多孢木霉HZ-31侵染后野燕麥代謝物的變化及其代謝途徑分析

摘 要 多孢木霉HZ-31是1株對野燕麥具有高效防除效果的病原真菌，為探究其侵染野燕麥后的代謝物變化及關鍵代謝途徑，通過活體噴霧法將多孢木霉HZ-31孢子接種于野燕麥幼苗，并對侵染前（0 d）及侵染后3 d的野燕麥幼苗葉片進行代謝組學測定。結果顯示，與對照組相比，多孢木霉HZ-31侵染野燕麥3 d后，篩選到134個顯著差異代謝物，其中上調57個，下調77個。KEGG富集結果顯示，差異代謝物主要富集在次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、跨膜運輸途徑中。黃嘌呤核苷、N-乙酰基-L-苯丙氨酸、奎尼酸、異黃酮等代謝物是次生代謝物的生物合成和氨基酸代謝途徑中變化量較大的代謝物。

關鍵詞 多孢木霉；野燕麥；代謝組學

野燕麥（Avena fatua L.）為1 a生單子葉雜草，是青海省耕地中最常見和最難控制的雜草之一。在加拿大[1]、北美[2]和澳大利亞[3]的谷類作物中為害嚴重，是春季谷類作物中最具侵略性的雜草之一。盡管目前仍有化學除草劑可用于控制野燕麥，但其應用所引起的野燕麥抗藥性卻不斷增強[4]，且化學除草劑也在不斷危害著作物生長環境，尤其對青海省脆弱的生態環境造成嚴重威脅。相比于化學農藥，以真菌、細菌和病毒等生物活體或其代謝產物為主要成分的生物農藥對生物抗藥性和環境會更加友好。其中病原菌可以分泌毒素殺死植物細胞，導致維管束堵塞、葉子產生病斑和潰瘍，或引起與營養缺乏相關的輕微癥狀，如萎蔫和發育遲緩。多孢木霉（Trichoderma polysporum）HZ-31菌株是青海省農科院植保所有害生物綜合防治實驗室篩選出的一種雜草病原真菌[5]，它對青海省多種農田雜草可以表現出高效的除草活性，其中對野燕麥的防除效果最佳，防除效果可達到90%以上[6]。代謝組學技術可通過現代的檢測分析技術對有害生物侵染下植物中的代謝物進行定性和定量分析[7]，從而解析植物與有害生物互作的作用機制。彭玉飛等[8]研究發現瓜笄霉（Choanephora cucurbitarum）在侵染藜麥后會導致藜麥中花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成等代謝途徑發生變化，并阻礙茉莉酸的積累和黃酮、黃酮醇的生物合成。王富鑫等[9]解析了黃芪響應尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染的代謝產物變化情況，發現黃芪接種尖孢鐮刀菌后，有62種代謝物發生顯著的變化，其中黃酮類以及維生素B2、色氨酸、水楊酸的相對含量增加，而皂苷類的相對含量減少。Mayo-Prieto等[10]分析了豆類代謝組在病原真菌（立枯絲核菌）與拮抗真菌（毛簇木霉）相互作用期間發生的變化，通過LC-MS分析對216種化合物進行了表征，互作組中36種化合物與對照植物存在顯著差異，這些化合物分為：2種氨基酸、3種肽、1種碳水化合物、1種糖苷、1種脂肪酸、2種脂類、17種黃酮、4種酚和4種萜烯。

本研究利用代謝組學技術對生防菌多孢木霉HZ-31侵染野燕麥葉片前后進行代謝組學研究，并對差異代謝物進行功能富集，從而探究野燕麥響應多孢木霉HZ-31侵染相關的代謝物種類，研究結果為解析多孢木霉侵染野燕麥的分子機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

1.1.1 供試菌株 多孢木霉HZ-31菌株分離自青海省湟中縣罹病大刺兒菜莖基部，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.12867。

1.1.2 供試雜草 野燕麥種子經消毒、催芽后，選露白一致的播種在塑料花盆中（直徑20 cm，高14 cm）中，每盆播50粒，共12盆，澆足水后置溫室培養，常規管理。溫室晝/夜溫度（25 ± 1）℃/ （20 ± 1）℃，相對濕度65%～75%，光照強度" 600～800 μmo/（m2·s）。當幼苗2葉1心時進行疏苗，每盆保留一致壯苗約30株，待其生長至8～10 cm備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將供試雜草隨機分為2組，以接種HZ-31孢子懸浮液為處理組（M），孢子濃度為 1.0×108 mL-1，每盆接種10 mL；以接種等量清水為對照組（CK），每組6個重復。接菌3 d后，取野燕麥的第2片完全展開葉放置于冷凍管中，并迅速放入液氮冷凍15 min左右，在-80 ℃保存備用。

