基于生物信息學與實驗驗證的柴胡-白芍抗乳腺癌機制研究

摘要：通過生物信息學、網絡藥理學以及實驗驗證相結合的方法，預測并驗證柴胡-白芍藥對抗乳腺癌配伍機制。獲取癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中乳腺癌基因表達數據，篩選得到乳腺癌靶點；通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional" Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）數據庫、SEA（Similarity" Ensemble Approach）數據庫、Swiss Target Prediction 數據庫和Super" PRED數據庫收集柴胡、白芍潛在活性成分及靶點，對靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析；構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡與成分-靶點網絡，篩選得到乳腺癌關鍵靶點絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Polo-like kinase 1， PLK1）、細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1， CDK1）及柴胡-白芍抗乳腺癌關鍵成分柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D和芍藥苷；通過Autodock 軟件對關鍵成分及靶點進行分子對接驗證，并通過細胞實驗驗證關鍵成分的抗乳腺癌活性，其中通過Chou-Talalay 模型證明了柴胡皂苷D與芍藥苷之間存在協同增效作用；通過流式細胞術及蛋白質印跡（Westernblot）實驗證明了柴胡皂苷D和芍藥苷能夠通過阻滯細胞周期于G2/M期發揮抗乳腺癌作用。

關鍵詞：生物信息學；網絡藥理學；柴胡；白芍；乳腺癌

中圖分類號：R285.；5 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2395（2025）02-0278-11

0引言

乳腺癌是發生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，現有統計顯示我國乳腺癌發病率在女性惡性腫瘤中位于首位，中國的乳腺癌發病率每年以2%～3% 的速度增長，全國每年新增約21 萬乳腺癌患者［1］。乳腺癌屬中醫學“乳巖”“乳石癰”等范疇，名老中醫們認為乳腺癌是由于正氣不足，七情所傷，肝、脾、腎等臟腑功能失調，氣血不足、沖任失調等多種致病因素長期作用下導致的氣滯、痰濁、瘀血、邪毒等相互作用于乳房而形成的腫塊［2］。中醫藥對于乳腺癌的治療原則基于“瘀、毒、虛”這一基本病機，多采用疏肝健脾、化瘀解毒等法，常見的方劑有逍遙散（柴胡、當歸、白芍、茯苓、白術、甘草、生姜、薄荷）、柴胡疏肝散（柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、甘草）、四逆散（柴胡、白芍、枳實、甘草）等調肝理脾方劑［3-4］。劉杉杉通過對乳腺癌患者的中藥處方進行藥物組合規律統計，發現高頻藥物組合及藥對組合主要以逍遙散藥物加減組成為主，其中柴胡- 白芍為最常用的藥物組合之一，并且在臨床常用于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，注重疏肝解郁、調肝理脾的主要治法。柴胡升發陽氣、疏肝解郁，白芍柔肝且養血，與柴胡相輔相成，兩者聯用即可疏肝行氣，又可調肝郁血虛之證［4］。

網絡藥理學是一種利用系統生物學方法研究藥物作用機制的學科，其已在中藥抗乳腺癌的研究中得到越來越多的應用。近年來有大量研究通過網絡藥理學方法揭示了中藥抗乳腺癌的作用機制，如四物湯中的山柰酚、β -谷甾醇、沒食子酸等能通過調控細胞周期進程、血管生成等通路發揮治療乳腺癌的作用，表明了其具有多成分和多通路協同作用的特點［5］。通過網絡藥理學方法也發現了逍遙散能夠通過干預腫瘤免疫、炎癥反應等多類型細胞通路協同發揮抗三陰性乳腺癌的作用［6］。中藥復方中的藥物常包含多種活性成分，各自具有不同的藥理活性，作為逍遙散的主要組成部分，柴胡- 白芍藥對抗乳腺癌的作用有待進一步探究。

