白刺VQ基因家族的鑒定及分析

摘 要 VQ蛋白（VQ motif-containing proteins）在高等植物的質體中起著轉錄調控作用且與植物耐干旱、鹽堿有很大關系。為了獲得白刺VQ基因家族蛋白的基本特征以及白刺VQ基因在干旱和鹽脅迫下的表達特征，本研究基于白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）全長轉錄組數據，通過生物信息學手段鑒定并分析了白刺VQ家族蛋白的基本特征，基于白刺以及擬南芥VQ蛋白序列，利用MEGA軟件建立了VQ蛋白的系統發育樹，最后利用qRT-PCR方法對NtVQ7基因的組織特異性表達特征以及干旱和鹽脅迫下的表達特征進行了分析。結果表明，從白刺轉錄組中共鑒定出7個具有完整FxxxVQxLTG保守結構域的NtVQ家族成員，分別命名為NtVQ1～NtVQ7；氨基酸數目為155～320，分子質量為17.13～34.86 ku，等電點分布為" 5.23～10.81，不穩定指數為37.4～93.77，且均為親水性蛋白；除NtVQ2定位在細胞外或細胞核中，其余的成員均被定位在細胞核中；系統發育樹顯示NtVQ1與NtVQ2、NtVQ3與NtVQ7的親緣關系最近；葉片中的NtVQ7對PEG和NaCl脅迫做出不同響應，相對于PEG脅迫NtVQ7對鹽脅迫更加敏感，且在鹽脅迫后恢復過程中其表達量恢復上調；另外，該基因在不同組織器官中呈現不同的表達特征。

關鍵詞 VQ基因家族；白刺；生物信息學；表達特征；脅迫

VQ蛋白（VQ motif-containing proteins）最早是由Morikawa等[1]從擬南芥中發現的一種核編碼蛋白（Sigma factor binding protein，SIB），能夠參與改變質體RNA聚合酶（Plastid RNA polymerase）啟動子的偏好性。隨后，此類蛋白在多種植物中被發現，因這類蛋白的序列中含有纈氨酸（Valine，V）和谷氨酰胺（Glitamine，Q）而被命名為VQ蛋白，且發現這種蛋白都具有一個完全保守的模序：FxxxVQxLTG（x為任意氨基酸）[2]。研究表明VQ蛋白在高等植物的質體中起著轉錄調控作用，能夠參與植物的眾多生命活動，如種子發育[3]、幼苗光形態建成[4]和葉片衰老[5]等，還參與響應生物和非生物脅迫[6]。目前，已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）[7] 、水稻（Oryza sativa）[8]、玉米（Zea mays）[9]、大豆（Glycine max）和葡萄（Vitis vinifera）[10-11]中分別鑒定出34、39、61、74和18個VQ基因家族成員[7-11]，研究表明這些成員在結構、表達特征以及功能上均存在差異。

一些研究發現VQ基因與植物耐干旱、鹽堿有很大關系[12]。翟明明[13]在馬鈴薯中發現，短時間鹽脅迫會使 StVQ31表達顯著上調，其相對表達量高達對照的15倍，表明 StVQ31在馬鈴薯耐鹽方面起著重要作用。李桂平[14]報道干早處理下，大豆可通過WRKY轉錄因子與VQ蛋白協作來調控抗旱過程，提高植株抗旱性。在非生物脅迫響應方面，VQ蛋白與WRKY轉錄因子的互作除了合作關系外，還具有拮抗作用[15]。Hu等[15] 發現鹽脅迫能夠強烈誘導 AtVQ9，并且發現 VQ9與 WRKY8通過拮抗作用調控鹽脅迫響應活動。

白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）為蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺屬（Nitraria）的灌木，主要分布于中國西北地區[16-17]。白刺主要生于荒漠和半荒漠地區的湖盆沙地、山前平原積沙地和有風積沙的粘土地，其具有極強的耐干旱、鹽堿和耐貧瘠的能力，是很多荒漠區域的建群種，也是防風固沙的先鋒樹種[18-19]。目前，由于全球氣候波動和不合理利用造成的土地鹽堿化、荒漠化不斷加劇，嚴重影響了農林牧業的收益，發掘抗逆基因，對植物進行遺傳改良是改善這一局面的有效途徑[20]。白刺作為抗逆性極強的代表性植物對其抗逆基因的研究顯得十分必要，VQ基因家族在植物抵御逆境脅迫中發揮重要作用，然而目前未見對白刺VQ基因研究的報道。基于此，本研究通過生物信息學手段對白刺全長轉錄組數據進行分析，鑒定白刺VQ基因家族成員，預測其蛋白的理化性質、保守結構域、系統進化關系，并利用實時熒光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）研究白刺VQ家族基因在干旱和鹽脅迫下的表達特征以及組織特異性表達模式，旨在為進一步研究白刺VQ家族基因的功能及作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料培養與處理

