脂氧素A4對脂多糖誘導氣道上皮細胞炎癥反應的影響

[摘要]"目的"研究脂氧素A4（lipoxin"A4，LXA4）對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導氣道上皮細胞炎癥反應的影響，并進一步探討其作用機制。方法"通過LPS刺激正常人支氣管上皮細胞（normal"human"bronchial"epithelial"cells，BEAS-2B）構建體外炎癥模型。將BEAS-2B細胞分為4組。對照組不做任何處理；LPS組：BEAS-2B細胞與100ng/ml"LPS共同孵育24h；LXA4組：100nmol/L"LXA4預處理30min；LPS+LXA4組：將BEAS-2B細胞在含100nmol/L"LXA4的培養基中預處理30min，再與100ng/ml"LPS共同孵育24h。通過細胞活性檢測試驗檢測LXA4的細胞毒性，通過酶聯免疫吸附試驗檢測細胞培養上清液中白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8及腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）的濃度，通過免疫印跡（Western"blot）法檢測細胞基質金屬蛋白酶-9（matrix"metallo"proteinase-9，MMP-9）蛋白的表達。最后用Western"blot法檢測核轉錄因子κB（nuclear"factor-κB，NF-κB）信號通路相關蛋白的表達。結果"①在藥物濃度lt;100nmol/L的情況下，LXA4對BEAS-2B細胞未產生明顯的細胞毒性。用100ng/ml"LPS刺激BEAS-2B細胞24h后，細胞培養上清液IL-6、IL-8和TNF-α的濃度與對照組相比顯著增加（Plt;0.01）。100nmol/L的LXA4預處理30min可顯著減少LPS誘導的BEAS-2B細胞產生IL-6、IL-8和TNF-α（Plt;0.05）。②與對照組比較，LPS組MMP-9蛋白的表達明顯增加（Plt;0.01）；與LPS組比較，LPS+LXA4組MMP-9蛋白的表達明顯減少（Plt;0.05）。③隨著LPS刺激時間的延長，上皮細胞胞漿p65的表達明顯減少。同時，LPS刺激BEAS-2B細胞可誘發核轉錄因子抑制蛋白κB-α（inhibitor"of"κB-α，IκB-α）降解，在刺激30min后作用最顯著。而用100nmol/L"LXA4預處理30min后，IκB-α與胞漿NF-κB"p65的表達減少程度明顯減弱（Plt;0.05）。結論"LXA4抑制LPS誘導的氣道上皮細胞炎癥介質IL-6、IL-8和TNF-α的產生及MMP-9蛋白的表達，其作用機制可能是通過抑制NF-κB信號通路實現。

[關鍵詞]"脂氧素；脂多糖；氣道上皮細胞；炎癥

[中圖分類號]"R562""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.06.008

The"effect"of"lipoxin"A4"on"lipopolysaccharide-induced"inflammatory"responses"in"airway"epithelial"cells

