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廣州酸菜中乳酸菌的分離鑒定及發酵特性分析

2025-03-29 00:00:00生書晶余婷婷孫婷琪陳海峰甘苑瑩鮑珺馮麗娜
中國調味品 2025年3期

摘要:從廣州市售酸菜中分離出優勢乳酸菌,對其進行鑒定和發酵特性研究。利用MRS-CaCO3固體培養基分離純化菌株,通過16S rDNA序列分析進行菌種鑒定,并對分離菌株的生長特性、耐酸能力、亞硝酸鹽的降解率和發酵特性進行分析。結果表明,從廣州酸菜中篩選獲得4株乳酸菌,經16S rDNA序列分析,分別為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GL-01、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)GL-02、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)GL-03和布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)GL-04。其中,GL-01、GL-03、GL-04 3 株菌長勢大致相同,其生長速率、產酸速率、最大菌體量均優于GL-02,但發酵后期4株菌的發酵液pH大致相同。所有菌株的最適生長溫度均在30~37 ℃之間,在pH為5、鹽含量低于8%時生長良好,對亞硝酸鹽均具有較高的降解率,GL-01和GL-03的降解能力優于GL-02和GL-04。將4株菌分別接種于酸菜中,與自然發酵相比,GL-01、GL-03和GL-04在不影響酸菜發酵風味的同時,可以顯著縮短發酵周期,使發酵周期從自然發酵的15 d縮短為9 d,GL-02組由于長勢較慢,感官評分顯著低于自然發酵組。該研究結果可為廣州地區酸菜的品質改良和優質發酵菌劑的開發提供參考依據和技術支持。

關鍵詞:廣州酸菜;乳酸菌;分離;鑒定;發酵特性

中圖分類號:TS255.53文獻標志碼:A文章編號:1000-9973(2025)03-0192-06

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Guangzhou

Sauerkraut and Analysis of Fermentation Characteristics

SHENG Shu-jing, YU Ting-ting, SUN Ting-qi, CHEN Hai-feng,

GAN Yuan-ying, BAO Jun, FENG Li-na*

(School of Biology and Food Engineering, Guangdong University of

Education, Guangzhou 510310, China)

Abstract: The dominant lactic acid bacteria are isolated from the commercially available sauerkraut in Guangzhou, they are identified, and the fermentation characteristics are studied. MRS-CaCO3 solid medium is used to isolate and purify the strains, 16S rDNA sequencing analysis is used to identify them, and the growth characteristics, acid tolerance, nitrite degradation rate and fermentation characteristics of the isolated strains are analyzed. The results show that four strains of lactic acid bacteria are screened from Guangzhou sauerkraut. Through 16S rDNA sequencing analysis, they are identified as Lactobacillus plantarum GL-01, Lactobacillus brevis GL-02, Lactobacillus fermentum GL-03 and Lactobacillus buchneri GL-04. Among them, GL-01, GL-03 and Gl-04 show similar growth trend, and their growth rate, acid production rate and maximum bacterial biomass are all higher than those of GL-02, but the fermentation liquid pH of the four strains is similar in the late fermentation stage. The optimal growth temperature of the four strains is 30~37 ℃, and they grow well at pH 5 and salt content below 8%. They have a high nitrite degradation rate, and GL-01 and GL-03 have better degradation ability than GL-02" and GL-04. The four strains are inoculated into sauerkraut respectively. Compared with natural fermentation, GL-01, GL-03 and GL-04 can significantly shorten the fermentation period, reducing the"" fermentation period from 15 d of natural fermentation to 9 d without affecting the fermentation flavor of sauerkraut. The GL-02 group has significantly lower sensory score than natural fermentation group due to slower growth trend. The research results could provide references and technical support for the quality improvement of sauerkraut in Guangzhou and the development of high-quality fermentation agents.

