基于指紋圖譜與化學計量學的淡竹葉質量控制研究

摘要：本研究采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）法對15 批淡竹葉樣本進行指紋圖譜分析及對6 種指標性化學成分進行含量測定。采用Origin 2019 軟件及軟獨立建模分類類比法（SIMCA 14.0）軟件分別對淡竹葉6 種成分含量進行聚類分析與主成分分析（Principal Component Analysis， PCA），并對共有峰峰面積進行正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant" Analysis， QPLS-DA）以篩選差異性標志化合物。結果表明，淡竹葉指紋圖譜共匹配出14 個共有峰，指紋圖譜相似性大于0.90。通過對照品指認出異葒草苷（8 號峰）、葒草苷（9號峰）、日當藥黃素（10 號峰）、牡荊苷（12 號峰）、異牡荊苷（13 號峰）、木犀草苷（14 號峰），以mg·g-1為單位，各成分質量分數分別為0.23～1.09、0.17～0.86、0.08～0.67、0.22～0.61、0.02～0.13、0.02～0.06。15 批樣品通過聚類分析分成3類，PCA結果與聚類分析結果一致。研究表明5 種指標性成分（異葒草苷、葒草苷、日當藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷）被篩選為候選差異性標志化合物，可作為指標性成分用于淡竹葉質量控制與評價。

關鍵詞：HPLC指紋圖譜；淡竹葉；化學計量學；黃酮類成分；質量評價

中圖分類號：R917 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2395（2025）02-0216-10

0引言

中藥淡竹葉（Lophatherum gracile Brongn.）為禾本科植物淡竹葉的干燥莖葉，具有解熱、抗菌、利尿等作用，常用于治療發熱和尿路炎癥［1］。“淡竹葉”之名最早記載于《名醫別錄》［2］，其主要化學成分為黃酮類、三萜類、揮發性成分、酚酸類以及多糖等［3-4］。目前，現行的《中國藥典》（2020 版）中公開質量控制標準僅包括顯微鑒別、性狀分析，其中含量測定項并無明確規定。因此，現行的質量標準不能從整體上反映藥材的質量。現代藥理學研究表明，淡竹葉中的木犀草素及其糖苷具有抗菌和抗炎活性［5-6］，芹菜素及其糖苷具有抗氧化和抗腫瘤活性［7］，異葒草苷具有降尿酸作用［8］，日當藥黃素具有抑制皮膚色素沉著的活性［9］，黃酮C-糖苷具有抗病毒活性［10］。因此，在本實驗中將異葒草苷、葒草苷、日當藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷作為“化學標志物”以表征淡竹葉的質量。

中藥化學成分因具有復雜性和難以檢測的特點，其藥理作用往往也是由多個成分協同產生。因此，僅采用單一指標難以把控中藥材整體質量并全面反映其藥效特點［11］。指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的鑒定手段，能夠全面反映中藥的化學成分信息，對中藥的主要化學成分進行宏觀整體表征［12］。近年來，多成分含量測定結合化學計量學，如聚類分析，主成分分析［13］等分析方法，不僅能夠準確鑒別與定量中藥材化學成分，還能對復雜的數據進行整合，可以更加直觀地反映不同產地及批次的質量差異［14-15］。由于淡竹葉在中國不同地區廣泛分布，其有效成分的含量因地理位置、氣候等因素有很大差異。因此，有必要開發一種能分析出更多生物活性成分的質量控制方法。

淡竹葉作為竹葉青酒組方中的主要原料之一［16］，目前尚缺乏科學合理的質量控制方法與質量標準。課題組前期通過超高效液相色譜-四極桿- 飛行時間質譜聯用（UPLC-Q-TOFMS/MS）技術建立了快速表征竹葉青酒化學成分的分析方法［17］，并采用UPLC 技術建立竹葉青酒中7 種化學成分定量的方法［18］。本研究基于HPLC 技術與化學計量學分析方法，建立15批淡竹葉樣本指紋圖譜，并對葒草苷、異葒草苷、日當藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷的含量進行同時測定，為淡竹葉整體質量控制與藥效物質基礎研究提供科學依據，也為竹葉青酒化學成分分析與功效成分傳遞規律解析奠定基礎。

