甘加藏羊發情周期血漿INHA動態變化及HPO軸INHα的表達

摘 要 為研究甘加藏羊（Ovis aries）發情周期血漿抑制素A（InhibinA，INHA）的分泌及抑制素α亞基（INHα）在HPO軸的表達，分析其對藏羊生殖生理活動的調控作用，應用ELISA、qRT-PCR、Western Blot和IHC法檢測甘加藏羊發情周期和乏情期血漿中INHA、卵泡刺激素（FSH）的濃度變化，HPO組織中INHα mRNA及其蛋白的表達和分布。結果顯示，甘加藏羊發情周期血漿中INHA和FSH濃度均呈脈沖式和波動式交替變化，平均濃度均在發情期最高，乏情期最低，各時期差異顯著（Plt;0.05）。INHα mRNA及其蛋白在HPO組織中均有表達：下丘腦中，INHα mRNA相對表達量在發情前期最高，INHα蛋白在間情期表達量最高，各時期差異顯著（Plt;0.05）；垂體中，INHα mRNA和蛋白的表達量均在發情期最高，與其他時期差異顯著（Plt;0.05）；卵巢中，INHα mRNA相對表達量在發情前期最高，INHα蛋白在間情期表達量最高，各時期差異顯著（Plt;0.05）；免疫組化結果顯示，INHα陽性產物在下丘腦促垂體區神經內分泌小細胞胞漿和神經膠質細胞，腺垂體嗜酸性細胞和嗜堿性細胞胞漿，卵巢卵泡顆粒層細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞胞漿中均有表達，且各時期各組織INHα陽性產物著色深淺表達量有差異。綜上表明INHA及其INHα蛋白參與甘加藏羊的生殖調控，對藏羊周期性發情、卵泡的成熟與排卵發揮重要的調節作用。

關鍵詞 甘加藏羊；抑制素；卵泡刺激素；發情周期；下丘腦-垂體-卵巢軸

甘加藏羊生活在海拔約2 800 m以上甘南草原，是肉、毛、皮兼用的優良地方種類，但其屬于季節性發情哺乳動物，每年一胎，每胎一羔，較低的繁殖率限制了甘加藏羊養殖規模的擴大[1]。因此，探究影響甘加藏羊生殖性能的因素，對提高甘加藏羊繁殖力具有重要意義。在哺乳動物的生殖過程中，下丘腦-垂體-卵巢（Hypothalamic-pituitary-ovary，HPO）軸發揮著重要的調控作用[2]。抑制素（Inhibin，INH）是一種通過二硫鍵將INHα亞基與INHβA亞基連接組成，由卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞分泌的糖蛋白激素，是卵泡發育的重要卵巢內部調節因子，可通過拮抗活化素的作用調控垂體卵泡刺激素（Follicle，FSH）的分泌[3]。垂體水平的活化素與GnRH協同作用刺激垂體促性腺激素細胞合成和分泌FSH，抑制素通過抑制FSH合成和分泌調節FSH參與的顆粒細胞增殖、優勢卵泡形成、排卵及性甾體激素生成，進而調節哺乳動物生殖活動[4]。

有研究發現INHα亞基在卵泡發育各階段均有表達，INHβA亞基主要在優勢卵泡和黃體細胞表達[5]。趙中權[6]研究發現INH相關基因在山羊垂體、卵巢等組織中均有表達，研究報道INH可抑制牛[7]、綿羊[8]、山羊[9]、大鼠[10]和小鼠[11-12]垂體分泌FSH，且血液中FSH濃度變化與INH濃度變化有相關性。越來越多的研究關注INH在生殖內分泌領域的作用。然而，甘加藏羊發情周期血漿中INHA濃度變化及INHα蛋白表達分布情況尚未見相關研究報道。因此，本研究采用ELISA、qRT-PCR、Western blot、IHC等方法，研究甘加藏羊發情周期的血漿中INHA和FSH濃度變化、HPO組織中INHα mRNA及蛋白表達差異，為更深入地探究抑制素對藏羊繁殖活動的調控機制提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

