扎那米韋類衍生物的分子對接、3D-QSAR和分子設計研究

探討扎那米韋類衍生物對禽流感病毒神經氨酸酶（NA）的抑制作用，為新的NA抑制劑的研發和設計提供有用的結構信息，進而對流感病毒的新藥研發產生一定的積極意義.首先，選取22個扎那米韋類的合成化合物為配體，與PDB（protein data bank）數據庫中下載的3BEQ受體蛋白進行對接.然后，采用CoMFA和CoMSIA方法建立3D-QSAR預測模型，其中，CoMFA和CoMSIA模型的交叉驗證系數q2分別為0.599和0.592，非交互驗證相關系數R2分別為0.999和0.775，這一結果表明2種模型都具有良好的預測能力.最后，根據對接結果和3D-QSAR模型的預測分析，設計得到2種對禽流感病毒抑制活性更高的分子.

扎那米韋衍生物; 神經氨酸酶抑制劑; 分子對接; 3D-QSAR; 分子設計

O62

A

0367-08

03.007

神經氨酸酶（NA）是位于流感病毒表面的包膜糖蛋白，其結構類似于蘑菇云狀的4個相同亞基組成的四聚體結構，每個亞基都是由一個6葉片螺旋槳狀結構組成，每個單體都有球狀的頭部和桿狀的莖部^[1].NA是一種糖苷水解酶，在流感病毒的復制和傳播中起到重要作用.NA能夠水解唾液酸與細胞表面糖蛋白的糖苷鍵，促進病毒在上呼吸道的傳播和子代病毒的釋放，進而感染更多細胞^[2-3].以NA為靶點的選擇性抑制藥能夠與病毒的NA特異性結合，阻斷該酶的活性，促進病毒彼此凝集，使其難以從已經被感染的細胞表面釋放.

研究發現，NA的活性位點分為5個區域（s1～s5）^[4-5].扎那米韋抑制劑通過結構中的胍基與流感病毒NA活性部位的氨基酸殘基產生氫鍵、靜電作用力和范德瓦爾斯力^[6-7].2002年，Honda等^[8]設計合成了7-烷氧基系列衍生物，Masuda等^[9]合成了一系列雙環醚類NA抑制劑，這些化合物主要對A型病毒有抑制作用.Yamashita等^[10]研究出了新的NA抑制劑CS-8958（3），活性測試比扎那米韋好而且更長效.

扎那米韋作為第一個上市的NA抑制劑，其對流感病毒的抑制是以慢結合的方式進行的，具有高度特異性.慢結合是本品分子中胍基部分的作用，且對流感A型病毒有特異性，對B型病毒作用較弱^[11].因此，開發活性更高的NA抑制劑成為近期藥物研究的熱點.

1 研究方法

1.1 軟件程序 選用SYBYL-Dock軟件進行分子對接研究，具體采用的是基于SYBYL-X2.0軟件上進行的計算，若無特別說明，各參數均為SYBYL默認值.3D-QSAR定量構象關系是通過CoMFA和CoMSIA模型了解分子的理化性質和結構參數，找到結構與活性之間的量變規律，以此預測新的分子的活性^[12-13].

1.2 數據來源及結構優化選取文獻[14]中合成的22個扎那米韋類化合物作為NA抑制劑，其母環結構式如圖1所示，圖中的R取代基的結構式列于表1.采用半數抑制濃度IC50的負對數作為他們的生物活性指標，即pIC50進行量度，pIC50數據值來自文獻[14].在22個化合物中隨機抽取4個化合物，即5號、10號、15號和20號為測試集化合物，其余18個化合物為訓練集化合物.所有配體分子均采用tripos力場＼，添加氫原子和Gasteiger-Huckel電荷進行結構優化，Maxiterations設為1 000，Termination設為0.001，迭代算法選擇Force，優化后得到的穩定對象保存為mol2格式.

