葡萄采后致腐病原菌Diaporthe noblis的鑒定及室內殺菌劑的篩選

摘 要 為有效防控葡萄采后病害，對儲藏期葡萄致腐病原菌進行分離純化，果實離體進行致病性測定，利用形態學特征和多基因聯合建樹對菌株進行種類鑒定；同時利用菌絲生長速率法測定該病原菌對6種殺菌劑的敏感性。結果表明，所分離到的菌株形態特征一致，致病性測定符合科赫氏法則，同時結合轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer，ITS），鈣調蛋白（calmodulin，cal），轉錄延伸因子（translation elongation factors，tef）和β-微管蛋白（β-tubulin，tub）的四基因聯合建樹系統發育分析，將病原菌鑒定為Diaporthe nobilis。殺菌劑敏感性測定發現，50%咯菌腈可濕性粉劑和50%嘧霉胺可濕性粉劑抑菌效果最佳，EC50分別為0.01 mg/L和" 0.02 mg/L；其次是腐霉利可濕性粉劑，EC50為3.25 mg/L。

關鍵詞 葡萄；采后腐爛；間作殼菌；鑒定；殺菌劑

葡萄 （Vitis vinifera L.）是世界各地廣泛種植的水果之一，在采收前后和儲藏期受到多種病原菌侵染，造成果實產量、品質的下降，直接影響了生產、加工和出口[1]。病原真菌侵染是造成采后葡萄腐爛的主要原因，主要包括灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、青霉菌 （Penicillium spp.）、根霉（Rhizopus stolorifer）、黑曲霉（Aspergillus niger）、鏈格孢（Alternaria sp.）和炭疽菌 （Colletotrichum gloeosporioides）等[2-5]。據報道，每年我國葡萄采后損失率高達20%，嚴重制約了我國葡萄產業的發展[6]。目前葡萄采后保鮮主要通過SO2熏蒸、1-MCP處理等，然而儲藏過程中仍不可避免出現掉粒、失水、果梗褐變及腐爛等問題[7-10]。

‘陽光玫瑰’（Shine Muscat）葡萄是我國近年來由日本引進的新品種，由于果實含糖量高、果肉鮮嫩多汁等優良品質倍受消費者歡迎，在全國各地廣泛栽培[11-12]。由于近年來產量增加，成熟期價格降低，果農多將果實冷藏，選擇在秋冬季節上市，這不僅可以避開成熟高峰期，還能大大提高經濟效益。然而，‘陽光玫瑰’在采后貯藏期易出現腐爛、掉粒、失水和果梗褐化等問題[6，13]。2020年冬季，筆者在山西省運城市葡萄儲藏冷庫調查時發現大批‘陽光玫瑰’葡萄出現果梗褐變、腐爛，嚴重影響了葡萄的商品價值。因此，本研究對病變‘陽光玫瑰’葡萄進行了采樣、分離和鑒定，確定其致病性，篩選有效殺菌劑，以期為葡萄采后病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020年11月于山西省運城市一個葡萄儲藏冷庫調查取樣，將出現病變‘陽光玫瑰’葡萄樣品裝在無菌采樣袋中帶回實驗室。

病原菌分離純化用到的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar medium，PDA）。真菌基因組DNA快速提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司； 2×Taq PCR Master Mix II，TIANGEN；葡萄糖、瓊脂粉等常規試劑均為國產分析純。PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

室內殺菌劑篩選所用藥劑的有效成分含量和劑型如表1所示。

1.2 病原菌的分離純化

采用組織分離法分離病原菌。在無菌操作臺內用手術刀將病健交界處組織切成0.5 cm×0.5 cm大小方塊，置于70%酒精浸泡45 s，用無菌水沖洗2～3 次；然后置于PDA平板上于25 ℃黑暗培養3～5 d。待菌落出現后，挑取菌絲組織轉接到新的PDA平板上，在相同條件下培養，轉接" 2～3次進行菌株純化。純化后的菌株用PDA斜面于4 ℃冰箱內保存。

1.3 致病性測定

選擇大小和成熟度一致的健康新鮮葡萄果實用于致病性測定。將‘陽光玫瑰’葡萄果實用自來水沖洗，于70%酒精浸泡45 s后，無菌水沖洗" 2～3次，晾干，備用。用滅菌打孔器（直徑5 mm）在果實赤道處輕輕制造傷口（深度約2 mm）。將直徑5 mm的菌餅貼于傷口處，然后置于25 ℃黑暗培養5 d。對照組果實接種無菌PDA餅。每組處理10個果實，每個處理重復3次。每天檢查果實發病情況，并拍照記錄。待果實發病長出子實體后，分離純化病原菌，并觀察其形態特點。

參照Millan等[14]設置的葡萄果實病害發病分級標準，測定病害嚴重度：0，無癥狀；1，病斑占果實面積的1%～25%；2，病斑占果實面積的26%～50%；3，病斑占果實面積的51%～75%；4，病斑占果實面積的76%～100%。根據以下公式計算病情指數和發病率。