在甘肅省甘南州甘加鄉養殖場中隨機選取30只繁殖季節（7-9月）和非繁殖季節（5月）年齡在2.5～3.5歲的雌性甘加藏羊，正常草原放養。按照四期分法[13]觀察母羊外陰生殖狀態，結合陰道脫落細胞涂片法[14]，以公羊爬跨時間標記為0 h，確定發情開始，分為4組，每組6只，0～" 36 h為發情期組、36～72 h為發情后期組、4～" 13 d為間情期組、14～16 d為發情前期組。在非繁殖季節（5月）選取6只藏羊為乏情期組[15]。在首個發情周期的不同時期采集血樣，發情期每" 2 h采集1次；發情后期每3 h采集1次；間情期、發情前期和乏情期每天早（z）晚（w）7點各采集1次。每次通過頸靜脈采集10 mL血樣，放置于肝素鈉抗凝管中，進行3 000 r/min離心后轉移至血清管，于-20" ℃冰箱保存，備用。跟蹤觀察藏羊到第二個發情周期各時期的中間點，即18 h、54 h、" 9 d和15 d，然后頸動脈放血處死各試驗組羊，每組6只，迅速取出下丘腦、垂體、卵巢等組織，分成兩份，一份保存在4%多聚甲醛溶液中，一份保存在液氮中，帶回實驗室放置于-80" ℃冰箱，備用。采集乏情期組織樣品方法同上。

1.2 甘加藏羊血漿中INHA和FSH的測定

按ELISA試劑盒（中國北京，北京奇松生物科技有限公司）說明測定得到甘加藏羊發情周期和乏情期血漿中INHA和FSH的光密度（OD值）數據，建立標準曲線和回歸方程：INHA為" y=136 374x2-23 618x+788.84，R2=0.975 5；FSH為y=1.774 5x2-1.249 3x+0.499 3，" R2=0.987 3，其中x、y分別代表OD值和INHA、FSH濃度。

1.3 甘加藏羊HPO組織中INHα mRNA測定

依照RNA提取試劑盒（中國北京，北京全式金生物技術有限公司）說明提取HPO組織RNA，使用反轉錄試劑盒（中國北京，北京全式金生物技術有限公司）合成cDNA，備用。NCBI數據庫查詢綿羊INHα mRNA（EU034029）和β-actin mRNA（NM_001009784.3）的CDS序列，采用Premier 5.0軟件設計引物，由北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司合成（表1）。在進行qRT-PCR反應時，使用cDNA作為反應模板，設置3個重復樣本，總體系為20 μL，反應條件是94 ℃/30 s；94 ℃/5 s，60 ℃/30 s，72 ℃/10 s，進行45次循環。2-ΔΔCt法計算數據，內參基因β-actin作為基準校正基因的相對表達量。

1.4 甘加藏羊HPO組織中INHα蛋白測定

提取甘加藏羊HPO組織總蛋白進行SDS-PAGE，將INHα和β-actin蛋白條帶電轉至PVDF膜（中國北京，北京索萊寶科技有限公司）上，對膜進行封閉處理，使用1∶700稀釋的兔抗INHα多克隆抗體（中國北京，北京博奧森生物技術有限公司，bs-1032R）4" ℃條件下過夜孵育，用PBST溶液洗膜，以去除雜質。使用1∶4 500稀釋的山羊抗兔IgG二抗（中國北京，北京博奧森生物技術有限公司，bs-0295R）37" ℃條件下孵育90 min。再次用PBST溶液洗膜，使用Image-J軟件分析蛋白質灰度值，以獲取準確的結果。

1.5 甘加藏羊HPO組織中INHα免疫組織化學染色

取出經4%多聚甲醛溶液固定的下丘腦、垂體和卵巢組織進行石蠟切片制備，對切片進行脫蠟、水化、微波抗原修復后，根據免疫組化試劑盒說明書操作，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑（3% H2O2），封閉劑（BSA），37" ℃各孵育10 min，滴加一抗（兔抗INHα多克隆抗體，1∶350）（中國北京，北京博奧森生物技術有限公司），PBS代替一抗用做陰性對照，4" ℃孵育過夜后37" ℃孵育2 h，37" ℃二抗（山羊抗兔IgG）（美國，immunoway Biotechnology Company，RS0011）孵育30 min，滴加DAB，蘇木精復染，使用MoticSK210型光學顯微鏡控制染色效果，并進行脫水透明封片，觀察拍照。