Key words: Guangzhou sauerkraut; lactic acid bacteria; isolation; identification; fermentation characteristics

收稿日期:2024-10-13

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31600236);廣東省教育廳重點領域專項(2022ZDZX4037)

作者簡介:生書晶(1981—),女,副教授,博士,研究方向:食品科學。

*通信作者:馮麗娜(1981—),女,講師,博士,研究方向:食品科學。

酸菜是以蔬菜表面附著的乳酸菌及酵母菌、霉菌等微生物群落發酵而成的蔬菜發酵制品,在我國各地區廣受歡迎。由于環境、氣候等因素的影響,不同產地、不同品種的蔬菜都有特定優勢和恒定的微生物群落,不同的微生物群落會影響酸菜的發酵過程[1-3]。目前酸菜研究主要以東北酸菜[4-8]、四川泡菜[9-12]為主,對酸菜的微生物菌落分布、菌種選育、加工工藝等的研究較深入。但是,隨著飲食文化的日益豐富,以“酸菜魚”、“酸菜牛肉面”等為代表的流行美食在南方地區也日益流行,廣東各地農貿市場、超市中酸菜售賣隨處可見,但目前未見對于廣東酸菜中微生物的研究報道。

廣東酸菜多采用自然發酵生產,發酵成本較低,操作簡單,風味純正,但發酵周期長,在發酵過程中易受到其他雜菌的污染,增加了生產的風險。已有研究通過分離培養優勢乳酸菌,得到工業發酵劑,從而提高了生產效率。李欣等[13]從自然發酵的酸菜中分離出14株乳酸菌,通過DNA測序、同源性分析等對分離出的乳酸菌進行初步鑒定,篩選得到耐酸能力較強的乳酸菌。黃慧福等[14]從云南富源酸菜中分離純化出4株乳酸菌,將其應用于富源酸菜,發酵效果好,能明顯縮短富源酸菜的發酵周期。袁先鈴等[15]從自然發酵的四川酸菜中分離得到植物乳桿菌和類干酪乳桿菌,人工接種后品質較自然發酵酸菜好。孫慶申等[16]從東北酸菜中篩選出1株能產生抑菌物質的植物乳桿菌,在果蔬類產品的防腐保藏中具有潛在的應用價值。

本文以廣州市售自然發酵的酸菜為原料,從中分離篩選乳酸菌,并對其生長性能和發酵性能進行試驗,以期獲得適合于廣東酸菜標準化生產的菌種,為實現廣東酸菜高品質規模化生產提供了菌種資源和研究基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

酸菜:從3個市場分別購買自然發酵酸菜,用無菌采樣袋收集備用。

MRS液體培養基:廣州環凱科技有限公司;MRS固體培養基:在液體培養基中加入2%瓊脂粉,初篩時加入1% CaCO3觀察溶鈣圈;細菌DNA純化試劑盒、PCR試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司;無菌針式過濾器:美國Millipore公司;其他化學試劑(均為國產分析純):廣州環凱科技有限公司。

1.1.2儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器上海東亞壓力容器制造有限公司;SPX生化培養箱廣州市康恒儀器有限公司;ST3100 pH計奧豪斯儀器(常州)有限公司;瓊脂糖水平電泳槽北京六一生物科技有限公司;UV9100紫外可見分光光度計北京萊伯泰科儀器股份有限公司;TGL-16C高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;BX53光學顯微鏡日本奧林巴斯株式會社。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與純化

吸取酸菜汁0.1 mL,用無菌水梯度稀釋,取10-4,10-5,10-6,10-7濃度各0.1 mL,涂布于MRS固體培養基(含1% CaCO3)上,30 ℃倒置培養60 h。挑取有明顯溶鈣圈的單菌落,多次劃線并純化,觀察菌落特征并進行革蘭氏染色。挑取單菌落分別于4 ℃斜面短期保存和-80 ℃甘油長期保存備用。

1.2.216S rDNA鑒定

提取菌株基因組DNA,使用通用引物27F和1492R[16]進行PCR 擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,同時進行16S rDNA測序分析,將測序結果與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已知序列進行BLAST同源性比對分析。