WU"Zhenjie

Respiratory"and"Critical"Care"Medicine"Department，"Taizhou"Hospital"of"Zhejiang"Province，"Taizhou"317000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"impact"of"lipoxin"A4"（LXA4）"on"the"inflammatory"response"in"airway"epithelial"cells"induced"by"lipopolysaccharide"（LPS），"and"to"further"explore"its"underlying"mechanism"of"action."Methods"An"in"vitro"inflammation"model"was"established"by"stimulating"normal"human"bronchial"epithelial"cells"（BEAS-2B）"with"LPS."BEAS-2B"cells"were"divided"into"four"groups."Control"group："No"treatment"was"applied;"LPS"group："BEAS-2B"cells"were"incubated"with"100"ng/ml"LPS"for"24"hours."LXA4"group："BEAS-2B"cells"were"pretreated"with"100"nmol/L"LXA4"for"30"minutes."LPS+LXA4"group："BEAS-2B"cells"were"pretreated"with"100"nmol/L"LXA4"for"30"minutes"in"culture"medium"and"then"incubated"with"100"ng/ml"LPS"for"an"additional"24"hours."Cell"viability"assays"were"conducted"to"assess"the"cytotoxicity"of"LXA4."Enzyme"linked"immunosorbent"assay"was"used"to"measure"the"concentrations"of"interleukin"（IL）-6，"IL-8，"and"tumor"necrosis"factor-α"（TNF-α）"in"the"cell"culture"supernatants."Western"blot"analysis"was"employed"to"detect"the"expression"of"matrix"metalloproteinase-9"（MMP-9）"protein"in"the"cells."Finally，"Western"blot"analysis"was"performed"to"examine"the"expression"of"proteins"related"to"the"nuclear"factor-κB"（NF-κB）"signaling"pathway."Results"①LXA4"exhibited"negligible"cytotoxicity"towards"BEAS-2B"cells"at"concentrations"below"100"nmol/L."Relative"to"control"group，"the"exposure"of"BEAS-2B"cells"to"100ng/ml"of"LPS"for"a"period"of"24"hours"led"to"a"substantial"augmentation"in"the"levels"of"IL-6，"IL-8，"and"TNF-α"within"the"cellular"supernatants"（Plt;0.01）."Pretreatment"with"100"nmol/L"LXA4"for"a"period"of"30"minutes"markedly"attenuated"the"levels"of"IL-6，"IL-8，"and"TNF-α"in"LPS-stimulated"BEAS-2B"cells"（Plt;0.05）."②Compared"with"control"group，"the"expression"of"MMP-9"protein"was"significantly"increased"in"LPS"group"（Plt;0.01）."When"compared"to"LPS"group，"the"expression"of"MMP-9"protein"was"significantly"decreased"in"LPS+LXA4"group"（Plt;0.05）."③The"expression"of"p65"within"the"cytoplasm"of"BEAS-2B"cells"exhibited"a"notable"decline"as"the"duration"of"LPS"stimulation"was"extended."Specifically，"stimulation"of"BEAS-2B"cells"with"100"ng/ml"LPS"induced"the"degradation"of"inhibitor"of"κB-α"（IκB-α），"with"the"most"pronounced"effect"observed"at"30"minutes."Following"a"30-minute"pretreatment"with"100"nmol/L"LXA4，"there"was"a"significant"reduction"in"both"IκB-α"expression"and"cytoplasmic"NF-κB"p65"levels，"yielding"statistical"significance"（Plt;0.05）."Conclusion"LXA4"exerts"inhibitory"effects"on"the"production"of"inflammatory"mediators，"including"IL-6，"IL-8，"and"TNF-α，"as"well"as"the"expression"of"MMP-9"in"LPS-stimulated"airway"epithelial"cells."The"underlying"mechanism"may"involve"the"suppression"of"NF-κB"signaling"pathway.

[Key"words]"Lipoxins;"Lipopolysaccharide;"Airway"epithelial"cells;"Inflammation

氣道上皮細胞在氣道炎癥性疾病的發生發展過程中發揮重要作用[1]。越來越多的證據表明氣道上皮屏障功能受損在慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺纖維化及肺損傷等多種氣道與肺部疾病的發病及進展過程中發揮關鍵作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌外壁的重要成分，已被廣泛應用于各種炎癥反應和氧化應激模型，包括氣道上皮細胞。白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8及腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor-α，TNF-α）等炎癥因子通過一系列的炎癥級聯反應促進基質金屬蛋白酶-9（matrix"metallo"proteinase-9，MMP-9）的表達而參與肺損傷過程[2-3]。脂氧素（lipoxins，LXs）是重要的內源性脂質抗炎介質，被譽為炎癥反應的“剎車信號”或“停止信號”[4-6]。其中脂氧素A4"（lipoxin"A4，LXA4）的研究最為廣泛。研究發現核轉錄因子κB（nuclear"factor-κB，NF-κB）通路的異常活化與炎癥的發生發展密切相關。LXA4通過調控NF-κB信號通路抑制牙齦炎、肝纖維化、骨關節炎的發生[7-9]。本研究擬探討LXA4對LPS誘導的氣道上皮細胞炎癥反應的影響，并探討其作用機制。