試驗材料為2019年8月在青海省格爾木市諾木洪農場采集的唐古特白刺種子。經凈選處理后儲存在4 ℃備用。同年10月，將種子放在裝有河沙（清洗、高溫消毒）的花盆中進行播種，并置于培養間培養，培養條件為：光照18 h，黑暗6 h，白天溫度（26±1）℃，夜晚溫度（22±1）℃，相對濕度60%～70%。每3 d將蒸餾水灌入花盆底部的托盤中，直到沙子被完全浸濕[21]。

培養2個月后，選擇發育良好且生長一致的幼苗，在相同的培養條件下轉移到1/2霍格蘭（Hoagland）營養液中，用氧氣泵向培養盆中全天充氧。幼苗適應培養3 d后，將材料轉移到營養液配置的處理溶液中，進行脅迫處理。采用不同濃度（10%和30%）的PEG-6000營養液模擬干旱脅迫，分別在處理2、12和24 h后采集樣品；用200和450 mmol/L的NaCl營養液進行鹽脅迫，分別在處理2、12、24和48 h時取樣9株幼苗，每生物學重復3株苗，收集全部葉片后迅速放入液氮中，然后儲存在-80 ℃冰箱待用。以1/2霍格蘭營養液為對照組，對照組收集根、莖、葉材料，速凍后冷凍儲存待用[21]。

1.2 數據分析方法

1.2.1 家族成員鑒定 筆者根據前期工作中的三代轉錄組數據（原始數據已上傳至NCBI GenBank數據庫、登錄號為SAMN16709478），利用注釋信息初篩得到24條VQ家族轉錄本序列，除去重復序列后，用DNAMAN 6.0 將轉錄本序列翻譯成氨基酸序列并放入Pfam（http：//pfam.xfam.org/）在線軟件和NCBI的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）數據庫中進行保守結構域分析[22]，通過與2個數據庫的比對，去除不含有VQ保守結構域的序列，之后利用本地的CDS（Coding Sequence）數據庫和ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件共同預測白刺VQ蛋白序列CDS的完整性，去除不完整的序列，獲得的序列被鑒定為白刺VQ蛋白序列[23]。

1.2.2 蛋白理化性質預測分析 利用在線程序ExPASy（https：//web. expasy. org/protparam/）分析白刺VQ蛋白序列的氨基酸數目、分子質量、等電點、不穩定指數和親疏水性[22]；利用在線軟件PSORT（http：//www.psort.org/）和Cell-PLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）共同預測蛋白的亞細胞定位[24-25]；利用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測蛋白的二級結構，并對參數進行統計分析[23]。

1.2.3 保守基序、保守結構域 利用DNAMAN 6.0對白刺的VQ氨基酸序列進行多序列比對，并標注高度保守的結構區域[22]。利用在線軟件MEME5.54（https：//meme-suite.org/meme/）" 分析蛋白序列的保守基序motif[26]，經驗證基序最多值設置為10，其余為默認值，利用TBtools工具對導出的MEME文本結果進行可視化分析并繪制保守基序圖[27]。

1.2.4 進化樹的構建 基于多序列比對后的氨基酸序列，利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）通過MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，參數設置Bootstrap 1 000，其余參數默認[26]；同上述方法建立白刺（7條）和擬南芥（27條）兩個物種VQ蛋白系統進化樹。

1.2.5 qRT-PCR 采用北京天根生化科技有限公司的RNAprep Pure Plant植物總RNA提取試劑盒提取總RNA（低溫、無菌）。用北京寶生物公司的PrimeScriptTMRT reaget" Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進行反轉錄。反轉錄過程按照說明書進行操作，反轉錄反應：" 37 ℃，15 min；反轉錄酶失活反應：85 ℃，5 s；" 4" ℃保存。利用北京寶生物公司的TB Green Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行qRT-PCR試驗。使用Thermo Fisher Scientific公司的ABI Stepone Plus qRT-PCR儀檢測樣品的CT值。首先將cDNA稀釋至1/10原濃度備用，qRT-PCR反應體系（20 μL）：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×conc.） 10 μL，cDNA模板2.5 μL，正反向引物各0.8 μL（10 μmol/L），ddH2O 5.5 μL，ROX 0.4 μL。反應程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環，設置3個技術重復。利用Primer在線（https：//www.primer3plus.com/index.html）設計特異性強及表達量相對較高的NtVQ7基因的qRT-PCR引物（上游：CACAGCCGAGTCTCCAGTTT；下游：TCTCTCCATCTCGGGCTTGA），以EF1α為內參基因（上游：AGCCTCGTGGTGCATCTC- AACCGA；下游：ACCGTGCCTGTGGGTCGT-GTTGAGA）[28]。預試驗以CK、30% PEG-2 h和450 mmol/L NaCl-24 h的RNA為模板，分析NtVQ基因引物的溶解曲線及CT值，選取表達量相對較高的成員進行后續分析并設置3次生物學重復，采用2-△△CT方法計算基因相對表量[22]。

