胚蛋給養核黃素對雞骨骼肌發育的影響

摘 要： 旨在研究核黃素（又稱維生素B2，VB2）對雞胚胎骨骼肌發育的影響，以促進其在胚胎給養中的應用。本研究利用CCK-8、EdU和免疫熒光等檢測方法，鑒定添加不同濃度的VB2（1.562 5、3.125、6.25、12.5和25 μmol·L^-1）對雞原代成肌細胞增殖和分化的影響，并通過在7胚齡雞胚卵黃囊部位注射不同濃度的VB2溶液（50、100 和200 μg），并設置0.9%的生理鹽水為對照組，檢測VB2對雞胚胎骨骼肌發育的影響，試驗共分為4組，每組25個胚蛋。研究結果表明，在細胞水平添加不同濃度的VB2都不同程度的促進了雞原代成肌細胞的增殖活力，但是6.25 μmol·L^-1 VB2為最佳添加濃度。此外，添加6.25 μmol·L^-1 VB2可顯著促進增殖標志基因CCND1（Plt;0.01）、PCNA（Plt;0.05）和CDK1（Plt;0.01）的表達，而對分化標志基因MYOD、MYOG和MYHC的表達無顯著影響（Pgt;0.05）；同時，EdU試驗也證實了在細胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2可以顯著促進成肌細胞的增殖（Plt;0.05）。此外，雞胚卵黃囊部位注射VB2溶液試驗表明注射50 μg VB2后顯著提高18胚齡雞胚胸肌組織中增殖標志基因CDK1（Plt;0.01）、PCNA（Plt;0.001）及分化標志基因MYOD（Plt;0.05）、MYOG（Plt;0.05）的表達水平；同時，50 μg VB2的添加也顯著增加了18胚齡雞胚胸肌肌纖維直徑（Plt;0.05）和胸肌重（Plt;0.05）。上述結果表明，VB2可促進雞原代成肌細胞的增殖作用和雞胚的胸肌發育。因此，本研究結論表明VB2是影響雞胚胸肌發育的一個重要的營養素，該研究為我國優質肉雞早期胚胎營養調控提供重要的理論依據和應用價值。

關鍵詞： 核黃素；骨骼肌發育；雞；胚胎給養

中圖分類號：

S831.5"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1159-11

收稿日期：2024-10-03

基金項目：雞生長性狀精準評價與高產優質核心種質創制 （SN01-2022-05）；重要農業動植物優異性狀共性調控元件挖掘與基因資源設計 （2023YFF1001100）；中國博士后科學基金面上項目 （GZC20233467）

作者簡介：李遠方（1991-），女，河南平頂山人，博士，主要從事畜禽資源分子評價的研究，E-mail： yuanfangli1991@163.com

*通信作者：劉翹銘，主要從事生物信息學研究，E-mail： cslqm@hit.edu.cn；李國喜，主要從事家禽遺傳育種的研究，E-mail： liguoxi0914@126.com；王丹丹，主要從事功能基因挖掘與利用的研究，E-mail： wangdd1993@126.com

The Effect of Riboflavin Supplementation in Embryonic Eggs on the Development of Skeletal Muscle of Chickens

LI" Yuanfang "ZHANG" Hongyuan^3，4， LI" Hongtai^3，4， LI" Zhi "WEI" Qianran "WANG" Yadong

LI" Guoxi^3，4*， WANG" Dandan^5*， LIU" Qiaoming^1，2*

（1.School of Medicine and Health， Harbin Institute of Technology， Harbin 150001，" China;

2.Zhengzhou Research Institute， Harbin Institute of Technology， Zhengzhou 450000，" China;

3.The Shennong Laboratory， Zhengzhou 450002，" China; 4.College of Animal Science and

Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China; 5.Institute of

Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：" This study aimed to investigate the effect of riboflavin （also known as vitamin B2， VB2） on the development of skeletal muscle in chicken embryos to promote its application in embryo feeding. The CCK-8， EdU， and immunofluorescence detection methods were used to identify the effects of adding different concentrations of VB2 （1.562 5， 3.125， 6.25， 12.5 and 25 μmol·L^-1） on the proliferation and differentiation of chicken primary myoblasts. Different concentrations of VB2 solution （50， 100 and 200 μg） were injected into the yolk sac of 7 embryonic age chicken embryos， and a 0.9% saline control group was set up to detect the effect of VB2 on the development of skeletal muscle in chicken embryos. The experiment was divided into 4 groups， with 25 embryo eggs in each group. The results showed that adding different concentrations of VB2 at the cellular level promoted the proliferation activity of chicken primary myoblasts to varying degrees， but 6.25 μmol·L^-1 VB2 was the optimal addition concentration. In addition， adding 6.25 μmol·L^-1 VB2 significantly promoted the expression of proliferation marker genes CCND1 （Plt;0.01）， PCNA （Plt;0.05）， and CDK1 （Plt;0.01）， but had no significant effect on the expression of differentiation marker genes MYOD， MYOG， and MYHC （Pgt;0.05）; at the same time， EdU experiments also confirmed that adding 6.25 μmol·L^-1 VB2 at the cellular level could significantly promote the proliferation of myoblasts （Plt;0.05）. In addition， the experiment of injecting VB2 solution into the yolk sac of chicken embryos showed that the injection of 50 μg VB2 significantly increased the expression levels of proliferation marker genes CDK1 （Plt;0.01）， PCNA （Plt;0.001） and differentiation marker genes MYOD （Plt;0.05）， MYOG （Plt;0.05） in the breast muscle tissue of 18 embryonic age chicken embryos; at the same time， the addition of 50 μg VB2 also significantly increased the fiber diameter （Plt;0.05） and breast muscle weight （Plt;0.05） of the breast muscle of 18 embryonic age chicken embryos. The above results show that VB2 can promote the proliferation of chicken primary myoblasts and the development of the breast muscle of chicken embryos. Therefore， the VB2 is an important nutrient that affects the development of the breast muscle of chicken embryos. This study provides an important theoretical basis and application value for the early embryonic nutritional regulation of high-quality broilers in China.

Keywords： riboflavin; skeletal muscle development; chicken; embryonic nutrition

*Corresponding authors：" LIU Qiaoming， E-mail： cslqm@hit.edu.cn; LI Guoxi， E-mail： liguoxi0914@126.com; WANG Dandan， E-mail： wangdd1993@126.com

維生素是動物體必需的營養物質，可以影響動物的代謝、免疫和生長發育，是機體生長發育必不可缺的^［1-2］。核黃素又稱維生素B2 （VB2），是動物體不可缺少的維生素之一^［3-4］。核黃素可以參與生物氧化還原反應^［5］以及能量代謝^［6］等過程，核黃素的缺乏可導致機體多種代謝障礙，其中最主要的就是生長障礙^［7］。在人體上，有關于核黃素缺乏導致的肌肉萎縮研究，例如，Nimmo等^［8］研究發現SLC52A2和SLC52A3中的雙等位基因致病變異可能導致核黃素轉運蛋白缺乏，從而引起核黃素缺乏進而導致肌肉無力、肌萎縮等，口服核黃素后可阻止疾病進展并可能逆轉該癥狀。He等^［9］利用D-半乳糖誘導構建的肌肉衰老大鼠模型鑒定到了核黃素生物合成和能量代謝等關鍵途徑的改變導致了骨骼肌的衰老。此外，通過細胞試驗發現添加關鍵代謝物核黃素可促進成肌細胞的增殖。在雞上，目前只有日糧添加VB2對生長發育影響的報道，例如，Leiber等^［10］研究發現，在有機日糧中添加4.0 mg·kg^-1 的VB2不會引起種雞或肉雞的任何健康或生產性能問題，而每公斤飼料添加 2.5 mg 則會導致雞體重減少。根據生產性能和生化數據，快速生長肉雞的日糧VB2需要量應設定為5 mg·kg^-1［11］。此外也有大量關于雞核黃素結合蛋白的研究^［12］，在無法合成核黃素結合蛋白 （RfBP） 的母雞中，會產生缺乏核黃素的胚蛋，這些胚蛋中的胚胎在孵化后約第13天左右時死亡，伴有嚴重的低血糖和脂肪酸氧化受損^［13］。目前，維生素添加試驗在雞活體水平已經有大量的研究，表明VB2對雞生長發育至關重要^［14］，但是目前缺乏關于VB2對機體分子水平影響的機制研究。