1.2.3菌株的生物學特性分析

1.2.3.1生長曲線及產酸量測定

挑取單菌落接種至MRS液體培養基中,30 ℃活化至OD600值為1,以2%接種量接入100 mL液體培養基中,30 ℃恒溫培養60 h,間隔4 h取樣,測定發酵液的OD600值和pH。

1.2.3.2耐酸能力測定

將MRS液體培養基pH分別調至3,4,5,6,7,將活化的OD600值為1的種子液以2%的接種量接種,于30 ℃培養24 h,測定發酵液的OD600值。

1.2.3.3耐鹽能力測定

向MRS液體培養基中添加NaCl,分別配制成0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的鹽濃度,將活化的OD600值為1的種子液以2%的接種量接種,于30 ℃培養24 h,測定發酵液的OD600值。

1.2.3.4亞硝酸鹽降解能力測定

參考胡此海等[17]的方法,將活化的OD600值為1的種子液以2%的接種量接種于MRS液體培養基(添加200 mg/L NaNO2)中,于30 ℃培養48 h,測定發酵液中NaNO2的含量。

1.2.4酸菜的發酵試驗

將篩選的4株菌接種于酸菜發酵液中,并與自然發酵酸菜進行比較。自然發酵酸菜的制作工藝:芥菜清洗→風干→稱量→入缸→注入5%鹽水→密封→發酵→成品。

接種發酵酸菜組在自然發酵的基礎上,注入5%鹽水的同時,分別接入不同菌株。4個菌株在液體MRS培養基中培養24 h后,以4 000 r/min離心5 min,去上清液后用5%鹽水重懸,以酸菜質量的0.1%接種,室溫下發酵15 d,分別在0,3,6,9,12,15 d采樣,測定發酵液的pH和總酸含量。總酸含量的測定參照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》,采用酸堿指示劑滴定法進行測定。

參考黃慧福等[14]、劉錫銘等[18]的感官評價標準(見表1),請10位專業人員對比接種組發酵9 d的酸菜樣品與自然發酵15 d的酸菜樣品,對發酵酸菜的顏色、風味、酸度口感、脆性、湯汁進行感官評價。

1.2.5統計分析

試驗重復測定3次,結果以平均值±標準差表示。采用Excel 2019繪制圖表,采用SPSS 19.0進行數據分析。

2結果與分析

2.1乳酸菌的分離純化

通過含有1% CaCO3的MRS固體培養基初篩,挑取有鈣溶圈的菌株,通過形態學分類、革蘭氏染色,選取革蘭氏染色陽性、菌落形態差異較大的4株菌進行分析,結果見表2。

2.2菌株的16S rDNA 鑒定結果

對上述4株菌進行16S rDNA基因擴增,電泳擴增條帶與預期一致,經測序后輸入NCBI進行序列比對。結果表明分離菌株的序列分屬于4種菌,與NCBI中已收錄的乳酸菌的16S rDNA同源性都達到98%~99%(見表3),其中GL-01為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),GL-02為短乳桿菌(Lactobacillus brevis),GL-03為發酵乳桿菌 (Lactobacillus fermentum),GL-04為布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)。

2.3乳酸菌生長能力與產酸能力

生長速度會在一定程度上影響發酵周期,試驗測得4株乳酸菌的生長曲線見圖1。

由圖1可知,GL-01、GL-03、GL-04 3株菌長勢大致相同,0~12 h為對數生長期,在12 h后逐漸進入穩定期,菌株最高OD600值均在1.8左右。GL-02生長趨勢較緩,對數生長期為0~24 h,24 h后進入穩定期,最高OD600值接近1.3。可見,GL-01、GL-03、GL-04 3株菌的生長速度和最大OD600值均優于GL-02。