發病率=（發病果實數量/總果實數量）×100%

病情指數=[∑（各級病果數×病害級別）]/（總果實數量×最高病害級別）

1.4 病原菌形態學觀察

將純化的菌株SS1、SS2在PDA平板上于" 25 ℃黑暗培養7 d，觀察菌落形態。待產孢后，制作臨時玻片，用日本奧林巴斯Olympus CX43 顯微鏡觀察分生孢子形態并拍照。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

病原菌SS1、SS2在PDA平板上于25 ℃黑暗培養7 d后，用無菌玻片輕輕刮取菌絲，按照試劑盒說明書提取基因組DNA。參照表2引物，進行PCR反應，分別對真菌核糖體內轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer，ITS），鈣調蛋白（calmodulin，cal），轉錄延伸因子（translation"" elongation factors 1-α ，tef）、β-微管蛋白（β-tubulin，tub）的基因進行擴增[15-17]。PCR反應體系為：2×Taq Master Mix 12.5 μL、DNA模板" 1 μL、上下游引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，各退火溫度下（表2）30 s，72 ℃延伸" 1 min，30個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行初步檢測后，由楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序。

測序結果通過美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的在線軟件Basic Local Alignment Search Tool （BLAST，https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）比對分析，下載間作殼菌株的ITS、cal、tef和tub基因同源序列用于構建進化樹。所下載的序列保存為FASTA格式，經過軟件CLUSTALX 1.83進行多重序列比對[18]。利用MEGA-X將各菌株的4個基因整合并儲存為FASTA格式文件。利用MEGA-X采用鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）對整合序列構建系統發生樹，設置1" 000次重復計算分支支持率，分析該菌與其他菌株的親緣關系，以確定其分類地位[19]。

1.6 室內殺菌劑篩選

采用菌絲生長速率法測定6種供試藥劑對間作殼菌株SS1的抑菌活性。制作含藥培養基：取49 mL配制好的PDA培養基分裝在250 mL的三角瓶中，滅菌后冷卻到50 ℃，加入相應藥劑混合均勻，制作濃度如表1所示的含藥平板。每種藥劑每個濃度制作5個含藥平板。對照組不加藥劑。用直徑5 mm的打孔器在生長7 d的SS1菌落邊緣打孔，將菌餅置于含藥平板中間，在25 ℃黑暗培養。7 d后觀察菌落生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，菌落直徑=測量直徑-菌餅直徑，按照以下公式計算菌絲生長抑制率：

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

采用SPSS 25.0軟件統計分析殺菌劑對病原菌菌絲生長的活性回歸方程、EC50值及95%置信限。菌絲生長速率試驗利用Ducan’s新復極差法比較各藥劑不同濃度處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化

由病變葡萄果實和果梗表面共分離到病原菌26株，其形態基本一致。25 ℃黑暗培養，7 d能長滿PDA平板，菌落初期為白色，菌絲短絨毛狀，呈放射狀，菌落無色素產生（圖1-A、1-B）。培養40 d以后，菌落背面逐漸變成黑褐色，菌株產生分生孢子器，黑褐色，散生，分生孢子器頂部分泌不規則黃色分生孢子角（圖 1-C、1-D、1-E）。分生孢子角內產生兩種類型的分生孢子，α型分生孢子無色透明，橢圓形，兩端鈍圓，無隔膜，具有兩個油球，大小為（6.52～9.05） μm×（2.19～" 3.25） μm；β型分生孢子單胞，無隔膜，無油球，線形，一端直，另一端稍彎曲，（22.79～36.75）"" μm×（1.24～1.92） μm（圖1-F）。該形態特征與間座殼屬（Diaporthe）真菌的形態描述相吻合。

2.2 致病性測定

體外接種試驗表明，菌株SS1能夠引起葡萄果實嚴重腐爛（圖2），接種5 d后果實表面長滿菌絲體，組織潰爛，發病率100%，病情指數44.38%（圖3）。由發病組織重新分離純化病原菌，獲得菌株與接種菌株形態一致。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

將PCR產物測序獲得菌株SS1和SS2的ITS、 cal、 tef和 tub序列，并上傳GenBank，獲得登錄號（菌株SS1 的ITS：MW644526， cal：OQ718912， tef：OQ718913， tub：OQ718914；菌株SS2的ITS：MW644527，cal：OQ718915，tef：OQ718916，tub：OQ718917）。經過BLAST分析后下載相關同源序列構建多基因進化樹。系統進化樹表明，菌株SS1、SS2與D. nobilis聚為一支，并且自舉支持率為 98%，說明菌株SS1、SS2均為D. nobilis（圖4）。

2.4 室內殺菌劑毒力測定

研究結果表明，6種藥劑對間座殼菌株SS1的菌絲生長均有不同程度的抑制作用，并且供試藥劑濃度越高，對病原菌抑制作用越強。其中50%咯菌腈可濕性粉劑、80%嘧霉胺水分散粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑的抑菌效果好，EC50值分別為0.01" μg/mL、0.02" μg/mL和0.88""" μg/mL，其他藥劑抑菌效果不佳（表2）。