胚蛋給養是將外源營養素或者外源活性物質注射到孵化時期的家禽胚蛋中，從而達到促進家禽胚胎期和孵化出殼后的健康生長^［15］。在1982年，首次報道采用胚蛋注射技術將各種氨基酸混合物注射到8胚齡的胚胎卵黃囊中，結果發現注射組可以顯著提高雞胚胎后期的發育，并促進第56天雞的體重^［16］，該研究首次通過胚蛋注射為家禽胚胎提供營養物質，為胚胎給養營養物質研究奠定了基礎。目前，國內外營養學家先后進行了大量的胚蛋給養研究，研究證實胚蛋給養維生素和氨基酸等營養物質對促進雛雞機體免疫和肌肉生長發育等方面具有顯著的效果。Zhu等^［17］分別在種蛋胚胎第11胚齡時注射生理鹽水和維生素C，在第19胚齡時通過轉錄組對差異表達基因的功能富集表明，胚胎給養維生素C通過影響嘌呤核苷酸代謝通路和促進細胞凋亡來調節脾臟的發育和成熟。Sawosz等^［18］將肉雞種蛋隨機分為注射ATP組和未注射對照組，在孵化第20天時發現ATP注射組雞胚可促進成纖維細胞生長因子 2 （FGF2）和血管內皮生長因子 （VEGF） 以及 Na^（+）/K^（+） 轉運 ATP 酶 （ATP1A1） 的表達，這表明更多的能量來源可以增強肌肉細胞增殖的分子機制。

早期胚胎給養在投入較少成本的情況下可能獲得較大的收益，開展營養素胚胎給養的研究具有重要的經濟價值^［19］。目前國內外營養學家已經逐步開展關于胚胎給養營養素對雞胚生長發育的研究，VB2對于雞機體生長發育十分重要^［20-21］，然而對于其在胚胎給養中的作用及其相關的分子機制研究相對缺乏。因此，關于VB2在雞胚胎水平的添加所引起的機體變化也亟待進一步深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所用胚蛋為AA肉雞商業化雞胚，購買于開封興達種雞場。

1.2 RNA提取、cDNA合成和實時熒光定量PCR （qRT-PCR）

Trizol法提取雞原代成肌細胞總RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA，日本）試劑盒進行cDNA的合成。實時熒光定量用cDNA為模板，使用SYBR Green（TaKaRa，日本）染料進行，反應體系為20 μL：2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板 1 μg，上、下游引物各 0.2 μmol·L^-1，RNase Free dH2O補足20 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，循環 40 次。雞的GAPDH基因作為內參基因，每個樣品均進行3次技術重復，用 2^{-△△CT［22］}方法計算相對表達量。

1.3 雞原代成肌細胞的分離、純化和鑒定

1.3.1 雞原代成肌細胞的分離

按標準孵化方法孵化胚蛋至11胚齡，胚蛋表面用75%乙醇消毒后超凈臺紫外照射30 min以上，用無菌鑷子在胚蛋鈍端敲開蛋殼，去除氣室上部蛋殼帽后，換另一個新的無菌鑷子去除氣室卵殼膜，用無菌眼科鑷子夾取胚胎移到已加PBS（含1%雙抗）溶液的無菌培養皿中；用鑷子輕輕剝開腿部皮膚，沿雞胚腿根部剪下腿部后放進完全培養基（含1%雙抗+20%血清）中，仔細分離肌肉，去除骨骼，將分離后的肌肉放進新加了完全培養基的培養皿中；用鑷子小心去除軟骨，轉移肌肉組織到無菌1.5 mL的離心管中，將組織剪碎后轉移至無菌50 mL離心管中；在漩渦振蕩器上高速震蕩混合1 min后放置試管架上，靜置后吸取上清液，經200目尼龍膜細胞篩過濾至100 mL小燒杯中；加入8～10 mL完全培養基重懸管內組織，再次過濾，重復3～4次直至上清液呈透亮沒有懸浮細胞為止;用1 000～1 200 g離心機離心上述所得細胞液5 min，重復一次，棄上清；用完全培養基重懸細胞，轉移至培養瓶中，在37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.3.2 雞原代成肌細胞的純化

利用差速貼壁法對成肌細胞進行純化。將上述獲得的細胞培養40 min后，把上清液轉移至新的培養瓶中繼續培養，重復兩次，以消除成纖維細胞。成肌細胞培養24～48 h，每天注意觀察細胞形態，當培養瓶內細胞達90%以上的密度時即可進行傳代或鋪板。