1.2.2 樣品提取 將冷凍好的野燕麥葉片放入提前準備好的研缽中研磨后取100 μL放入EP管中，加入300 μL甲醇，20 μL內標混勻，并在冰水浴中超聲10 min，-20 ℃靜置1 h，4 ℃下" 13 000 r/min離心15 min，取出上清液后制成樣本質控（QC）樣本，上機檢測。

1.2.3 色譜采集 使用ACQUITY UPLC HSS T3 型色譜柱進行色譜采集，流動相A為水（ 25 mol/mL醋酸銨及25 mol/mL氨水） ，B為100%乙腈。洗脫梯度：0～0.5 min，95%B;"" 0.5～7 min，95%B～65%B; 7～8 min，65%B ～ 40%B; 8～9 min，40%B; 9～9.1 min，40%B～95%B; 9.1～12 min，95%B。流速為500"" μL/min，進樣體積為 1 μL。使用AB 5600 Triple TOF質譜儀控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）基于IDA功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應的二級質譜數據。轟擊能量：30 eV，15張二級譜圖每50 ms。ESI離子源參數設置如下：霧化氣壓（GS1）：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V（正離子模式）或-4 000 V（負離子模式）。

1.3 數據處理

樣本質控（QC）分析，使用Prote-oWizard質譜軟件將質譜原始數據轉成mz XML格式，再使用 XCMS（ version 3.2） 進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等處理minfrac設為0，cutoff設為0.6。同時使用自撰寫R程序包和自建二級質譜數據庫對峰進行物質鑒定。主成分分析（PCA）采用SIMCA軟件顯示原始數據的二維及三維分布，并進一步進行模型驗證。采取正交偏最小二乘法判別分析（ Orthogonalprojections to latent structures-discriminant analysis，OPLS- DA）與模型的 VIP （ Variable importance in the projection） 值相結合的方法來篩選差異代謝物，篩選的標準為 VIP＞1，且顯著性達到 P＜0.05。差異代謝物的統計使用Excel 2016。基于t檢驗計算各代謝物在兩組間統計學顯著性（P-value），并計算代謝物在兩組間的差異倍數log2（Fold change），同時還使用KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）數據庫來搜索代謝物" 途徑。

2 結果與分析

2.1 樣本質控（QC）分析

如圖1所示，在陰、陽離子條件下質控QC樣本的離子流的曲線基本重疊在一起，表明整個試驗操作和分析方法的穩定性、可靠性較高，樣品檢測結果可靠，試驗誤差較小。

2.2 主成分分析（PCA）

由PCA分析結果（圖2）可知，對照組CK與處理組M在三維空間上可以明顯區分，第1主成分（PC1）上也有明顯分離，CK各樣品位置均位于PC1負半軸，M各樣品位置均位于PC1正半軸，說明對照組樣品和處理組樣品在代謝物組成上有明顯差異。CK與M各樣品對應的點在PC2中的區分，表明多孢木霉HZ-31對野燕麥的代謝物有實質性的影響。CK各樣品單個樣本間在第1主成分（PC1）、第2主成分（PC2）離散程度顯著，M各樣本表現出組內聚集趨勢。其中，第1主成分（PC1）的貢獻率為55.26%，而第2主成分（PC2）貢獻率則為16.31%，二者累計貢獻率達到71.57%，表明CK與M代謝調控不同。

2.3 差異分組的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

利用 OPLS-DA 方法，將對照組和處理組共 12 個樣品的標準數據進行分析（圖3） 。從圖3可以看出，樣品處理組和對照組 6 個生物學重復的數據點檢測結果均很好地分成兩組，并分別集中在一起。OPLS-DA 分析方法評價模型的預測參數有 R2X、R2Y 和 Q 其中 R2X 和 R2Y分別表示所建模型對 X 和 Y 矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，這 3 個指標越接近于 1 時表示模型越穩定可靠，Q2＞ 0.5 時可認為是有效的模型。本研究模型的評價參數 R2X，R2Y 和 Q2分別為 0.673、0.996和 0.964，參數均超過 0.5。說明本試驗建立的OPLS-DA 模型可為后續的數據分析提供支持。對OPLS-DA模型的置換驗證如圖4所示，Q2Y以及 R2Y 都沒有超過所對應的臨界線，且Q2Y 和Q2的P值均小于0.05，說明 OPLS-DA 模型不存在過擬合現象，模型較佳。