本研究基于基因表達數據，將生物信息學與網絡藥理學方法相結合，篩選柴胡- 白芍發揮抗乳腺癌作用的成分、靶點和通路，預測得到的潛在活性成分與靶蛋白進行分子對接，通過體外細胞實驗進行初步驗證，闡明柴胡- 白芍抗乳腺癌的作用機制，不僅能為以該藥為基礎的中藥復方抗乳腺癌研究提供科學依據，同時也為含該藥對的中藥復方臨床治療乳腺癌提供應用參考，有助于揭示傳統中藥的作用機制，促進中藥現代化發展。

1材料

1.1細胞株

小鼠乳腺癌細胞（4T1）購自中國科學院上海細胞庫。

1.2藥品與試劑

Roswell Park Memorial Institute Medium（RPMI）1640 培養基、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；胰蛋白酶、Radio Immunoprecipitation Assay（RIPA）強裂解液、噻唑藍（MTT）購自上海碧云天生物科技有限公司；柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D、芍藥苷購自成都埃法生物科技公司；細胞周期蛋白依賴性激酶 1（cyclin dependentkinase 1，CDK1）抗體、β - 肌動蛋白（β-actin）抗體、Horseradish Peroxidase（HRP）標記的二抗PLK1 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3儀器

CO₂細胞培養箱、酶標儀購自Thermo FisherScientific公司；流式細胞儀購自美國BD公司（Becton，Dickinson and Company）；低溫高速離心機購自Eppendorf 公司；垂直電泳儀、凝膠成像儀購自Bio-Rad 公司。

2方法

2.1乳腺癌靶點獲取

在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https：//portal. gdc. cancer.gov/）中獲取乳腺癌基因表達數據，將基因表達譜進行log2 轉換，差異表達基因（differential expressiongenes，DEGs）分析使用limma 軟件包，并以|log2 fold change|≥2 和Plt;0.05 為條件進行篩選，篩選后得到的差異基因作為乳腺癌靶點［7］。

2.2乳腺癌關鍵靶點篩選

String在線網站用于構建乳腺癌靶點的蛋白-蛋白互作（PPI）網絡，導出文件并使用Cytoscape3.9.1軟件中的分子復合體檢測（MolecularComplex Detection，MCODE）插件進行高密度子網的分析，所有條件為默認值：度閾值（Degree Cutoff）＝2，節點評分閾值（Node Score Cutoff）＝0.2，k- 核心（k-Core）＝2，最大深度（Max.Depth）＝100；將得分最高的子網作為乳腺癌關鍵靶點。

2.3柴胡、白芍潛在活性成分收集及靶點預測

在TCMSP數據庫（https：//old. tcmsp-e.com/tcmsp.php）中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeproperties，DL）≥0.18 為條件，篩選柴胡、白芍潛在活性成分，并獲取活性成分對應的靶點。此外，通過查詢文獻，補充數據庫中未收錄但具有抗癌活性的成分，獲取成分的簡化分子線性輸入規范（Simplified Molecular Input Line EntrySystem，SMILES）號，并導入到SEA 數據庫、Super PRED 數據庫和Swiss Target Prediction數據庫，進行靶點預測，將上述靶點合并、去重即為柴胡-白芍靶點［8］。

2.4拓撲網絡構建及通路富集分析

將乳腺癌靶點與柴胡- 白芍靶點取交集，即為柴胡-白芍抗乳腺癌靶點。在Cytoscape 軟件中構建成分- 靶點（C-T）網絡，用于分析成分與靶點之間的相互作用關系。在DAVID 網站（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中進行柴胡- 白芍抗乳腺癌靶點的KEGG 通路富集分析［9］。