1.3.3 雞原代成肌細胞的鑒定

采用肌肉細胞內特異性表達的desmin蛋白的免疫熒光來鑒定雞胚分離的雞成肌細胞的純度，具體步驟如下所示（以24孔細胞板為例）：待細胞單層鋪滿后，棄去培養基，PBS清洗1～3次；加4%冷的甲醛固定液，20 min后棄去固定液，PBS洗1～3次；加0.1% TritonX×100破膜液，10 min后棄去破膜液，PBS洗1～3次；加與二抗宿主相同的血清封閉1 h，或者4% BSA封閉1 h，200 μL·孔^-1；棄去封閉液，加desmin一抗，4 ℃過夜，注意細胞板保持水平，棄去desmin，PBS洗1～3次；加入FITC標記的二抗，室溫避光孵育2 h，棄二抗，PBS洗1～3次；加入1 μg·mL^-1的DAPI孵育細胞1 min，棄DAPI，PBS洗1～3次；在倒置熒光顯微鏡中觀察，有熒光的細胞占總細胞的90%以上，則純度滿足要求，即可進行下一步的試驗。

1.4 CCK-8和EdU檢測

CCK-8法檢測細胞增殖活力，步驟參考Cell Counting Kit-8 （美侖，中國）說明書。用EdU試劑盒檢測細胞增殖數量，步驟參考廣州市銳博生物有限公司的EdU細胞增殖檢測（成像檢測）試劑盒使用說明書。

1.5 MYHC免疫熒光檢測

試驗步驟與“1.3.3”相同，加入的一抗為anti-MYHC antibody （B103；DHSB， 美國），二抗為anti-mouse IgG FITC-conjugated antibody（bs-0296G-FITC；Bioss， 北京， 中國）。

1.6 雞原代成肌細胞的VB2處理試驗

細胞水平添加維生素B2（Sigma，德國），其分子量為376.36，在常溫下，中性和偏酸性溶液中，核黃素的溶解度很低，通常不超過250 mg·L^-1（660 μmol·L^-1）。在成肌細胞生長至60%～70%時添加5個不同梯度的VB2溶液，參考He等^［9］的研究設置添加濃度，分別設置為1.562 5、3.125、6.25、12.5和25 μmol·L^-1，并設置培養基添加為對照組，待細胞單層長滿時收細胞。

1.7 雞胚胎注射給養VB2試驗

在雞胚胎時期于胚胎中注射不同濃度的維生素B2溶液，觀察維生素B2對雞生長發育的影響。每只雞胚注射維生素B2溶液體積為0.1 mL，注射部位為卵黃囊。

VB2溶液配制：參考White等^［23］的研究設置VB2溶液注射劑量，將VB2溶解在生理鹽水中，分別配制成每100 μL生理鹽水含50、100和200 μg的VB2溶液，設置生理鹽水為對照組，試驗共分為4組，每組25個重復，共100枚蛋。

種蛋孵化第7天進行注射，注射前先照蛋，剔除死胚蛋和無精蛋，并測量蛋重。同時確定胚胎位置，在氣室下方進行打孔。注射前用75%酒精擦拭注射位置并對周圍進行消毒，注射針頭和管徑要適中。一枚蛋換一個針頭，注射完用蠟封口立刻放回孵化箱。

在18胚齡時測量蛋重、雞胚重、腿肌重和胸肌重，另外每組挑選3只雞胚的胸肌組織制作切片檢測肌纖維直徑和面積。用VB2酶聯免疫分析試劑盒檢測胸肌組織中VB2含量。

1.8 雞胚胸肌石蠟切片制作和HE（蘇木素-伊紅）染色

將18胚齡雞胚的胸肌肌肉組織制作石蠟切片，經4%甲醛溶液固定24 h以上，之后進行洗滌和脫水12 h，石蠟包埋和切片、展片、貼片后進行脫蠟和蘇木精-伊紅染色，再水洗和分化以及漂洗和脫水后再復染，之后再進行脫水和透明處理，最后封藏后成片。用系統生物顯微鏡對切片進行組織學觀察。