2.4 差異代謝物篩選

處理組較對照組一共篩選到134個顯著差異代謝物，其中上調代謝物57個，下調代謝物 77 個（圖4）。這些差異代謝物包括多種苯丙類和聚酮類、雜環化合物、有機氧化合物、有機酸及其衍生物、核苷酸和類似物、酚類、脂質和類脂分子、生物堿及其衍生物、類黃酮等。表1為差異代謝物log2（Fold change）最大的10種差異代謝物，其中2 E-二十碳烯酸的log2（Fold change）最大，達到了7.20倍。

2.5 差異代謝物熱圖分析

將比較對照組和處理組間的差異代謝物進行數據歸一化后進行聚類分析并作圖，可直觀展示差異代謝物在比較組中的積累差異，如圖5所示，對照組和代謝組有明確的高表達區域和低表達區域，對照組表達量高的代謝物在處理組中表達量降低，對照組表達量低的代謝物在處理組中表達量增加。說明對照組與處理組比較代謝物含量發生了顯著的變化。

2.6 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

差異代謝物在生物體內形成多條代謝通路，使用 KEGG 數據庫對顯著差異代謝物進行注釋， KEGG 注釋到的代謝物共52種，代謝通路共68條。差異代謝產物共注釋到4條主要的代謝過程，分別為次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、跨膜運輸，其中氨基酸代謝過程為差異代謝產物注釋的主要通路。差異代謝物除了主要富集在上述生物合成途徑中外，還分別在其他氨基酸的代謝富集到11個、核苷酸代謝7個、翻譯8個。選取通路中注釋到差異代謝物最多的top20條目信息，繪制匯總條形圖（圖6），結果顯示，ABC轉運、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、嘌呤代謝、氨酰生物合成通路富集到的差異代謝物數目最多。根據差異代謝物差異豐度得分圖7可知，在多孢木霉HZ-31侵染野燕麥后KEGG富集通路中大多數的差異代謝物都呈現下調趨勢，說明多孢木霉HZ-31抑制了野燕麥中大多數代謝物的合成，從而影響野燕麥的生長。

2.7 兩組樣本的代謝差異

如表2所示，在氨基酸代謝途徑中處理組與對照組相比有15種差異代謝物表現為下調，4種差異代謝物表現為上調。N-乙酰基-L-苯丙氨酸上調變化最大，log2（Fold change）達到了 3.81倍。下調的差異代謝物以奎尼酸、L-谷氨酸鹽、6 羥基褪黑激素、β-羥基異戊酸的log2（Fold change）變化較大，分別達到了-2.42、-1.63、" -1.47和-1.42。說明多孢木霉HZ-31侵染野燕麥可能影響葉片內的氨基酸代謝。

如表3所示，處理組與對照組相比在次生代謝產物的生物合成途徑中有14種差異代謝物表現為下調，3種差異代謝物表現為上調。上調物質有黃嘌呤核苷、黃嘌呤、羅漢松樹脂酚3種物質，log2（Fold change）分別達到了 1.90、1.59、" 1.38。下調的差異代謝物以異黃酮、銀松素和柚苷的 log2（Fold change）變化較大，分別達到了" -2.67、-1.93和-1.56。而這些下調代謝物多為次生代謝物，說明多孢木霉HZ-31侵染野燕麥可能影響葉片內的次生代謝產物的生物合成。

3 討" 論

氨基酸是蛋白質的組成部分，在生物合成、信號傳遞、應激反應以及植物脅迫響應中發揮作用[11]。 除了作為蛋白質組分的作用外，氨基酸還參與很多細胞反應，影響植物的多個生理過程，如植物生長和發育、細胞內pH控制、代謝能量或氧化還原能力的產生，以及對非生物和生物脅迫的抵抗力[12] 。此外，幼苗的能量需求必須由氨基酸氧化和其他存儲化合物（如脂肪酸和淀粉）的降解來滿足，直到光合系統完全發揮作用[13]。本研究發現野燕麥在多孢木霉HZ-31的侵染下，有14個代謝通路的變化與氨基酸代謝有關，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑富集到的代謝物最多。這與趙里曼等[14]研究的探究環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）對小麥幼苗生理及代謝的影響中氨基酸代謝途徑的結果一致。一些氨基酸（例如絲氨酸、脯氨酸和亮氨酸）本身被證明是信號分子，其他氨基酸是合成具有信號功能的植物激素或其他次級代謝物的前體[15]。在葉片中，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺是氮同化的主要產物[16]。一些氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和脯氨酸）的氧化直接將電子送入線粒體電子傳輸鏈[17]。本研究中絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸的表達量在多孢木霉HZ-31侵染野燕麥后都發生了顯著的變化，這說明多孢木霉HZ-31在侵染野燕麥時可能干擾了野燕麥的信號傳導、有機酸生物合成等過程。另外多孢木霉HZ-31的侵染導致野燕麥葉片多種氨基酸發生變化，破壞了氨基酸代謝的正常穩定過程。