1材料與方法

藥材與試劑：15 批次的淡竹葉藥材采購于河北省安國市中藥材批發市場，編號、產地批準號信息見表1；甲醇、乙腈（色譜純，ThermoFisher 公司）；其余試劑為分析純。

對照品：葒草苷（批號：PS010467）、異葒草苷（批號：PS011444）、牡荊苷（批號：PS012078）、異牡荊苷（批號：PS001063）、木犀草苷（批號：PS013155）、日當藥黃素（批號：PS000796），均購于成都普思生物科技公司，其質量分數均≥98%；

儀器：Agilent 1260 II 代HPLC 系統（DAD檢測器，美國Agilent Technologies 公司）；SartoriusBSA124S 分析天平（德國Sartorius 公司）；CPA225D 分析天平（德國Sartorius 公司）；JM-20D-80 超聲波清洗機（潔盟·深那儀器有限公司）。

2結果與分析

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液的制備

稱取15 個批次淡竹葉粉末各1.000g，精確稱定。加入體積分數70% 甲醇（下同）10 mL，置于50 mL 具塞錐形瓶中，超聲提取0.5 h后，稱重，添加70% 甲醇溶液，以補足超聲提取過程的損失，繼續超聲提取0.5 h。所得的提取液真空抽濾，濃縮并復溶于70% 甲醇中，最后定容于5 mL 容量瓶內，進樣分析前通過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.1.2對照品溶液的制備

精密稱定牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、日當藥黃素、木犀草苷各0.00366g、0.00396g、0.00236g、0.00374g、0.00170 g、0.00382g；分別置于5mL容量瓶中，并加入70% 甲醇定容，分別制成含各對照品0.732 mg/mL、0.792 mg/mL、0.472 mg/mL、0.748 mg/mL、0.34 mg/mL、0.764 mg/mL 的單一對照品溶液。

2.1.3混合對照品溶液的制備

精密吸取牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、日當藥黃素、木犀草苷對照品溶液1000 μL，置于10 mL 容量瓶中，并用70% 甲醇定容，制成混合對照品溶液，并依次稀釋成系列梯度濃度的混合對照品溶液，以待用。

2.2色譜條件［19］

色譜柱：Water symmetry ? C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 體積分數1% 甲酸水（B）；檢測波長：330 nm；進樣量：10μL；流度為1.0 mL/min；柱溫：30℃；梯度洗脫：0～10 min， 8.0%A～10.5%A；10～20min，10.5%A；20～30 min，10.5%A～11.5%A；30～35min，11.5%A～12.5%A；35～39.5 min，12.5%A；39.5～40 min， 12.5%～14.0%A； 40～48 min，14.0%～14.7%A；48～63 min，14.7%～20.0%A；63～75 min，20%～28%A；75～80 min，28%～8%A。

2.3指紋圖譜研究

2.3.1指紋圖譜方法學考察

穩定性試驗：取編號為S2 的樣品粉末，按照2.1.1“ 供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，分別于0h、6h、12h、18h、24h、30 h 進樣分析。計算共有峰保留時間與峰面積的相對標準偏差（RSD），共有峰保留時間及峰面積的RSD 分別位于0.237%～1.954%，0.194%～1.851% 之間，表明儀器穩定性良好，具體結果見表2。

精密度試驗：取編號為S5 的樣品粉末，按照2.1.1 項下“ 供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，將此供試品溶液連續進樣6 次。計算共有峰保留時間與峰面積的RSD，共有峰保留時間及峰面積的RSD分別位于0.142%～1.927%，0.078%～1.889% 之間，表明儀器精密度良好，具體結果見表2。