1.3 統計分析

表達特征分析試驗，利用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）分析處理組之間的差異顯著性（Plt;0.05）[29]。

2 結果與分析

2.1 白刺VQ家族成員及其理化性質

根據全長轉錄組數據庫中注釋結果初篩得到24條VQ基因家族的轉錄本序列，經過保守結構域和蛋白完整性分析篩選出7條蛋白序列，命名為NtVQ1、NtVQ2、NtVQ3、NtVQ4、NtVQ5、NtVQ6和NtVQ7。白刺VQ成員理化性質分析結果如表1所示，白刺的7條VQ蛋白序列的氨基酸數量為155～320，分子質量為17.13～34.86 ku，等電點為5.23～10.81，不穩定指數為37.4～93.77。平均親水系數均為負值，表明這些蛋白均為親水性蛋白。兩個亞細胞定位軟件預測結果顯示NtVQ2定位在細胞核外和細胞核，其余的成員均被定位在細胞核內。白刺VQ蛋白二級結構預測結果顯示（表2），7個蛋白的組成均有α-螺旋、 β-轉角、無規卷曲和延伸鏈，無規卷曲最多，" β -轉角最少。

2.2 白刺VQ家族多序列比對及保守基序分析

對7個白刺VQ蛋白序列進行多重序列比對，結果顯示其一致性為23.33%，中間區域的位置高度相似，且包含VQ家族的保守結構域FxxxVQxxLTG（圖1中紅色方框），N-端變異程度大。這與眾多植物VQ家族的結論相一致，均是氨基酸序列僅在VQ結構域處高度保守，而其他位置的序列則相對多變[30]。另外，對白刺VQ蛋白的保守基序進行分析，將預測的最大值設置為10，僅發現1個顯著的motif1（圖2）。

2.3 VQ家族進化樹分析

圖3-A是由VQ蛋白序列建立的系統發育樹，由圖可以看出白刺VQ家族成員可分為5大組，分別為NtVQ1和NtVQ2一組，NtVQ3和NtVQ7一組，NtVQ4、NtVQ5、NtVQ6均是單獨一組，同一組成員的基序組成十分相似，同時也發現7個成員中均有motif1（圖3-B）。用27條擬南芥VQ蛋白序列與7條白刺VQ蛋白序列構建系統發育樹（圖4），結果分為5大組。這34個VQ蛋白可分為5組：Group1、Group2、Group3、Group4和Group5。其中Group3的成員最多為10個，Group1、Group2、Group4成員分別為6、6、8個，Group5成員最少為4個。另外，根據進化關系，分析得出NtVQ3和At1G78310及NtVQ5和At1G28280親緣關系較近，它們的基因可能是直系同源基因。

2.4 NtVQ功能注釋及解析

對7個NtVQ成員在公共數據庫（COG、GO、KEGG、KOG、Swissprot、eggNOG、NR）中的注釋結果進行分析。發現NtVQ在GO中被注釋到了3個功能類中，其中“分子功能”" （Molecular function）共有2個亞類，“細胞組成”（Cellular component）有2個亞類，“生物學過程”（Biological process）有6個亞類；在Swissprot中注釋到1功能；NR中被注釋到4個功能。對各數據庫中的所有注釋進行歸納分析，NtVQ的功能可被分為14種（表3）。其中僅NtVQ4沒有被上述數據庫注釋，且其余成員均注釋到了不同功能，大多數成員參與了轉錄調控過程中的DNA結合的功能。涉及抗逆生理功能的包括NtVQ1參與生物脅迫防御活動，NtVQ3參與鹽脅迫調控活動。

