.2 靈敏性

tcdA能區別于陰性對照的最低檢出限值，CT值為（33.42±0.13），對應的拷貝數為（324.70±33.42） 拷貝/μL。tcdB能區別于陰性對照的最低檢出限值，CT值為（36.48±0.41），對應的拷貝數為（539.05±133.28） 拷貝/μL。

2.3.3 特異性

tcdA和tcdB基因的普通PCR電泳結果顯示條帶單一，同時qPCR的溶解曲線結果表明，二者均為單一峰值（圖6），均提示該方法的特異性結果良好。

2.3.4 重復性

分別對高濃度和低濃度的標準品進行批內和批間重復性測試，計算其平均值和變異系數（CV）。tcdA的高濃度標準品CT為（15.20±0.17），批內CV為1.12%，低濃度標準品CT值為（28.27±0.17），批內CV值為0.60%。tcdB的高濃度標準品CT為（13.67±0.22），批內CV為1.61%，低濃度標準品CT值為（27.15±0.10），批內CV值為0.37%。連續測量7天的實驗數據用于展示批間重復性，結果顯示，tcdA高濃度標準品CT值為（15.28±0.14），批間的CV值為0.92%，低濃度標準品CT值為28.31±0.16，批間的CV值為0.57%。tcdB高濃度標準品CT值為（13.65±0.24），批間的CV值為1.76%，低濃度標準品CT值為（27.24±0.23），批間的CV值為0.84%。

2.4 絕對定量方法的應用

對產毒性艱難梭菌參考菌株進行了培養，提取細菌總RNA檢測tcdA和tcdB基因在這些參考菌株中的表達情況。結果顯示，在BHI培養基中培養24 h時間點，R20291菌株的tcdA和tcdB基因表達水平最高（圖7），兩個基因的平均拷貝數達（23.78×104±1.99×104） 拷貝/μL和（35.19×104±8.19×104） 拷貝/μL。其余3個菌株的tcdA和tcdB基因的表達水平較為接近。方差分析結果表明，4個參考菌株的兩個基因表達量除R20291與CD630、CD12038和CD21062具有統計學差異外（Plt;0.05），其余兩兩比較均沒有統計學差異（Pgt;0.05）。

3 討論

目前，研究基因定量的方法主要是絕對定量、相對定量和數字PCR等方法[10-12]。相對定量PCR方法需要菌株的內參基因一起進行擴增和分析，這就需要內參基因的表達量是比較恒定的，不會隨著外部環境的改變而發生較大變化。但很多研究中，隨著菌株培養條件或是靶基因發生變化，內參基因的表達水平會發生較大變化，這時候就不適宜用相對定量的方法。例如，發現艱難梭菌常用的內參基因rpoA、rpoC和16S rRNA等，隨著培養條件的改變（向培養基中添加氨基酸等物質），這些內參基因的表達變化較大，難以準確定量菌株的基因表達水平[13-14]。數字PCR是近年來發展較快的一種精確定量基因表達量的技術，但該技術需要特定的PCR擴增儀器和試劑，研究成本較高。絕對定量PCR則成為能夠對基因表達進行精確測定的有效方法之一。在本研究中，使用pUC57克隆質粒，將tcdA和tcdB基因克隆到質粒上，構建了質粒標準品，進行連續稀釋后擴增得到標準曲線，建立了基于上述兩個基因的絕對定量PCR方法。該方法的線性范圍、靈敏性和特異度以及重復性等均表現良好，可用于后續艱難梭菌基于tcdA和tcdB基因相關方面的定量研究。

同時，還發現本研究中設計的基于染料法的tcdA和tcdB引物具有較好的適用性。課題組在R20291，CD12038，CD630和CD21062中均擴增得到了條帶單一的目的片段，結合qPCR的溶解曲線，可以認為該引物具有良好的特異性。而上述這些參考菌株涉及了高毒力的RT027，RT078以及目前較為流行的ST54等流行性產毒艱難梭菌，因此認為這兩對引物同時具有良好的適用性。另一方面，該研究的定量方法的相關應用則表明，國際上公認的高毒力RT027菌株（R20291）確實在目前主要流行艱難梭菌菌株克隆群中是產毒能力最強的之一。在相同的時間內，菌株的起始菌量相當的情況下，R20291的tcdA和tcdB毒素的轉錄水平是最高的。而另外的一些參考菌株，如CD630則與RT078（CD21062）的毒素表達水平較為相似。CD630是ST54/RT012克隆群菌株，該菌株沒有二元毒素基因。而CD21062則是全套毒素基因均為陽性的RT078克隆群菌株，除了tcdA和tcdB外，同時具備cdtA和cdtB二元毒素基因[15]。因此，即使艱難梭菌菌株具備了目前所知的全部毒力基因，其主要毒素的轉錄和表達也與低毒力菌株差異不大，其致病能力的大小還受到其它多種因素的影響。

通過構建基于艱難梭菌tcdA和tcdB毒素基因的標準質粒，建立了這2個基因的絕對定量PCR方法，并進行了初步的應用。該方法具有線性范圍廣、靈敏性高、特異性和可重復性良好等特點，為后續艱難梭菌的相關研究提供了技術支持。需要指出的是，不同的實驗環境、條件和染料法試劑會對基因的標準曲線產生一定的影響。因此，研究人員在應用該方法時應建立本實驗室自己的定量曲線，以確保對目的基因的精確定量。

參 考 文 獻

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