1""材料與方法

1.1""實驗材料

正常人支氣管上皮細胞（normal"human"bronchial"epithelial"cells，BEAS-2B）購自中國科學院昆明細胞庫；LPS購自美國Sigma公司；LXA4購自美國Cayman"Chemical公司；RPMI"1640培養基購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；酶聯免疫吸附試驗（enzyme"linked"immunosorbent"assay，ELISA）試劑盒購自上海博蘊生物科技有限公司；細胞核蛋白與細胞質蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人MMP-9抗體購自美國Abcam公司；兔抗人NF-κB"p65、核轉錄因子抑制蛋白κB-α（inhibitor"of"κB-α，IκB-α）抗體購自美國Cell"Signal"Technology公司；鼠抗人β-Tubulin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase，GAPDH）抗體購自杭州聯科生物公司。

1.2""細胞培養

BEAS-2B細胞置于37℃、5%CO2細胞培養箱中，用含10%胎牛血清和l%雙抗的RPMI"1640完全培養基進行培養。待細胞長滿培養瓶底部的70%～80%后按1∶（2～3）的細胞密度進行傳代。

1.3""實驗分組和處理

將BEAS-2B細胞分為4組。對照組：不做任何處理；LPS組：100ng/ml"LPS刺激24h；LXA4組：100nmol/L"LXA4預處理30min；LPS+LXA4組：100nmol/L"LXA4預處理30min，加入100ng/ml"LPS刺激24h。

1.4""細胞活性檢測

將處于對數生長期的BEAS-2B細胞以每孔1×104的密度接種于96孔板中，細胞鋪板后在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24h，各組加入不同濃度的藥物。BEAS-2B細胞培養24h后，每孔加入100μl無血清培養基和10μl"CCK-8溶液，培養箱內繼續孵育3h，酶標儀測定450nm處的吸光度[光密度（optical"density，OD）值]并計算細胞存活率。細胞存活率=（處理組平均OD值–空白調零組平均OD值）/（對照組平均OD值–空白調零組平均OD值）×100%。

1.5""ELISA法檢測細胞培養上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的含量

通過ELISA法檢測不同組細胞培養上清液中IL-6、IL-8及TNF-α的濃度，按說明書進行操作，使用酶標儀在450nm波長處測量各孔的OD值。根據濃度和OD值算出標準曲線的回歸方程以測算樣品濃度。

1.6""免疫印跡檢測相關蛋白表達

各組細胞加入RIPA裂解液，離心后取上清液，細胞核蛋白與細胞質蛋白提取試劑盒提取細胞核和細胞質蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度后將蛋白質煮沸變性。確定蛋白上樣量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉印至硝酸纖維素膜。室溫搖床封閉2h，孵育一抗，4℃過夜后Tween-20緩沖鹽溶液清洗3次，二抗室溫搖床孵育1h。Tween-20緩沖鹽溶液清洗3次，增強型化學發光試劑顯影，用Bio-Rad"Image"Lab軟件分析條帶OD值，作半定量比值測定分析。

1.7""統計學方法

采用SPSS"22.0及GraphPad"Prism5統計學軟件進行統計分析并作圖。實驗結果以（均數±標準差）表示，用Levene法行方差齊性檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，兩組以上比較用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""LXA4抑制LPS誘導BEAS-2B細胞IL-6、IL-8和TNF-α的產生

在藥物濃度lt;100nmol/L的情況下，LXA4對BEAS-2B細胞未產生明顯的細胞毒性。LPS組細胞培養上清液用100ng/ml"LPS刺激BEAS-2B細胞24h，細胞培養上清液IL-6、IL-8和TNF-α的濃度與對照組比較顯著增加（Plt;0.01）。100nmol/L的LXA4預處理30min，可顯著減少LPS誘導的BEAS-2B細胞產生IL-6、IL-8和TNF-α（Plt;0.05），見圖1。

2.2""LXA4抑制LPS誘導BEAS-2B細胞MMP-9蛋白的表達

免疫印跡（Western"blot）結果顯示100ng/ml"LPS刺激BEAS-2B細胞24h可顯著上調MMP-9蛋白的表達（Plt;0.01）。100nmol/L"LXA4預處理30min，可顯著抑制LPS誘導的MMP-9蛋白表達（Plt;0.05），見圖2。