重復性試驗：取S7 樣品粉末，按照2.1.1“供試品溶液的制備”方法，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定。計算共有峰保留時間和峰面積的RSD，共有峰保留時間及峰面積的RSD 分別位于0.040%～1.953%，0.240%～1.665% 之間，結果表明重復性良好，具體結果見表2。

2.3.2淡竹葉指紋圖譜分析

取15 批次淡竹葉按照2.1.1方法制備成供試品溶液，并按照2.2 色譜條件，進樣分析。通過Agilent 1260 II 代液相處理系統中的Chem?Station 積分事件功能對原始數據進行手動積分處理（主要參數設置如下：斜率靈敏度=0.50；峰寬=0.06 min；最小峰面積=10 μV·s，最小峰面積百分比=0.50），隨后將積分數據導出為.cdf 格式文件，并導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）軟件中進行分析。

指紋圖譜分析流程如下：首先，綜合考慮出峰形狀與數量將S6色譜圖設置為參照圖譜，并以多點校正法進行Mark 峰匹配，自動校正生成對照圖譜后，通過軟件計算各批次色譜圖與對照譜圖的相似度。結果顯示15 批次樣品的HPLC指紋圖譜中共匹配出14 個共有峰，結果見圖1。計算得15 批淡竹葉（H1～H6，S1～S9）指紋圖譜與對照圖譜相似度分別為0.992、0.947、0.953、0.989、0.976、0.975、0.963、0.970、0.931、0.951、0.981、0.987、0.989、0.983、0.968 均大于0.9，表明不同批次淡竹葉樣品質量相對穩定。

2.4多指標成分含量測定

2.4.1系統適應性試驗

2.4.2含量測定方法學考察

重復性、精密度及穩定性試驗參考2.3.1方法，取S7 淡竹葉樣品粉末，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定分析，計算6 種成分保留時間及峰面積的RSD值，均小于2%，表明該方法滿足含量測定的要求，結果見表3。

線性關系考察：精密量取2.1.3制備的系列梯度濃度混合標準品溶液，進樣測定，并記錄峰面積，以峰面積為縱坐標（y），以各混合標準品溶液濃度為橫坐標（x），進行線性回歸分析。結果見表4，結果表明6 個含量測定成分線性關系良好，線性相關系數均大于0.999。

加樣回收率考察：精密稱定S5 淡竹葉粉末3 份，加入樣品各成分0.5倍含量對照品，按照2.1.1 方法制備供試品溶液，并按2.2色譜條件進樣測定，計算各成分的含量，結果各成分加樣回收率為99.37%～103.85%，均符合要求，見表5。

2.4.3含量測定結果

15批次淡竹葉樣本按照2.1.1方法制備供試品溶液，按2.2條件進樣分析，并根據標準曲線法計算各批次藥材中指標成分的含量，結果見表6 所示。淡竹葉中異葒草苷含量為0.2263 mg·g^-1～1.0918mg·g^-1，葒草苷含量為0.1745 mg·g^-1～0.855 3 mg·g^-1，日當藥黃素含量為0.0841mg·g^-1～0.667 8 mg·g^-1，牡荊苷含量為0.2212mg·g^-1～0.608 4 mg·g^-1，異牡荊苷含量為0.0292mg·g^-1～0.126 5 mg·g^-1，木犀草苷含量為0.0217mg·g^-1～0.0647mg·g^-1。

2.5化學計量學分析

2.5.1聚類分析

采用Origin 2019軟件，以平方歐式距離作為距離度量，并采用平均值法（也稱K-means法）對15 批次淡竹葉的6 個指標性成分含量進行聚類分析。如圖2 所示，當平方歐氏距離為0.45 時，15批次樣本可分為3類，其中4個批次（H1、H4、S6、S8）聚為一類；2個批次（S1、S9）聚為一類；8個批次（H2、H3、S4、H5、S3、H6、S5、S7）聚為一類。