2.5 白刺NtVQ7基因的組織器官特異性表達" 分析

如圖5所示，白刺植株在正常條件下，NtVQ7在根、莖、葉中的表達存在差異，總體上葉中的表達量最高，其次是莖中，根中的表達量最低。

2.6 白刺NtVQ7基因在脅迫處理中的表達分析

如圖6所示，低濃度PEG脅迫處理下，NtVQ7表達量總體呈現下降趨勢，并且脅迫恢復" 1 h（R-1 h）后，表達量未再升高。高濃度處理早期（2 h）表達顯著上調至最高，2 h之后隨時間延長表達量降低且低于對照，恢復組顯著低于對照組和24 h的表達量。

如圖7所示，無論是低濃度還是高濃度的鹽處理下，NtVQ7表達量均呈現先上升后下降的趨勢，且在脅迫后期（24 h）表達量最高，另外，在高、低濃度處理下，恢復1 h較48 h時NtVQ7表達量均顯著上調。與高濃度處理不同的是，低濃度處理的表達量在脅迫初期（2 h）就開始顯著增加；高濃度處理組在中期（12 h）才開始顯著增加。

3 討" 論

干旱和鹽脅迫是西北干旱、半干旱地區植物生長最常遇到的兩種非生物脅迫，研究荒漠植物的抗逆基因功能對作物、林木和牧草的抗逆性遺傳改良有指導作用，探究這些基因在抗逆過程中的表達特征是解析其功能的基礎。本試驗中NtVQ7在干旱和鹽脅迫下呈現不同的表達特征。首先，PEG模擬干旱脅迫下，NtVQ7僅在高濃度脅迫早期（2 h）時表達顯著上調，其他處理下表達均下調；而在鹽脅迫下，大多數處理中均上調。另外，NtVQ7對干旱和鹽處理恢復1 h后的響應也是不同的，干旱恢復后該基因表達沒有上調，而在鹽脅迫恢復后表達顯著上調。總體來看，與干旱脅迫相比，NtVQ7對鹽脅迫更加敏感且可能在鹽脅迫恢復后的某些生理過程中發揮重要作用。系統發育樹結果顯示，NtVQ7與NtVQ3關系最近，功能上的相似度也應該是很高的。對 NtVQ3數據庫注釋結果分析發現，涉及的生物學過程為“細胞內鉀離子穩態”“細胞內鈉離子穩態”“鹽脅迫應答負調控”“DNA結合轉錄因子活性負調控”。其中前3個生理過程均與植物響應鹽脅迫有關，這與本試驗中相對表達量分析的結果：NtVQ7對鹽脅迫的響應更加敏感相似，也再次證明NtVQ7可能在白刺耐鹽過程中發揮重要作用。

亞細胞定位預測對解析蛋白的生物學功能有重要幫助[31]，本試驗中用兩個在線軟件對NtVQ家族成員的亞細胞定位進行了預測，PSORT預測結果顯示NtVQ2還被定位在細胞外，說明該基因可能在細胞外發揮一定的功能。在上文所述的Swissprot數據庫中 NtVQ2被注釋為葉綠體轉錄起始因子結合蛋白1，因此在葉綠體中發揮作用；另外系統發育樹結果顯示，NtVQ2與擬南芥中的AT2G41178和AT2G41180親緣關系最近，可能是同源蛋白，通過查詢擬南芥TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）發現這兩個蛋白分別被注釋為轉錄起始因子結合蛋白SIB1和SIB2，正向調控轉錄因子與DNA的結合，并且兩個蛋白均被定位在葉綠體和細胞核中[32]；茶樹和棉花的研究中VQ成員也被定位于細胞核和葉綠體中，這些與本試驗預測的結果有所不同[33-34]。對NtVQ2與其他NtVQ家族成員的motif種類進行比較，發現NtVQ2的6個motif與其他成員的motif均有重復，因此NtVQ2被定位于細胞外可能并不是因為這些保守結構造成的，可能是一些非保守序列或者可預測的二級結構甚至三級結構造成的[35]。