1.6 數據分析

血漿中INHA和FSH濃度由標準品線性回歸方程計算得出；INHα mRNA相對表達量由qRT-PCR結果使用2-ΔΔCt法計算數據，內參基因作為基準校正得到；INHα蛋白相對表達量使用Image-J軟件分析蛋白灰度值，用INHα與內參蛋白灰度值比值表示；所得結果均采用SPSS"" 25.0軟件進行顯著性分析，以“平均值±標準差”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 甘加藏羊血漿INHA和FSH濃度動態變化

圖1顯示，甘加藏羊發情周期各個時期血漿中INHA和FSH的濃度表現出交替變化的脈沖式和波動式特征。發情周期的12 h、54 h、4 dw、" 8 dz、13 dw出現INHA波峰，在發情期的" 12 h達到最大波峰（3 128.362 4±168.771 0）" pg/mL，14 dw為最低波谷（32.684 8±14.397 1） pg/mL。圖2顯示，發情期時INHA的平均濃度最高，且發情周期內各個時期INHA的平均濃度均高于乏情期，各時期差異顯著（Plt;0.05）；圖1顯示，在發情周期的24 h、54 h、7 dz、12 dw出現FSH波峰，在發情期的24 h為最高波峰（4.227 0±0.046 9）mlU/mL，1.66 h為最低波谷（2.1297±" 0.0105 mlU/mL）。圖2顯示，FSH平均濃度在發情期最高，發情周期各個時期FSH的平均濃度均高于乏情期，各時期差異顯著（Plt;0.05）。

2.2 甘加藏羊HPO軸INHα mRNA的表達分析

圖3顯示，INHα mRNA在甘加藏羊發情周期各個時期和乏情期的下丘腦、垂體、卵巢組織中均有表達。下丘腦發情前期INHα mRNA相對表達量顯著高于其他時期（Plt;0.05）；垂體發情期INHα mRNA相對表達量最高，與其他時期存在顯著差異（Plt;0.05）；卵巢發情前期INHα mRNA相對表達量顯著高于其他時期（Plt;0.05）。

發情周期內的INHα mRNA相對表達量高于乏情期的INHα mRNA相對表達量（Plt;0.05）。

2.3 甘加藏羊HPO軸INHα蛋白表達

圖4顯示，INHα蛋白在甘加藏羊發情周期各個時期和乏情期的下丘腦、垂體、卵巢組織中均有表達。下丘腦間情期INHα蛋白相對表達量顯著高于其他時期（Plt;0.05）；垂體發情期INHα蛋白相對表達量最高，與其他時期存在顯著差異（Plt;0.05）；卵巢間情期INHα蛋白相對表達量最高，各個時期差異顯著（Plt;0.05）。發情周期各個時期INHα蛋白相對表達量均高于乏情期（Plt;0.05）。

2.4 甘加藏羊HPO軸INHα陽性產物定位研究

圖5顯示，在甘加藏羊發情周期各個時期和乏情期的下丘腦、垂體、卵巢組織中均有INHα免疫陽性產物表達。陽性染色結果呈黃色/棕黃色，對照組結果呈陰性，證明一抗具備INHα免疫反應特異性。下丘腦促垂體區神經內分泌小細胞胞漿和神經膠質細胞中INHα陽性產物均有分布（圖5-A1～圖5-A5），發情前期（圖5-A1）、發情期（圖5-A2）和間情期（圖5-A4）細胞染色深，強陽性表達；垂體中，INHα陽性產物主要分布在腺垂體的嗜酸性細胞和嗜堿性細胞的胞漿中（圖5"" B1～圖5-B5），發情期（圖5-B2）和發情后期（圖5-B3）細胞著色較深，陽性表達較強；卵巢中INHα陽性產物主要在卵泡顆粒層細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞的胞漿中分布（圖5-C1～圖5-C5），發情期（圖5-C2）和發情后期（圖5-C3）顆粒層細胞濃染，陽性表達強。