2.5關鍵活性成分及靶點篩選

將乳腺癌關鍵靶點與柴胡- 白芍靶點取交集，即得柴胡-白芍抗乳腺癌關鍵成分及靶點。

2.6關鍵成分與靶點分子對接驗證

通過Autodock 軟件進行分子對接驗證，簡單來說，分別從Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi. nlm. nih. gov/）及RCSB PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）獲取小分子sdf 文件及蛋白pbd結構，使用Autodock Tools 進行蛋白和小分子的前處理，然后進行對接。分子對接得到的結合能越低表示結構越穩定，最后使用Pymol 軟件進行可視化處理。

2.7關鍵靶點生物信息學分析

在UCSC數據庫（（https：//xenabrowser.net/））中下載經統一標準化的泛癌數據集，并提取關鍵靶點在乳腺癌各個樣本中的表達數據，進行log2轉換，繪制靶點在腫瘤組織及正常組織中的基因表達量圖。提取TCGA 數據庫中乳腺癌的臨床信息，繪制關鍵靶點的臨床分期、生存時間與表達量的關系圖，以及免疫細胞浸潤的相關性等。

2.8細胞存活實驗及藥物協同作用驗證

將處于對數生長期的4T1細胞接種于96孔板中，每孔5000個細胞，同時設置對照組，待細胞貼壁后進行藥物處理，然后每孔加入10μL的MTT，孵育4h后加入DMSO置于酶標儀上測定吸光度，檢測細胞存活率。通過Chou-Tatalay 模型探究兩個單體成分之間的協同關系，藥物組合指數（CI）lt;1為協同作用。

2.9流式細胞術檢測細胞周期分布

將細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁后進行藥物處理，然后收集細胞使用體積分數75%乙醇4 ℃ 固定，使用PI 進行染色，置于BD AccuriC6流式細胞儀檢測，使用Modfit 軟件分析各周期的分布情況。

2.10Western blot法檢測蛋白表達

將細胞接種于6孔板中，進行給藥處理，收集細胞后使用RIPA裂解液在冰上裂解細胞，離心獲取上清液，蛋白變性后進行電泳、轉膜，使用快速封閉液進行封閉，對應的一抗4 ℃ 孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，置于化學發光成像儀上檢測蛋白表達情況。

2.11統計學分析

數據采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行處理，方法采用單因素方差分析（One-way" ANO?VA），Plt;0.05表示有差異。

3結果

3.1柴胡-白芍抗乳腺癌成分及靶點

對TCGA 基因表達數據進行差異基因分析，結果顯示共有1926個差異基因，其中上調550個，下調1 376 個（圖1（a））。通過檢索TCMSP數據庫篩選并進行文獻補充，整理得到柴胡有17個潛在活性成分，白芍有10 個活性成分（表1）。通過TCMSP 數據庫、SEA數據庫、Swiss targetprediction 數據庫及Super PRED 數據庫預測得到柴胡靶點341個、白芍靶點269 個，與乳腺癌靶點取交集得到柴胡-白芍潛在抗乳腺癌成分20個，其中柴胡13個，白芍7個，對應抗乳腺癌靶點76個，其中柴胡獨自調控28個，白芍獨自調控20個，兩者共同調控28 個（圖1（b），圖1（c））。

3. 2 KEGG通路富集分析

分別對柴胡及白芍抗乳腺癌靶點進行通路富集，根據pvalue 進行排序，分析可發現，柴胡和白芍所調節的20條通路中，兩藥共同調控的通路有11 條。其中柴胡調控的前5條通路分別為癌癥通路、鈣信號通路、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑抵抗、白細胞介素17（IL-17）信號通路、膀胱癌；白芍調控的前5條通路分別為癌癥通路、鈣信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、IL-17信號通路、神經活性配體-受體相互作用（圖2）。