2. 5. 2主成分分析

主成分分析（PCA）是通過降維簡化數據結構，同時保留主要信息以區分不同樣本數據的一種分析方法。使用SIMCA 14.0軟件對15批淡竹葉的6個指標成分含量進行PCA分析，結果顯示前兩個主成分累積貢獻率達70.4%，成功將樣品劃分為3類，與聚類分析結果一致（見圖3）。

為進一步分析6 個化學成分對于PCA 模型的貢獻能力，分析載荷散點圖發現，牡荊苷對第1 主成分貢獻大（貢獻率55%），葒草苷對第2 主成分貢獻大（貢獻率63%），見圖4。

2.5.3正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

采用SIMCA 14.0軟件對15 批次中14個共有峰峰面積進行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）建模分析，以對比兩個產地淡竹葉樣品在化學成分上的差異，并通過變量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）篩選出差異性標志化合物。結果顯示，15批次淡竹葉被明顯分為3 類，與前述2 種分析方法結果基本一致（結果見圖5）。OPLS-DA模型的R2x 和Q2 值分別為0.694 和0.593，均超過0.5，R2x表示在用于分析的所有自變量數據中，有69.4% 的變異性可以通過建立的模型來進行解釋和說明，表明模型具有穩定性和可靠性，Q2 為0.593說明該模型能夠對約59.3% 的未知數據做出較為準確的預測。以VIP值gt;0.6作為篩選標準用于確定影響化學成分差異的主要標志性成分，VIP 值越高，說明該變量對模型的影響越大。如圖6 所示，滿足篩選條件的指紋圖譜色譜峰VIP 值從大到小依次為峰13（VIP=1.76）、峰3（VIP=1.72）、峰10（VIP=1.51）、峰5（VIP=1.09）、峰9（VIP=1.03）、峰1（VIP=0.95）、峰14（VIP=0.83）、峰7（VIP=0.75）、峰12（VIP=0.68）、峰6（VIP=0.66）。其中，峰9（葒草苷），峰10（日當藥黃素），峰12（牡荊苷），峰13（異牡荊苷），峰14（木犀草苷）分別通過對照品指認。對差異性成分的貢獻順序為異牡荊苷gt;日當藥黃素gt;葒草苷gt;木犀草苷gt;牡荊苷，這些化合物在淡竹葉樣品中呈現出顯著的差異，可作為指標定量的關鍵成分用于質量控制和鑒別分析。

3討論與結論

3.1色譜條件的優化

檢測波長的優化：本研究對6 種主要成分進行了全波長的掃描，結果顯示。6種主要成分在300nm～350nm 處吸收較好，響應較高。其中在330nm處，淡竹葉6種黃酮類成分吸收較大，且330nm 波長采集的供試品溶液，各色譜峰峰形尖銳，利于指紋圖譜共有峰的指認與校正。因此，本研究采用330nm波長以采集各批次淡竹葉的指紋圖譜數據及進行多成分的定量分析。

洗脫條件的優化：本研究所定量的6種黃酮類成分，異葒草苷與葒草苷，異牡荊苷與牡荊苷為同分異構體，極性較為接近，分離難度較大。在本次實驗中考察1%（體積分數）冰醋酸水溶液、0.1%（體積分數）甲酸水溶液、1%（體積分數）甲酸水溶液、0.1%（體積分數）冰醋酸水溶液作為流動相對色譜峰的影響，結果顯示，使用1%（體積分數）冰醋酸水溶液、0.1%（體積分數）甲酸水溶液、0.1%（體積分數）冰醋酸水溶液為流動相時葒草苷與日當藥黃素、異牡荊苷與牡荊苷均存在色譜峰的重疊，一定程度上影響定量結果的準確性。進一步優化色譜洗脫梯度并考察系統適應性后，最終選擇1%甲酸水（B）-乙腈（A）作為洗脫的流動相。