1.9 數據統計分析

目的基因的相對表達量用2^-ΔΔCt法進行計算，雞的GAPDH基因作為內參基因。每個樣品均進行3次技術重復。采用SPSS 20.0進行獨立樣本t-test分析，每組3個生物學重復，Plt;0.05 表示差異顯著（用*表示），Plt;0.01 表示差異極顯著（用**表示），Plt;0.001 表示差異極顯著（用***表示），Pgt;0.05時表示無顯著性差異，結果使用GraphPad Prism 7.0軟件進行作圖，數據表示為“平均值±標準誤 （mean±SEM）”。

2 結 果

2.1 不同濃度VB2添加后對雞原代成肌細胞增殖活力的影響

本研究首先鑒定了分離的雞原代成肌細胞的純度，在培養48 h時對雞原代成肌細胞進行了Desmin染色，免疫熒光染色結果發現分離的成肌細胞純度很高（圖1A），可以進行后續細胞試驗。為了檢測不同濃度的VB2對成肌細胞增殖活力的影響，共設置6個濃度梯度，分別為0、1.562 5、3.125、6.25、12.5和25 μmol·L^-1，檢測了不同添加濃度對細胞增殖活力的影響（圖1B）。結果表明，VB2添加量為6.25和12.5 μmol·L^-1時，在12、24和48 h均表現出較高的細胞增殖活力；在36 h時添加量為3.125 μmol·L^-1 VB2組細胞表現出最高的增殖活力；1.562 5 μmol·L^-1 VB2添加組細胞增殖活力雖然不是最高，但是與對照組相比，細胞增殖活力在4個時間點均顯著升高（Plt;0.05）；然而25 μmol·L^-1 VB2添加組在12和24 h時與對照組相比顯著升高（Plt;0.05），在36和48 h時與對照組相比顯著降低（Plt;0.05）。因此，結果發現6.25和12.5 μmol·L^-1 VB2添加組細胞活性與對照組相比在4個時間點均顯著升高（Plt;0.05），在12、24和36 h時，6.25和12.5 μmol·L^-1 VB2添加組之間細胞活性差異不顯著（Pgt;0.05），在48 h時6.25 μmol·L^-1添加組細胞活性最高且與12.5 μmol·L^-1添加組相比差異顯著（Plt;0.05），因此6.25 μmol·L^-1添加組和12.5 μmol·L^-1添加組對細胞增殖活力的促進作用均較好，本研究選擇了較小VB2添加量6.25 μmol·L^-1進行下一步研究。

2.2 細胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2對雞原代成肌細胞增殖的影響

本研究通過檢測在成肌細胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2后增殖標志基因的變化從而檢測VB2對成肌細胞增殖的影響（圖2A），結果發現，增殖標志基因CCND1（Plt;0.01）、CDK1（Plt;0.05）和PCNA（Plt;0.01）均顯著升高，這些結果證明VB2可能影響細胞增殖，因此接下來進一步研究了VB2對細胞增殖的影響。在細胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后進行EdU檢測，結果發現在添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后細胞增殖數量顯著增加（Plt;0.05）（圖2B）。因此，以上結果說明添加6.25 μmol·L^-1 VB2可以促進雞原代成肌細胞的增殖。

2.3 細胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2對雞原代成肌細胞分化的影響

本研究檢測了VB2添加對雞原代成肌細胞分化的影響。首先在成肌細胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2后檢測分化標志基因的變化（圖3A），結果發現，分化標志基因MYOD、MYOG和MYHC的變化均不顯著（Pgt;0.05），MYHC蛋白表達水平變化也不顯著（Pgt;0.05）（圖3B）。在成肌細胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后又進行MYHC免疫熒光檢測，結果發現，在添加6.25 μmol·L^-1 VB2之后細胞分化沒有明顯變化（Pgt;0.05）（圖3C）。

2.4 雞胚胎注射不同濃度VB2溶液后對雞胚胎骨骼肌發育的影響

上述結果表明，VB2可以增加成肌細胞的增殖活性，為了研究VB2對雞活體肌肉發育的影響，本研究進一步在胚胎卵黃囊中（圖4A）注射不同濃度（50、100和200 μg·只^-1）的VB2，對照組注射0.9%的生理鹽水。檢測結果發現，在注射50 μg時，體內VB2含量顯著升高（Plt;0.05），100 μg時達到極顯著升高水平（Plt;0.001），但是在注射200 μg時變化并不顯著（Pgt;0.05）（圖4B）。本研究又檢測了不同濃度VB2的添加對胚胎體重、腿肌重和胸肌重的影響。結果發現，不同濃度水平VB2的添加并未對胚胎體重產生顯著影響（Pgt;0.05）。通過統計7胚齡（注射前）和18胚齡（注射后）的蛋重，以及胚胎腿肌重和胸肌重，結果發現與注射生理鹽水對照組相比，只有在50和200 μg VB2添加組中胸肌重顯著升高（Plt;0.05），蛋重和腿肌重變化均不顯著（Pgt;0.05）（圖4C）。