3 討" 論

研究證明INH調節垂體、性腺和胎盤等多種器官細胞的生長、分化及卵泡發育和精子生成等生理活動，在動物的生殖功能調節方面起著至關重要的作用。本研究結果表明，INHA和FSH濃度在甘加藏羊發情周期的血漿中呈現出動態的變化趨勢，乏情期血漿中INHA和FSH的濃度均低于發情周期的基礎值，表明INHA和FSH在甘加藏羊周期性發情中起到了重要作用。血漿中FSH濃度在發情期最高，各時期差異顯著，與朱雪雁等[16]報道結果一致。INHA與FSH平均濃度變化在各時期表現一致，與楊孟伯等[17]所報道的大足黑山羊排卵后INH和FSH濃度升高一致。藏羊發情前期INHA濃度較低呈上升趨勢，在發情期達到最大值，FSH濃度維持在較高水平，提示在發情前期INHA對垂體的負反饋作用較弱，有助于垂體細胞分泌FSH，促進卵泡發育；發情期，高濃度的INHA抑制FSH分泌，引起成熟卵泡排卵。哺乳動物發情周期中，小的有腔卵泡發育階段，FSH主導調控INHA增加[18]，隨著FSH濃度升高，卵巢顆粒細胞增殖，卵泡腔增大，卵泡經過周期招募轉化為優勢卵泡[19]，優勢卵泡自分泌產生INHA，且高水平的FSH濃度會繼續刺激卵泡顆粒細胞分泌INHA，使得INHA濃度增加，負反饋抑制垂體細胞分泌FSH，當FSH濃度下降到一定程度時，INHA濃度隨之下降，解除對FSH的抑制作用[17]。另外，INHA能以自分泌和旁分泌方式作用到小卵泡顆粒細胞，抑制小卵泡的發育，使其閉鎖淘汰[20-21]。王立斌等[22]發現牦牛卵泡顆粒細胞中FSHβ基因的表達與INHA呈劑量依賴性關系，史軍紅等[19]在分析甘加藏羊發情周期血漿中FSH濃度變化與卵泡發育的關系時發現FSH波峰會伴隨卵泡波出現。FSH濃度升高引起INHA水平升高，反饋抑制FSH，再次證實INHA在甘加藏羊的周期性發情中發揮了重要作用。

INH主要來源于卵巢顆粒細胞，除此以外，INH在大腦、垂體、肝臟、腎上腺[23]和胎盤[24]等組織中均存在，影響各組織生理活動。本試驗發現，INHα mRNA及其蛋白在甘加藏羊發情周期各個時期和乏情期HPO組織中均有表達，各個時期存在顯著差異，表明INHα參與甘加藏羊發情周期生殖活動。下丘腦中INHα mRNA相對表達量在發情前期最高，蛋白相對表達量在間情期最高；垂體中INHα mRNA及其蛋白相對表達量在發情期最高；卵巢發情前期INHα mRNA相對表達量最高，間情期蛋白相對表達量最高。INHα基因表達結果及蛋白表達結果存在差異可能是由于真核基因表達的轉錄和蛋白翻譯發生的時間和位點存在時空間隔導致[25]。在下丘腦促垂體區神經內分泌小細胞胞漿和神經膠質細胞中INHα陽性產物均有表達，提示INHα可能參與調節下丘腦GnRH的釋放，進而對垂體FSH進行反饋調節[6]。Haisenleder等[26]發現低頻率GnRH脈沖能引起INHα mRNA差異性表達；Calogero等[27]發現INH能抑制活化素對大鼠下丘腦神經元GnRH釋放的誘導作用，從而調節垂體促性腺激素的合成分泌。在垂體中INHα陽性產物主要表達在腺垂體的嗜酸性細胞和嗜堿性細胞的胞漿中。INH參與構成抑制素-活化素-卵泡抑素系統，通過與活化素受體競爭性結合抑制垂體細胞分泌FSH[28]。活化素通過TGF-β信號通路發揮作用，上調FSHβ基因和GnRHR基因表達，促進FSH釋放，INH拮抗活化素，對抗下丘腦釋放GnRH的作用[29]，減少垂體細胞及血液循環體系中FSH的含量。卵巢中INHα陽性產物主要分布在卵泡顆粒層細胞中，卵巢顆粒細胞分泌的INHα亞基可以與INHβ亞基合成抑制素，作用于垂體促性腺激素分泌細胞，抑制FSH的合成與釋放[30]。Lu等[31]發現，INHA可以通過抑制FSH誘導的大鼠顆粒細胞FSHR啟動子活性和相關mRNA表達發揮調節卵泡內FSH水平的作用；Medan等[32]發現，INH免疫能顯著提高母牛卵巢中卵泡的發育程度和排卵率；崔志富[33]發現，INHα在雞卵泡募集過程中發揮重要作用，INHA參與調控卵泡發育，卵泡顆粒細胞增殖，雌二醇、孕酮合成。以上研究表明抑制素對卵巢發育發揮調節作用。