3.2色譜峰歸屬及對照品指認

由圖1可知，受限于對照品的原因，在淡竹葉樣品色譜圖中還有部分成分未經指認。通過查閱文獻，發現淡竹葉除黃酮類成分外，還有大量的酚酸類物質。一項淡竹葉生物活性成分定量的研究表明，4-O-香豆?？鼘幩峒?-O-香豆?？鼘幩嵩诘袢~中含量最高分別可達0.360 mg·g^-1，0.356 mg·g^-1［19］，同時木犀草素-6-C-β-D-半乳糖醛酸基（1→2）-β-D-葡萄糖苷的含量最高可達1.701 mg·g^-1。通過對比本實驗流動相和洗脫梯度（0～10min，8%～10.5%A；10 min～20 min，10.5%A；20 min～30min，10.5%～11.5%A；30min～35 min，11.5%～12.5%A）及洗脫梯度（0～20 min，8%～10.5%B；20min～30 min，10.5%B；30 min～40 min，10.5%～12.5%B，在流動相B 為乙腈），推測本實驗黃酮類成分之前洗脫的色譜峰，應含有這三種化學成分，具體成分的指認有待進一步的研究。

3.3指標性成分的選擇

本研究通過多成分含量測定及化學計量學分析發現，經對照品指認的5 種成分被篩選為本品質量差異性的關鍵成分（VIPgt;0.6）。本研究定量的6 種化學成分均為黃酮類成分，已有大量的文獻對本研究所定量的黃酮類成分進行了相關的生物活性報道。邵瑩［20］選擇淡竹葉中異葒草苷、葒草苷、日當藥黃素等7個標準黃酮物質以及2組黃酮化合物組分作為實驗對象，結果發現，淡竹葉黃酮單體及黃酮組合物能夠有效地提高心肌細胞的存活率，并抑制心肌細胞的凋亡過程。Moon 等［21］采用多重比色法和蛋白質配體對接模擬研究發現，日當藥黃素可提高馬鈴薯提取物的抗氧化性能和總黃酮含量。近年來的臨床前驗證研究表明，葒草苷對人結直腸腺癌細胞和致癌物誘導的白化結直腸癌Wistar大鼠模型具有明顯的抗癌作用［22］。

含量測定結果發現，異葒草苷在各批次間含量較高（均值為0.5574mg·g^-1），而木犀草苷在各批次間含量較低（均值為0.0380mg·g^-1）。雖然化學計量學分析結果未篩選出異葒草苷（VIP＝0.48）作為差異性標志化合物，但考慮到異葒草苷含量較高及其作為具有改善多種代謝并發癥潛力的一種膳食黃酮［23］。因此，最終去除木犀草苷并選擇異葒草苷、葒草苷、日當藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷作為指標性成分用于淡竹葉的質量控制與評價。

3.4化學計量學分析結果

本研究采用HPLC技術建立了15批次淡竹葉樣品的指紋圖譜，確定了14 個共有峰及指認了6個化學成分。聚類分析將兩個產地淡竹葉主要分為3 類，說明兩個產地的淡竹葉質量存在明顯的差別。含量測定結果表明，四川產地的淡竹葉異葒草苷含量較高（S1樣品為1.0918mg·g^-1，S9樣品為0.9670mg·g^-1）。OPLS-DA分析結果也將樣本S1、S9聚為較單獨一組（圖5），這種差異可能源于氣候、地理位置等多重因素。為了提升方法的精確度和實用性，后續應增加樣本的采集數量與產地范圍，從而更全面地驗證本研究所構建的方法。

4結論

本研究建立的淡竹葉HPLC特征指紋圖譜及異葒草苷、葒草苷、日當藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷的含量測定方法穩定且重現性好，可用于淡竹葉及含有淡竹葉的中成藥或功能保健食品的質量控制與評價。