3.3關鍵活性成分及靶點篩選

為了進一步探索柴胡-白芍抗乳腺癌的關鍵成分及靶點，首先對乳腺癌靶點進行關鍵靶點分析，通過Cytoscape軟件中的MCODE插件分析得到關聯最密切的PPI 網絡包含靶點99個（圖3（a）），再與柴胡、白芍靶點取交集得到柴胡抗乳腺癌靶點5個（BIRC5、CCNA2、CCNB1、PLK1、TOP2A），白芍抗乳腺癌靶點2個（AURKA、CDK1）（圖3（b）），對應的成分有芍藥內酯苷（AURKA）、芍藥苷（CDK1）、槲皮素（BIRC5、CCNB1、TOP2A）、異鼠李素（CCNA2）、柴胡皂苷A（PLK1）、柴胡皂苷B2（PLK1）、柴胡皂苷D（PLK1）。

3.4分子對接驗證結果

使用分子對接技術預測柴胡、白芍關鍵成分與靶點之間的結合活性，在3.3所篩選的關鍵成分中，槲皮素和異鼠李素存在于較多中藥，不具有相對的特異性，同時依據文獻報道成分所在中藥中的含量及其抗肝癌活性，最終選取柴胡中的柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D及白芍中的成分芍藥苷，與對應的靶點PLK1 和CDK1 進行對接，通過Pymol 軟件對關鍵成分及靶點對接情況進行可視化，結果如圖4 所示，各成分與靶點之間均能通過形成氫鍵的方式進行結合，且結合活性均較強，各單體與靶點之間的結合能分別為-3.37 kJ/mol、-5.32 kJ/mol、-4.66 kJ/mol、-5.37 kJ/mol。

3.5關鍵靶點的生物信息學分析

為了探究關鍵靶點在乳腺癌進展中的作用，通過生物信息學對關鍵靶點在腫瘤組織及正常組織中的表達、關鍵靶點與乳腺癌臨床分期、關鍵靶點在乳腺癌中的免疫浸潤等進行分析。結果顯示PLK1 和CDK1在乳腺癌組織和正常組織中的表達據有顯著性差異，見圖5（a）、圖5（d），并且這兩個基因的高表達與乳腺癌的生存時間縮短以及臨床分期有明顯相關性見圖5（b）、圖5（c）、圖5（e）、圖5（f），以及免疫浸潤分析結果顯示PLK1 和CDK1 與免疫細胞浸潤均顯著相關，見圖5（g）。

3. 6柴胡、白芍活性成分抗乳腺癌作用及藥物協同作用研究

如圖6（a）所示，不同濃度的柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D、芍藥苷作用24h后對乳腺癌細胞的增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性，各成分作用的半數抑制濃度（IC₅₀）分別為柴胡皂苷A 8.01μmol/L，柴胡皂苷B2 75.84μmol/L，柴胡皂苷D 4.89μmol/L，芍藥苷104.40 μmol/L。

為了進一步探究柴胡- 白芍藥對成分配伍的抗乳腺癌協同作用，根據各單體藥物對細胞存活率的影響，分別在柴胡和白芍中選取毒性最強的單體，利用Chou-Talalay 數學模型來評價篩選得到的關鍵成分——柴胡皂苷D 和芍藥苷之間是否存在一種協同作用。結果顯示，相較于單獨使用柴胡皂苷D 或芍藥苷，兩者聯合使用顯示出了更強的抑制作用。為了探究兩藥組合是否具有協同作用，使用CompuSyn 軟件進行協同作用的計算，將所得抑制率輸入到軟件中，結果表明除了6 μmol/L 的組合之外，其余組合均表現出協同作用（CIlt;1），且最佳協同計量為10 μmol/L 的組合。

3.7柴胡皂苷D與芍藥苷對細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，各濃度的柴胡皂苷D和芍藥苷均能將細胞周期阻滯于G2/M 期，且呈劑量依賴性。相對于單用藥來看，柴胡皂苷D與芍藥苷聯合使用（10 μmol/L+10 μmol/L）表現出明顯的增效作用（Plt;0. 01）。