3 討論與結論

間座殼菌（Diaporthe spp.）是一種重要的植物病原菌，常引起葉斑病、軟腐病、黑點病、枝（莖）枯病、蒂腐病、潰瘍病等植物病害，造成嚴重的經濟和生態損失[20-22]。已有文獻報道D. eres可引起梨僵芽[22]、甜櫻桃葉斑病[23]、南天竹葉斑病[24]、花椒枝枯病[25]、黃精葉枯病[26]、藍莓莖枯病[27]等。D. nobilis可引起梨樹枝枯病[28]、蘋果枝枯病[29]等。D. tulliensis可引起茉莉莖潰瘍[30]、咖啡葉枯病[31]、可可豆莢腐病[32]、菩提樹葉斑病[33]等。D. phaseolorum可引起白及葉斑病[34]、藍莓潰瘍病[35]等。而對間座殼屬引起的果蔬采后病害報道較少，Thomidis等[36]曾報道過D. ambiguay引起獼猴桃采后腐爛病，Xiao等[37]報道 D. fusicola引起的桃子采后腐爛，本研究結果表明D. nobilis可引起‘陽光玫瑰’葡萄采后果實腐爛。

室內藥劑篩選可以獲得病原菌的高敏感殺菌劑，為采后病害防治提供參考。高瑞雪等[25]通過測定殺菌劑對花椒枝枯病（D. noblis）的室內毒力，發現30%唑醚·戊唑醇懸浮劑、30%戊唑·多菌靈懸浮劑和6%丙唑·多菌靈懸浮劑的抑菌作用較為顯著；王麗等[38]通過室內毒力及田間防效測定發現20%烯肟·戊唑醇懸浮劑等9種藥劑對獼猴桃黑點病菌（D.phaseolorum）的抑菌效果極強。范艷妮等[31]報道殺菌劑97.2%咪鮮胺和50%咪鮮胺錳鹽對咖啡葉枯病（D. tulliensis）的室內毒力最強。本研究發現50%咯菌腈可濕性粉劑、80%嘧霉胺水分散粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑對D. noblis抑制效果較好。這為防治采后由Diaporthe spp.引起的植物病害提供了參考。

本研究對儲藏期葡萄果實腐爛進行病原菌分離、鑒定及致病性測定， 并室內篩選了殺菌劑。結合真菌形態學特征以及多基因分子系統發育分析對病原菌進行鑒定，確定該病害的病原菌為D. nobilis，室內殺菌劑篩選表明50%咯菌腈可濕性粉劑、80%嘧霉胺水分散粒劑和50%異菌脲可濕性粉劑的抑菌效果好。

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Identification of" Diaporthe" nobilis as Postharvest Decay in Grapes and Screening of Fungicide for Disease Control

FENG Baozhen1， LI Peiqian1， CHEN Dandan1， DING Chunshuang1 and" CHEN Cunkun2

（1.Department of Life Science，Yuncheng University， Yuncheng"" Shanxi 004000， China; 2.Institute of Agricultural

Products Preservation and Processing Technology， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China）

Abstract In order to effectively prevent and control postharvest diseases of grapes， this study aimed to isolate and characterize pathogens responsible for decay during storage. Pathogenic strains were"" isolated， purified， and identified based on morphological features and multilocus phylogenetic analysis， while the pathogen’s" susceptibility to six fungicides was assessed using the mycelial growth rate method. The isolated strains exhibited consistent morphological characteristics， and their pathogenicity was confirmed through Koch’snbsp; postulates. Molecular and phylogenetic analysis based on four gene regions—internal transcribed spacer （ITS）， calmodulin （cal）， translation elongation factor （tef）， and β-tubulin （tub）—identified the pathogen as Diaporthe nobilis. Fungicide sensitivity test showed that 50% fludioxonil wettable powder and 80% pyrimethanil wettable powder exhibited the highest inhibitory efficacy， with EC50 of 0.01 mg/L and 0.02 mg/L， respectively， followed by procymidone ， with an EC50 of 3.25" mg/L.

Key words Grape;Postharvest decay; Diaporthe; Identification; Fungicides

Received 2023-07-18 Returned 2023-10-09

Foundation item Natural Science Foundation of Shanxi Province （No.20210302123084，No.20210302123087）; Characteristic Agricultural Products Development Research Project of Shanxi Province （No.SKX-202205）.

First author FENG Baozhen， female，professor.Research area：postharvest disease control. E-mail： fengbaozhen@ycu.edu.cn

Corresponding"" author LI Peiqian， male，professor，master supervisor.Research area：postharvest disease control. E-mail：lipeiqianfly@126.com（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

收稿日期：2023-07-18 修回日期：2023-10-09

基金項目：山西省自然科學基金（20210302123084，20210302123087）；山西省特色農產品發展學科群科研項目（SKX-202205）。

第一作者：馮寶珍，女，教授，研究方向為果蔬采后病害的防治。E-mail： fengbaozhen@ycu.edu.cn

通信作者：李培謙，男，教授，碩士生導師，研究方向為果蔬采后病害的防治。E-mail： lipeiqianfly@126.com