2.3""LXA4對氣道上皮細胞中NF-κB信號通路的影響

為深入研究LXA4產生抗炎作用的機制，本研究進一步評估LXA4在氣道上皮細胞中對NF-κB信號通路的影響。結果顯示隨著LPS刺激時間的延長，上皮細胞胞漿p65的表達明顯減少。同時，LPS刺激BEAS-2B細胞可誘發IκB-α降解，在刺激30min后作用最顯著。用100nmol/L"LXA4預處理30min后，IκB-α與胞漿NF-κB"p65的表達減少程度明顯減弱（Plt;0.05），見圖3。

3""討論

氣道上皮細胞作為宿主與外界環境之間的通道，在保護肺組織不受外界環境刺激和維持呼吸系統正常功能的過程中發揮重要作用[10]。近年來，越來越多的研究關注氣道上皮細胞在肺部炎癥性疾病發展過程中的作用。本研究發現LXA4可抑制LPS誘導BEAS-2B細胞MMP-9蛋白的表達及炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的產生，發揮抗炎、促炎癥消退作用。TNF-α作為機體炎癥反應中最主要的促炎細胞因子，介導中性粒細胞向肺部集聚，成為肺部炎癥的特征性標志物[2]。IL-6作為急性肺損傷炎癥反應的標志物，可促進T細胞、B細胞增殖分化，與多臟器功能衰竭及預后直接相關[2]。肺損傷過程中IL-8是晚期炎癥細胞因子，IL-8的主要生物學活性是募集、激活中性粒細胞，并趨化嗜堿性粒細胞釋放組胺和白三烯。MMP-9是一種重要的金屬蛋白酶，在不同肺損傷模型中MMP-9的表達活性增加[11]。在肺損傷過程中MMP-9參與降解細胞外基質中的層黏連蛋白、纖維連接蛋白及Ⅳ、Ⅴ膠原等，破壞基膜和內皮細胞層，并使中性粒細胞向肺組織遷移和浸潤，引起更多炎癥因子的釋放，加重肺部損傷[3]。

LXs是Serhan于1984年發現的花生四烯酸重要的代謝產物，主要包括LXA4、LXB4及阿司匹林誘生型LXA4，是生物體內發揮抗炎、抗增殖、抗凋亡作用的重要內源性抗炎介質[12]。LXs主要通過跨細胞途徑，由花生四烯酸經不同脂氧酶按順序催化合成。LXs生成后在局部炎癥部位發揮作用，然后迅速被代謝失活[13]。LXs對急慢性炎癥的發生發展及炎癥后的組織修復均有重要作用。研究發現LXA4及其類似物在子宮內膜異位癥、缺血/再灌注損傷、骨關節炎、冠心病等疾病模型中均有保護作用[14-17]。

NF-κB信號通路在LPS誘導炎癥的發生發展中發揮重要調控作用。LPS與Toll樣受體結合，首先引起胞漿中IκB降解，活化的NF-κB異源二聚體從胞漿向胞核轉移，再與核內DNA上相應的靶序列結合，從而調節靶基因的表達。本研究結果顯示LXA4抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞中IκB-α降解，同時增加胞漿中NF-κB"p65的表達，即LXA4抑制LPS誘導的NF-κB信號激活。LXA4可通過調控NF-κB通路抑制百草枯相關急性肺損傷的進展[18]。LXA4可抑制NF-κB通路的激活減輕骨關節炎，抑制破骨細胞的形成和分化[19]。Ali等[7]研究表明LXA4通過調控NF-κB信號通路抑制牙齦炎的發生。在膿毒癥性急性腎損傷動物模型中，LXA4抑制NF-κB通路，減少促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產生，從而發揮保護作用[20]。

綜上，LXA4抑制LPS誘導的氣道上皮細胞炎癥介質IL-6、IL-8和TNF-α的產生及MMP-9蛋白的表達，其作用機制可能是通過抑制NF-κB信號通路實現。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–10–28）

（修回日期：2025–01–24）