由圖2可知,隨著培養時間的延長,4株菌持續產酸,發酵液pH持續下降。結合圖1來看,GL-01、GL-03、GL-04 3株菌生長趨勢相似,產酸趨勢也大致相同。在0~12 h的對數生長期,微生物生長量不斷增加,pH持續下降。24 h后,菌體生長進入穩定期,pH趨于平緩,發酵后期pH降至3.7左右。菌株GL-02為短乳桿菌,由于其生長速率比其他3株菌慢,產酸速率也較慢,但在生長后期(48~60 h),pH降至和其他菌類似,說明其最終產酸量與其他3株菌接近。胡此海等[17]從四川傳統蘿卜泡菜母水中分離出5株菌,其中布氏乳桿菌和短乳桿菌在生長速率和產酸量方面低于其他乳酸片球菌和植物乳植桿菌,這與本研究中短乳桿菌的生長性能類似,但是本研究中布氏乳桿菌同樣表現出較好的生長性能,這可能是由于同一種內細菌不同菌株個體的生長性能存在差異。

2.4乳酸菌的生物學特性

2.4.1菌株的最適生長溫度和pH分析

對分離菌株的最適生長溫度和pH進行測定,結果見圖3和圖4。

由圖3可知,在培養溫度20~40 ℃范圍內培養24 h,比較OD600值后發現,所有菌株的最適生長溫度均在30~37 ℃之間。其中,GL-01和GL-03的最適生長溫度為30 ℃,而GL-02和GL-04的最適生長溫度為37 ℃,在40 ℃時所有菌株的生物量都顯著下降,說明40 ℃時抑制了菌體的增殖。其中,GL-03對溫度最敏感,40 ℃培養24 h后生物量僅為最高生物量的50%左右。廣東夏季天氣濕熱,篩選對溫度不敏感的生產菌株更有利于常溫發酵的正常進行,從這一角度考慮,GL-01、GL-02和GL-04優于GL-03。

由圖4可知,所有菌株在pH 5的培養液中培養24 h后生物量最大。在pH 6時生物量稍有降低,說明菌體還可以低速生長。在pH 4、pH 7、pH 8時,菌體生長速率較慢,培養24 h后生物量顯著降低,說明4株菌都有一定的耐酸能力,但最適生長pH為5。

2.4.2菌株對不同鹽含量的適應性

鹽含量可以提高發酵液的滲透壓,抑制腐敗菌的生長,因此,發酵菌株對鹽含量的耐受性非常重要[19-20]。由圖5可知,隨著鹽含量的不斷升高,各菌株培養24 h后生物量也隨之降低。在鹽含量低于8%時,GL-01和GL-02菌體生物量變化較小,隨著鹽含量升高GL-03和GL-04生物量顯著降低。在10%鹽含量時,GL-01、GL-02和GL-04增殖受到極大限制,GL-03增殖雖受到限制,但仍能低速生長。所有菌株在12%和14%鹽含量下,生長幾乎完全被抑制。酸菜發酵過程中鹽含量一般低于10%[21],有研究發現,鹽度過高(gt;5%)不利于酸菜的發酵和感官品質[22]。本研究分離的4 株菌在鹽含量低于8%時生長良好,可見4株菌均具有良好的耐鹽性能。

2.4.3菌株降解亞硝酸鹽的能力

酸菜發酵過程尤其是初始階段,部分微生物會將蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,隨著發酵的進行,乳酸菌大量增殖,會分解亞硝酸鹽[23-24]。GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中規定,蔬菜及其制品(腌漬蔬菜)中亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg,因此,發酵菌種對亞硝酸鹽的降解能力非常重要。本研究分離的4株菌對NaNO2均有較高的降解能力,降解率在91%~97%之間(見表4),可用于酸菜的發酵生產。4株菌對NaNO2的降解率具有顯著性差異(Plt;0.05),其中GL-01和GL-03的降解能力顯著高于GL-02和GL-04。