INH在動物繁殖中具有廣闊的應用前景，由于INH對FSH分泌具有抑制作用，可將INH作為免疫原，產生能中和外周血中INH的抗體，削弱INH抑制垂體細胞分泌FSH的作用，使FSH含量升高，提高家畜排卵率、產仔數及生精等繁殖性能[34]，這也可應用在甘加藏羊的繁殖中。

4 結" 論

甘加藏羊發情周期和乏情期血漿中INHA和FSH濃度呈動態變化，INHα mRNA及其蛋白在HPO軸中存在差異性表達，提示INHA及其INHα亞基參與甘加藏羊的生殖調控，對藏羊周期性發情、卵泡的成熟與排卵發揮重要的調節作用，研究結果為進一步研究INH對動物生殖生理的調控機制提供一定的理論依據。[HJ39x]

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Dynamic Changes of Plasma"" Inhibin A and Expression of HPO Axis INHα in Ganjia Tibetan Sheep during Estrus Cycle

LIU Xiaojie1，GAO Hexuan2，ZHAO Guoyong1，HE Yuqin1，YANG Zhijie1， TAO Lekai1， ZHANG Guangmin1and CAI Yongqiang1

（1. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;2. Network Finance Department，Bank of Lanzhou，Lanzhou 730070，China）

Abstract This study investigates the secretion of plasma Inhibin A （INHA） and the expression of Inhibin α subunit （INHα） in the HPO axis during the estrus cycle of Ovis arise，with an analysis of their regulatory effects on reproductive activities.The INHA and FSH content change of plasma，as well as the expression of INHα mRNA and its proteins in the HPO tissues of the Tibetan sheep of Ganjia during the estrus cycle and anestrus were examined by ELISA，qRT-PCR，Western Blot and IHC experimental methods. The experimental results showed that the plasma concentrations of INHA and FSH were alternately pulsatile and fluctuating in each period of the estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep，and their highest average concentrations were all in the estrus and lowest in the anestrus，and the differences between the periods were significant （Plt;0.05）. INHα mRNA and its protein were expressed in HPO tissues. In the hypothalamus，the relative expression level of INHα mRNA was the highest in the proestrus，and level of the protein was the highest in the diestrus，with significant differences between the periods （Plt;0.05）. In the pituitary gland，the expression levels of INHα mRNA and protein were the highest in estrus and significantly different from other periods （Plt;0.05）. In the ovary，the expression level of INHα mRNA was the highest in the proestrus period and the eprotein was the highest in the diestrus，with the significant differences from the periods （Plt;0.05）. Immunohistochemical staining results showed that the immune-positive product of INHα was expressed in the cytoplasm of neuroendocrine small cells in the hypothalamic pro-pituitary region and in neuroglia，as well as in the cytoplasm of eosinophils and basophils in adenohypophysis. In the ovary，INHα was expressed in the cytoplasm of follicular granulosa cells，follicular membrane cells and luteal cells. These findings collectively suggest the involvement of INHA and INHα protein in the physiological activities of Ganjia Tibetan sheep，and playing essential regulatory roles in the periodic estrus，follicle maturation and ovulation during the estrous cycle of the Tibetan sheep.

Key words Ganjia Tibetan sheep; Inhibin; Follicle; Estrus cycle; Hypothalamus-pituitary-ovary axis

Received 2024-01-03 Returned 2024-03-15

Foundation item The National Natural Science Foundation of China （No.31960689）.

First author LIU Xiaojie，female，master"" student. Research area：animal biochemistry and molecular biology.E-mail：3359589688@qq.com

Corresponding"" author HE Yuqin，female，Ph.D，professor，master supervisor. Research area： animal physiology. E-mail： heyq@gsau.edu.cn

YANG Zhijie，male，associate professor，master supervisor.Research area： animal physiology."" E-mail： yangzj@gsau.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

收稿日期：2024-01-03 修回日期：2024-03-15

基金項目：國家自然科學基金（31960689）。

第一作者：劉曉潔，女，碩士研究生，從事生物化學與分子生物學動物方向研究。E-mail：3359589688@qq.com

通信作者：何玉琴，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事動物生理學研究。E-mail：heyq@gsau.edu.cn

楊志杰，男，副教授，碩士生導師，主要從事動物生理學研究。E-mail：yangzj@gsau.edu.cn