施建成，等：扎那米韋類衍生物的分子對接、3D-QSAR和分子設計研究

1.3 NA受體蛋白的獲取處理及對接設置 本研究選用PDB（protein data bank）蛋白質數據庫且選其編號3BEQ作為N1亞型的受體蛋白，圖2為3BEQ受體蛋白的X衍射的晶體結構圖.在對接的處理中將蛋白保留一個單體，刪去其他結構和水分子，加上氫原子.NA受體蛋白的活性口袋高度保守，活性口袋為ARG118、GLU119、ASP151、ARG152、ARG156、TRP178、ARG224、GLU227、SER246、GLU276、ARG292和TYR406^[15].將22個優化后的配體小分子分別與處理后的3BEQ蛋白受體進行分子對接，對接結果見表1.

1.4 3D-QSAR模型建立

將測試集化合物以共同骨架分子疊合，分別計算CoMFA和CoMSIA模型的參數值.其中，CoMFA模型包括立體場和靜電場，

CoMSIA模型包括立體場、靜電場、疏水場、氫鍵供體場和氫鍵受體場.采用抽一法（leave-one-out）^[9]

對訓練集化合物進行交叉驗證，計算模型的擬合能力和其他性質.通過所建立的CoMFA模型和CoMSIA模型，預測所有化合物的生物活性，并對所建立的模型進行分析.

2 結果與分析

2.1 分子對接結果與分析 運用SYBYL-X2.0軟件的Surflex-Dock功能模塊進行分子對接，結果用打分函數Total-Score、Crash、Polar等展示出來，其中Total-Score函數考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值越大對接復合物越穩定^[16-17].22個化合物的對接打分情況（表1）顯示，21號化合物的對接打分最高，Total-Score打分為7.893 9，Crash值為-2.864 2，Polar值為5.902 1.下面以21號化合物的對接模型進行分析.圖3為化合物21與3BEQ受體蛋白活性位點主要氨基酸殘基的作用模式，圖中加粗的球棍模型為21號化合物，熒光部分為21號化合物與周圍氨基酸形成的氫鍵.

由圖3可見，化合物21與氨基酸殘基的作用模式主要包括以下幾種情況：

1） 化合物21的胍基基團與氨基酸殘基Asp151形成氫鍵;

2） 取代基中的醚鍵與Arg118形成2個氫鍵;

3） 母環六元環的OH基團與氨基酸殘基Trp178形成氫鍵，共有4個氫鍵作用力;

4） 醚鍵、萘基與Ser246產生疏水作用;

5） 母環六元環的長碳鏈與氨基酸殘基Glu227產生疏水作用.

此外，還有7個極性、疏水性和親水性的殘基，這表明化合物與殘基之間也有其他疏水作用和靜電作用產生，這表明在化合物21與氨基酸殘基之間主要產生氫鍵作用、疏水作用和靜電作用.根據對接結果，說明Arg118、Glu119、Asp151、Arg152、Arg156、Trp178、Arg224、Glu227、Ser246、Glu276、Arg292和Tyr406是活性位點的主要氨基酸殘基.

2.2 CoMFA模型建立與分析

本研究在SYBYL-X2.0的QSAR板塊上進行CoMFA計算，分析力場包括靜電場和立體場.靜電場能和立體場能的enengy cutoff值為30.0 kJ/mol，網格點步長為默認值.如表2中所示，CoMFA模型交叉驗證系數q2的值為0.599，最佳主成分數n為6.由最佳主成分數進行非交叉驗證建立的CoMFA模型得到的標準偏差為0.009，相關系數R2為0.999，F值為3 361.011，立體場和靜電場的貢獻值S＼，E分別為76.4%＼，23.6%.通過數據分析可知，基團的空間效應和電性分布對活性均有影響，立體場的影響高于靜電場.