3. 8Western blotting 法檢測蛋白表達

蛋白表達結果顯示，柴胡皂苷D（10 μmol/L）、芍藥苷（10 μmol/L）均能降低細胞周期調控蛋白CDK1 及激酶PLK1 的表達，且兩藥聯合使用（10 μmol/L、10 μmol/L）作用更顯著。

4討論

中醫多認為乳腺癌早期常為肝氣郁結，其后則出現氣滯血瘀的癥狀，因此通常將溫陽扶正、疏肝解郁、補益沖任作為治療原則［10］。逍遙散組方嚴謹，首載于宋代《太平惠民和劑局方》卷九：“治婦人諸疾”，是常用的疏肝解郁類方劑，目前臨床上廣泛應用于乳腺癌及乳腺癌患者相關性疲乏、乳腺癌相關抑郁發展等疾病的治療［11-14］。柴胡- 白芍為逍遙散中的君藥、臣藥，柴胡苦、辛，歸肝、膽經，具有疏肝解郁，升舉陽氣的功效；白芍柔肝止痛，歸肝、脾經［15］。作為逍遙散中的核心藥對，柴胡- 白芍抗乳腺癌的潛在作用機制有待進一步研究。

本研究旨在通過結合多種藥理研究中常用的方法如生物信息學、網絡藥理學和分子對接等預測柴胡- 白芍抗乳腺癌的作用成分和機制，同時探究其配伍協同機制。結果顯示，柴胡- 白芍抗乳腺癌成分共20 個，其中柴胡13個，白芍7 個，對應76 個抗乳腺癌靶點，其中柴胡獨立調控28 個，白芍獨立調控20個，共同調節28個。通過KEGG通路富集分析預測得到柴胡和白芍共調節29 條抗乳腺癌通路，共同調控11條，以上結果從成分到通路都說明柴胡和白芍之前的協同配伍組作用。

為了進一步明確其發揮抗乳腺癌作用的關鍵成分及靶點，首先對乳腺癌靶點進行關鍵子網的篩選，進一步得到柴胡- 白芍中主要是柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D 以及芍藥苷發揮關鍵抗乳腺癌作用，其作用靶點為CDK1 和PLK1。PLK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠通過調節細胞有絲分裂、G2/M 的DNA 損傷應答等，已被證實在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中高表達［16-17］。同樣，CDK1作為調控G2/M 期的關鍵蛋白，也在腫瘤增殖進程的調控中起著關鍵作用，CDK1過表達使腫瘤細胞過度增殖［18］。分子對接結果顯示芍藥苷、柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D 與CDK1 和PLK1 均有較高的結合活性，研究發現柴胡皂苷D 能夠降低MDA-MB-231細胞周期調控因子cyclin B1的表達，將細胞周期阻滯于G2/M 期，從而抑制腫瘤細胞的增殖［19-20］。通過細胞實驗驗證了該藥對中4個關鍵成分柴胡皂苷A、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D和芍藥苷，均能顯示出抗乳腺癌細胞生長的作用；選取柴胡中效果最佳的柴胡皂苷D 與芍藥苷進行協同作用評價，發現兩藥之間確存在協同作用，最佳濃度協同劑量為10 μmol/L。流式細胞術結果與western blot 結果也顯示，兩成分使用能夠誘導乳腺癌細胞周期阻滯于G2/M 期，且能夠協同抑制周期蛋白CDK1 及PLK1 的表達。

本研究基于TCGA 數據庫乳腺癌基因表達數據，結合網絡藥理學分析方法及體外細胞實驗驗證了柴胡、白芍能夠通過多成分間的協同作用以及誘導細胞周期停滯發揮抗乳腺癌的作用，并存在協同增效作用。本研究可為柴胡-白芍抗乳腺癌應用提供一定參考，在中藥研究領域具有重要意義，有助于推動中藥在癌癥治療中的發展，為中藥的臨床應用提供更深入的理論支持，但有關結果有待進一步的體內試驗加以驗證。