2.5發酵菌株的應用

以自然發酵的酸菜為對照,在自然發酵的基礎上添加4種乳酸菌后發酵液pH和總酸含量的變化見圖6和圖7。

由圖6和圖7可知,發酵開始后,添加4種乳酸菌的發酵液pH均低于自然發酵對照組(Plt;0.05)。在發酵前6 d,接種乳酸菌組的產酸量均顯著高于自然發酵組,盡管發酵末期(15 d),各組的總酸含量并沒有顯著性差異。自然發酵組在第15天接近發酵終點;GL-01、GL-03、GL-04接種組在發酵6 d后pH趨于穩定,發酵接近終點;GL-02接種組發酵第9天接近發酵終點,可見4株乳酸菌的添加均可以顯著縮短發酵周期。GL-02接種組的pH高于其他3個接種組,這可能與其生長速率較慢有關。盡管如此,GL-02接種組在發酵過程中pH降低,仍低于自然發酵組,但其總酸含量在發酵9 d后與自然發酵組沒有顯著性差異,說明在總酸含量相當的情況下,GL-02組強解離酸較多,自然發酵組弱解離的有機酸較多。

根據上述pH和總酸含量的測定結果,接種乳酸菌各組的發酵終點在第6~9天,自然發酵組的發酵終點在第15天。對自然發酵15 d和接種發酵9 d的酸菜進行感官評價,各組在顏色、風味、酸度口感、脆性、湯汁方面的綜合評分見表5和圖8。

由表5和圖8可知,GL-03組與自然發酵組的感官評價總分沒有顯著性差異,GL-01組和GL-04組的感官評價總分略低于自然發酵組,GL-02組由于長勢較慢,最終感官評分最低,具體表現為發酵風味略淡,酸度口感較差,湯汁顏色較暗。

綜合上述發酵過程中pH和總酸含量的動態變化和感官評價數據,可見在廣州酸菜中分離的4株乳酸菌中,GL-01、GL-03和GL-04在不影響酸菜發酵風味的同時,可以顯著縮短發酵周期,使發酵周期從自然發酵的15 d縮短為9 d,在酸菜發酵實踐中具有應用潛力。GL-02為短乳桿菌,長勢較慢,接種9 d時,其產酸總量顯著低于其他3株菌,與自然發酵15 d對比,酸度口感較差,發酵風味略淡,最終感官評分較低。結合發酵過程中pH和總酸含量的檢測,發酵9 d時GL-02組的pH低于自然發酵組,但GL-02組的總酸含量與自然發酵組沒有顯著性差異,可以推測GL-02組產生強解離酸較多,而自然發酵組產生更多的弱解離酸。另外,由于GL-02組發酵9 d的總酸含量低于自然發酵組發酵15 d的總酸含量,有機酸的不同會影響酸菜的風味形成,這可能也是GL-02組發酵風味較淡的原因。本試驗是在自然發酵的基礎上進行接種發酵,后續單菌種對發酵周期和風味物質的影響還有待進一步研究。

3結論

從廣州酸菜中篩選出4株菌,GL-01、GL-03、GL-04 3株菌長勢大致相同,其生長速度、產酸速率、最大菌體量均優于GL-02,但發酵后期4株菌的發酵pH大致相同。GL-01和GL-03在30 ℃時生長速率最快,而GL-02和GL-04的最適生長溫度為37 ℃,所有菌株在pH為5、鹽含量低于8%時生長良好,對亞硝酸鹽具有較高的降解率。將分離菌株接種的酸菜進行發酵,與自然發酵相比,GL-01、GL-03和GL-04在不影響酸菜發酵風味的同時,可以顯著縮短發酵周期,在廣州地區酸菜發酵實踐中具有應用潛力。

酸菜是以乳酸菌發酵為主,酵母菌、霉菌等多種微生物共同發酵的混菌發酵體系,如果發酵過程中與發酵無關的雜菌大量增殖,可能導致發酵失敗[16,25]。為了更好地控制發酵過程和提高發酵效率,在酸菜發酵過程中額外添加發酵劑已成為一種研究趨勢[26-28]。使用蔬菜本源微生物進行發酵更值得推薦,因為本源菌來源于蔬菜自身,可以在發酵體系內快速定殖,在改善發酵特性、提高發酵效率方面更有優勢[26-27]。田輝等[29]將短乳桿菌與植物乳桿菌組合進行發酵,獲得了綜合性能較好的酸菜,所以下一步可以研究不同菌株之間的組合復配,有利于工業化直投式發酵劑的研發和應用。

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