2.3 CoMSIA模型建立與分析 在SYBYL-X2.0的QSAR板塊上進行CoMSIA計算，網格點步長為默認值.如表2中所示，采用5個組合的情況建立CoMSIA模型，因為q2的值為0.592（gt;0.5），所以本模型為有效的預測模型，最佳主成分數n為1，標準偏差SEE為0.157，相關系數R2為0.775，F為55.056，立體場貢獻值S為21.6%＼，靜電場貢獻值E為31.9%＼，疏水場貢獻值H為22%＼，氫鍵供體場的貢獻值D為13.6%，以及氫鍵受體場貢獻值A為10.9%.

2.4 3D-QSAR模型的驗證

為了驗證所得到的CoMFA和CoMSIA模型的穩定性和預測能力，將18個訓練集化合物和4個測試集化合物利用已經構建好的3D-QSAR模型進行生物活性的預測計算，得到22個化合物抑制活性的預測值，列于表1中.將預測值和實驗值進行線性擬合，如圖4所示，圖中小方塊代表訓練集化合物的擬合值，圓點為測試集化合物的擬合值.可以看出，所有訓練集化合物的預測活性和實驗活性數據線性關系比較理想，實驗值和測試值的殘差不大，進一步證明此模型具有較好的預測能力，可以用于預測與骨架結構相似的化合物的活性.

2.5 3D-QSAR模型的三維等值線圖分析

2.5.1CoMFA模型的三維等值線圖分析選擇表1中活性最高的6號化合物為模板分子，CoMFA立體場和靜電場的三維等值線圖見圖5.

由圖5（a）可見，在化合物6的萘基和S鍵處適合引入更長的碳鏈或者在碳鏈上連接大體積基團，可在第一個環上引入一定體積的基團，比如試著連接甲基、乙基等，可提高活性^[18-19].由圖5（b）可見，在化合物6的胍基下方和萘基的右下方處適合連接吸電子基團，降低環上電子云密度以提高活性，結合立體場模型，萘基右下方適合加入較大體積的吸電子基團，可以加入取代基如碳鏈來提高活性，胍基基團處不宜改變體積.在取代基的正下方處適合加入大體積的且具有較大電負性的基團，比如F-、Cl-、Br-、—CO羰基等基團.模型中立體場的貢獻值為76.4%，大于靜電場的貢獻值23.6%.因此，對化合物的修飾改造應先考慮空間體積位阻的要求，再考慮靜電效應的作用^[18-19].

2.5.2CoMSIA模型的三維等值線圖分析 圖6是表1中化合物6的CoMSIA模型的立體場、靜電場、疏水場、氫鍵供體場和氫鍵受體場的三維等值線圖.

由圖6（a）表明，增大取代基的體積以提高活性，可以將萘基上或者長碳鏈S鍵處加入大體積基團，例如甲基、乙基等.這個與之前的CoMFA的立體場模型一致^[20-21].由圖6（b）發現，CoMSIA模型的靜電場和CoMFA的靜電場部分相似，但也有不同處.由圖6（b）表明，在化合物6的胍基處適合連接吸電子基團，降低環上電子云密度以提高活性，結合立體場模型，這里適合加入較小體積的吸電子基團^[22-23].

由圖6（c）表明，化合物6的取代基加入體積大的疏水性基團，可連接例如烴基、鹵素等結構.在醚鍵處加入親水性基團，可將醚鍵改為羰基，有利于提高活性^[24-25].由圖6（d）和圖6（e）表明，增加小體積的氫鍵受體且氫鍵受體基團是由電負性大的原子組成，其外層有未共用的電子對，可提高活性.另外，在胍基的其中一個氨基處加入氫鍵供體基團可提高活性.CoMSIA模型的預測能力比CoMFA模型要強，因此在對化合物修飾改造時要優先考慮CoMSIA模型.

3 分子設計

根據本文所建立的3D-QSAR模型的研究，對表1活性最高的化合物6號分子進行了結構修飾.在化合物6的萘基基團處加入大體積的取代基，并加入吸電子基團以提高活性，根據這一結果，共設計了2個新的分子（表3），其中預測活性最高的為7.797，均高于表1中化合物6的活性（7.697）.