蛋白的結構決定功能，因此本研究在分析了白刺7個NtVQ家族成員結構的基礎上又對這些成員在各數據庫中的注釋信息進行了分析。為了探究更多成員的功能信息，尤其是與抗逆相關的功能，筆者查閱了其他物種中VQ家族的文獻[36-40]，其中在棉花和茶樹的研究中，研究者基于基因組信息對棉花和茶樹VQ家族的結構和功能分別進行了系統地研究[33-34]。因此本研究建立了白刺與棉花以及茶樹的系統發育樹，找到了白刺VQ成員在棉花中的直系同源蛋白，并從棉花文獻中找到對應的功能信息。在這個系統發育樹中，本研究發現NtVQ成員與棉花的親緣關系較近，尤其是與栽培品種Gossypium raimondii Ulbr的關系最近[34]，發現NtVQ1在棉花中的直系同源蛋白是CrVQ22，NtVQ3的是CrVQ35，NtVQ4的是CrVQ3，NtVQ5的是CrVQ38[34]。在棉花VQ家族研究中沒有關于上述CrVQ成員的抗逆相關的功能信息，本研究又從棉花的系統發育樹中找到了這幾個成員親緣關系最近的其他栽培種的成員，并搜集到相應的功能信息，結果是NtVQ1可能與花粉、花瓣的發育有關[34]。NtVQ3和NtVQ5與抗逆相關，可能分別與耐高溫和耐鹽脅迫的生理活動有關[34]。

本研究對白刺的7個NtVQ家族成員的分析顯示，這7個成員具有不同的結構和功能（預測），其中NtVQ3、NtVQ5和NtVQ7可能在耐鹽過程中發揮作用，尤其是NtVQ7可能在鹽脅迫后的恢復中發揮重要作用。本研究為深入研究白刺VQ家族成員的結構和抗逆功能研究提供了理論參考，也可為白刺抗逆遺傳資源用于農、林、牧業植物的遺傳改良提供理論基礎。

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Identification and" Analysis of VQ Gene Family in Nitraria tangutorum Bobr

WANG Lirong1，2，3，HUANG Lixia1，DU Meng1，YI Dan4，WANG Jie5" and" YANG Xinguang1

（1.College of Ecological Environment and Resources，Qinghai Minzu University，Xining 810007，China; 2.Qinghai Provincial" Key Laboratory of High Value Utilization of Characteristic Economic Plants，Xining 810007，China; 3.Qinghai Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Analytical Testing，Xining 810007，China;" 4.College of Forestry，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China; 5.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China）

Abstract VQ motif-containing proteins （VQ）regulate transcription in higher plant plastids and are closely associated with drought and salinity tolerance. To investigate the essential features of VQ gene family proteins in" Nitraria tangutorum and the expression characteristics of VQ genes in" N.tangutorum under drought and salt stress，the VQ family proteins were identified and their bioinformatic characteristics were analyzed based on the full-length transcriptome data. A phylogenetic tree of VQ proteins was constructed using MEGA software，based on the VQ protein sequences of" N.tangutorum and" Arabidopsis thaliana. Finally，the tissue-specific expression characteristics of the NtVQ7 gene under drought and salt stress were analyzed by qRT-PCR. The results showed that seven members of the NtVQ family with conserved domains FxxxVQxLTG were identified from the transcriptome data， specifically NtVQ1-NtVQ7. The amino acid number ranged from 155"" to 320，the relative molecular mass ranged from 17.13 ku to 34.86 ku，the isoelectric point distribution ranged from 5.23 to 10.81，and all of them were hydrophilic proteins. Except for NtVQ2，which is localized either in the cytoplasm or the nucleus，the remaining members were localized within the nucleus. The phylogenetic tree indicated a close relationship between NtVQ1 and NtVQ2，as well as between NtVQ3 and NtVQ7. In this study， NtVQ7 exhibited differential responses to PEG and NaCl stress in leaves. In comparison to PEG stress，NtVQ7 displayed heightened sensitivity to salt stress，this was accompanied by an up-regulation of its expression during the recovery phase from salt stress. Furthermore，NtVQ7 exhibited distinct expression patterns across various tissues and organs.

Key words VQ gene family;" Nitraria tangutorum; Bioinformatics; Expression" characteristics; Stress

Received 2024-04-20 Returned 2024-06-01

Foundation item Natural Science Foundation of Qinghai Province （No.2021-ZJ-944Q）.

First author WANG" Lirong，female，professor，master supervisor. Research area：plant stress physiology and molecular biology. E-mail：shanhupu@163.com

Corresponding"" author YANG" Xinguang，male，associate professor，master supervisor. Research area：ecological restoration. E-mail：yangxg618@163.com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）

收稿日期：2024-04-20 修回日期：2024-06-01

基金項目：[ZK（]青海省自然科學基金（2021-ZJ-944Q）。

第一作者：王麗蓉，女，教授，碩士生導師，研究方向為植物逆境生理與分子生物學。E-mail： shanhupu@163.com

通信作者：楊鑫光，男，副教授，碩士生導師，研究方向為生態恢復。E-mail：yangxg618@163.com