次生代謝物是次生代謝過程中產生的低分子量化合物，包括一系列有機酸、黃酮類、單寧、萜類、生物堿、聚乙炔和簡單酚類化合物，有助于植物與生物和非生物環境相互作用[18-19]。植物次生代謝產物可以具有調節功能并作為初級代謝物前體[20]，黃酮類化合物還參與調節植物生長、發育和環境反應，類黃酮通過多種機制調節生長素的轉運，包括與生長素轉運體和轉運調節蛋白的相互作用[21-22]。而本研究中多孢木霉HZ-31侵染野燕麥后類黃酮較侵染前下調了2.67倍。張坤等[23]研究發現撲草凈脅迫香根草葉片下也有許多黃酮類物質發生了顯著下調。本研究發現多孢木霉HZ-31侵染野燕麥后葉片中有17中差異代謝物被注釋到次生代謝產物的生物合成途徑中，是除氨基酸代謝途徑外注釋差異代謝物最多的途徑，這與柴楠[24]研究的索邦百合響應橢圓葡萄孢（Botrytis elliptica）侵染后差異代謝物注釋通路結果一致，說明多孢木霉HZ-31的侵染可能會影響野燕麥次生代謝產物的合成，從而發揮其致病性。

綜合分析多孢木霉HZ-31侵染野燕麥后差異代謝物下調數量高于上調數量，主要在氨基酸代謝途徑、次生代謝物生物合成途徑等，推測它們是多孢木霉侵染野燕麥的主要作用途徑。代謝組學作為一種研究基因組學和系統生物學的工具，用來分析生物脅迫下的植物基因功能與機制還遠遠不夠，本研究將開展多組學聯合分析，進一步揭示多孢木霉HZ-31侵染野燕麥機制。

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Changes in Metabolite and" Metabolic Pathway Analysis of Avena fatua after Infection with Trichoderma polysporum" HZ-31

ZHU Haixia1，2，3，HE Yushan1，2，3 and" CHENG Liang1，2，3

（1.Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Qinghai University，Xining 810016，China; 2.Xining Crop Pest Science Observation Experimental Station，Ministry of Agriculture，Xining 810016，China; 3.Key Laboratory of Comprehensive Control of Agricultural Pests，Xining 810016，China）

Abstract Trichoderma polysporum HZ-31 is a pathogenic fungus with high efficacy against Avena fatua L. In order to investigate the metabolite changes and key metabolic pathways following infection of A. fatua， T.polysporum HZ-31 spores were inoculated onto A. fatua seedlings by in vivo spraying method. Metabolomic analysis of the seedling leaves treated with A. fatua before （0 d） and after （3 d） infection was performed. The results showed that compared with the control group，134 metabolites were identified after T.polysporum" HZ-31 infected A. fatua for 3 days，of which 57 were up-regulated and 77 were down-regulated. KEGG enrichment analysis showed that differential metabolites were mainly concentrated in the biosynthesis of secondary metabolites，carbohydrate metabolism，amino acid metabolism，and transmembrane transport pathways. Xanthine nucleoside，N-acetyl-L-phenylalanine，quinic acid，isoflavones and other metabolites are the most significantly altered metabolites in the biosynthesis and amino acid metabolism of secondary metabolites.

Key words Trichoderma polysporum; Avena fatua" L.; Metabolomics

Received 2024-05-15 Returned 2024-06-14

Foundation item National Natural Science Foundation of China（No.32460683）; Qinghai Provincial Basic Research Program（No.2024-ZJ-928）.

First author ZHU Haixia，female，Ph.D，associate research fellow.Research area：biological control of weeds.E-mail：zhuhaixia0101@163.com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）

收稿日期：2024-05-15 修回日期：2024-06-14

基金項目：國家自然科學基金（32460683）；青海省基礎研究項目（2024-ZJ-928）。

第一作者：朱海霞，女，博士，副研究員，研究方向為雜草生物防治。E-mail：zhuhaixia0101@163.com