4 結論

本文緊密結合全球抗擊禽流感病毒藥物研究的新成果，以分子生物學為基礎＼，分子模擬為手段，研究了扎那米韋類衍生物對禽流感病毒神經氨酸酶（ＮＡ）的抑制作用.首先，選取22個扎那米韋類的合成化合物為配體，與PDB（protein databank）數據庫中下載的3BEQ受體蛋白進行對接.然后，采用CoMFA和CoMSIA方法建立3D-QSAR預測模型，其中，CoMFA和CoMSIA方法模型的交叉驗證系數q2分別為0.599和0.592，非交互驗證相關系數R2分別為0.999和0.775，這一結果表明2種方法模型都具有良好的預測能力.最后，從三維等值線圖直觀地解釋了化合物的構效關系，從立體場、靜電場、疏水場、氫鍵供體場和氫鍵受體場全方面解釋了影響化合物活性的結構特征，根據這些分析結果，設計得到2種對NA抑制活性更好的分子，為進一步開發治療禽流感的新型藥物提供理論基礎.

參考文獻

[1]ROSCHEK B Jr， FINK R C， MCMICHAEL M D， et al. Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro[J]. Phytochemistry，2009，70（10）：1255-1261.

[2]LEE C L， CHIANG L C， CHENG L H， et al. Influenza a （H（1）N（1）） antiviral and cytotoxic agents from Ferula assa-foetida[J]. Journal of Natural Products，2009，72（9）：1568-1572.

[3] KIM J H， RESENDE R， WENNEKES T， et al. Mechanism-based covalent neuraminidase inhibitors with broad-spectrum influenza antiviral activity[J]. Science，2013，340（6128）：71-75.

[4] 黃蘭，周劍芳，韋紅，等. 流感病毒神經氨酸酶抑制劑藥物耐藥現狀及機制研究進展[J]. 病毒學報，2012，28（5）：572-576.

[5] 李青. 流感病毒神經氨酸酶的結構、耐藥及新型抑制劑作用的機制研究[D]. 合肥：中國科學技術大學，2012.

[6] RYU Y B， CURTIS-LONG M J， LEE J W， et al. Structural characteristics of flavanones and flavones from Cudrania tricuspidata for neuraminidase inhibition[J]. Bioorganic amp; Medicinal Chemistry Letters，2009，19（17）：4912-4915.

[7] GAMBLIN S J， SKEHEL J J. Influenza hemagglutinin and neuraminidase membrane glycoproteins[J]. The Journal of Biological Chemistry，2010，285（37）：28403-28409.

[8] HONDA T， MASUDA T， YOSHIDA S， et al. Synthesis and anti-Influenza virus activity of 7-O-Alkylated derivatives related to zanamivir[J]. Bioorganic amp; Medicinal Chemistry Letters，2002，12（15）：1925-1928.

[9] MASUDA T， SHIBUYA S， ARAI M， et al. Synthesis and anti-influenza evaluation of orally active bicyclic ether derivatives related to zanamivir[J]. Bioorganic amp; Medicinal Chemistry Letters，2003，13（4）：669-673.

[10]YAMASHITA M， TOMOZAWA T， KAKUTA M， et al. CS-8958， a prodrug of the new neuraminidase inhibitor R-125489， shows long-acting anti-influenza virus activity[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53（1）：186-192.

[11] 顧覺奮. 新型抗流感病毒強效神經氨酸酶抑制劑帕拉米韋研究進展[J]. 中國新藥雜志，2013，22（9）：989-997.

[12] SUN J Y， MEI H. Docking and 3D-QSAR investigations of pyrrolidine derivatives as potent neuraminidase inhibitors[J]. Chemical Biology amp; Drug Design，2012，79（5）：863-868.

[13] 舒茜. 取代芳烴與6種生物毒性的定量構效關系[J]. 四川師范大學學報（自然科學版），2011，34（3）：401-405.

[14] LIN C H， CHANG T C， DAS A， et al. Synthesis of acylguanidine zanamivir derivatives as neuraminidase inhibitors and the evaluation of their bio-activities[J]. Organic amp; Biomolecular Chemistry，2013，11（24）：3943-3948.

[15] RUDRAWAR S， DYASON J C， RAMEIX-WELTI M A， et al. Novel sialic acid derivatives lock open the 150-loop of an influenza A virus group-1 sialidase[J]. Nature Communications，2010，1：113.

[16] LI Q， QI J X， ZHANG W， et al. The 2009 pandemic H1N1 neuraminidase N1 lacks the 150-cavity in its active site[J]. Nature Structural amp; Molecular Biology，2010，17（10）：1266-1268.

[17] 鄭滔，謝曉玲，鄧南翔，等. 多芳基咪唑CPD的合成及與G-四鏈體相互作用研究[J]. 四川師范大學學報（自然科學版），2022，45（4）：521-526.

[18] HULL AMBER N， MORRILL JASON A. Design of benzoic acid derivatives as broad-spectrum influenza neuraminidase inhibitor using QSAR and docking[J]. Abstracts of Papers of the American Chemical Society，2010，239：388-392.

[19] 朱萬平，梁桂兆，廖立敏，等. 三維全息原子場作用矢量（3D-HoVAIF）用于神經氨酸酶抑制劑的結構表征與設計及定量構效關系（QSAR）研究[J]. 分析化學，2008，36（6）：799-804.

[20] LIU K C， FANG J M， JAN J T， et al. Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2012，55（19）：8493-8501.

[21] XIE Y C， HUANG B， YU K X， et al. Caffeic acid derivatives： a new type of influenza neuraminidase inhibitors[J]. Bioorganic amp; Medicinal Chemistry Letters，2013，23（12）：3556-3560.

[22] KIM S， OH D B， KANG H A， et al. Features and applications of bacterial sialidases[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91（1）：1-15.

[23] CARTER M J. A rationale for using steroids in the treatment of severe cases of H5N1 avian influenza[J]. Journal of Medical Microbiology，2007，56（7）：875-883.

[24] WATANABE Y， IBRAHIM M S， SUZUKI Y， et al. The changing nature of avian influenza A virus （H5N1）[J]. Trends in Microbiology，2012，20（1）：11-20.

[25] PARK J W， JO W H. Computational design of novel， high-affinity neuraminidase inhibitors for H5N1 avian influenza virus[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，2010，45（2）：536-541.

Molecular Docking，3D-QSAR and Molecular DesignStudies on Zanamivir Derivatives

SHI Jiancheng， ZHAO Dan

（1. School of Chemistry and Materials， Nanning Normal University， Nanning 530001， Guangxi;

2. Key Laboratory of Macromolecular Chemistry and Physics， Nanning Normal University， Nanning 530001， Guangxi）

To study the inhibitory activity of zanamivir derivatives on the virus neuraminidase of the avian influenza， 22 zanamivir derivatives were selected as ligands and docked with the 3BEQ receptor protein that was downloaded from the PDB（Protein Data Bank）database. The 3D-QSAR model was established by CoMFA and CoMSIA methods， where the cross validation coefficient q2 was 0.599 and non-cross validation coefficient R2 was 0.999 for CoMFA model， while the cross validation coefficient q2 was 0.592 and non-cross validation coefficient R2 was 0.775 for CoMSIA model. The results reveal that both models have good predictive capability. Based on the docking results and 3D-QSAR models， the novel melecules with stronger inhibitory activity were designed. The results are expected to provide useful structural information for the development of new neuraminidase inhibitors and have positive significance for the development of new drugs for influenza virus.

zanamivir derivatives; neuraminidase inhibitors; molecular docking; 3D-QSAR; molecular design

（編輯 余 毅）