2.5 雞胚胎注射50 μg VB2后對骨骼肌肌纖維發育的影響

為了進一步研究VB2對雞骨骼肌肌纖維發育的影響，本研究又檢測了VB2注射后胚胎胸肌組織增殖和分化標志基因的變化。結果發現與細胞水平相似，CDK1（Plt;0.01）和PCNA（Plt;0.001）顯著升高，CCND1升高，但是變化不顯著（Pgt;0.05）（圖5A）。與細胞水平不同的是，MYOD和MYOG也顯著升高（Plt;0.05），MYHC變化不顯著（Pgt;0.05）（圖5B）。說明在胚胎注射VB2后，影響了活體胸肌肌肉組織的細胞增殖和分化過程。接下來本研究又檢測了VB2的添加對胚胎肌纖維發育的影響。結果發現，添加50 μg的VB2顯著促進了雞胚胸肌肌纖維直徑（圖5C）（Plt;0.05），腿肌肌纖維變化不顯著（Pgt;0.05）（圖5D）。

3 討 論

核黃素 （也是VB2） 作為嘌呤核苷酸代謝通路的下游代謝物，是機體新陳代謝中的一個重要成分，它與動物體內脂肪、碳水化合物以及氨基酸代謝有著密切的關系，VB2作為微量元素添加劑，具有提高飼料利用率， 促進家禽正常生長發育的作用^［24-25］。飼料中的核黃素易被吸收，核黃素在生物體內的積蓄量并不多，大多隨尿液排出體外^［26］。Summers等^［27］在雞日糧中補充了11種維生素混合物，然后在每個處理組中去掉其中1種維生素，進而研究哪個維生素對雞只的生長發育影響最大，結果發現在研究的11種維生素中，只有缺少VB2組會顯著降低雞3周齡的體重，VB2缺乏還會導致高比例的雞只癱瘓。此外，當VB2缺乏時會導致多種代謝障礙。家禽自身不能合成VB2，極易缺乏，缺乏時癥狀表現為肌肉無力麻痹和大腿肌肉萎縮等^［7］。這些研究暗示VB2可能對于肌肉發育具有重要的影響作用，但是目前尚未見有關VB2影響雞骨骼肌發育的機制研究。骨骼肌肌肉生長發育的過程需要成肌細胞的增殖和分化^［28］，本研究表明在成肌細胞中添加6.25 μmol·L^-1 VB2后可以顯著增加細胞增殖活力，并且發現添加VB2后增殖標志基因CCND1、CDK1和PCNA均顯著升高，分化標志基因MYOD、MYOG和MYHC變化不顯著，說明VB2對雞原代成肌細胞的分化沒有顯著影響。EdU試驗也進一步印證了VB2可以促進細胞增殖的推測。成肌細胞增殖是骨骼肌生長發育的基礎^［29］，為了驗證VB2對活體水平骨骼肌發育的作用，并更好的利用VB2進行家禽早期營養調控，本研究進行了VB2胚蛋給養試驗。

胚蛋注射給養營養素是調控家禽早期營養的有效手段^［30］，但是目前還處于探索階段，尋找高效的外源性營養素并闡明其調控胚胎生長發育的分子機制是目前研究的重點。胚蛋注射營養素的時期、部位以及注射劑量都需要十分精確，這樣才能保證注射效果且不影響孵化率。雞胚12胚齡前主要營養物質來自卵黃囊，因此卵黃囊的注射期在12胚齡前^［31］，此外，雞胚的生長發育主要在8～18胚齡之間^［32］。有研究發現，7胚齡給養β-羥基-β-甲基丁酸效果優于18胚齡，證明一些營養素更適于禽胚的早期利用^［15］。因此，本研究選擇7胚齡注射不同濃度VB2溶液，在胚胎生長發育的末期18胚齡時進行蛋重、體重、腿肌重、胸肌重以及增殖、分化標志基因表達變化的檢測。結果發現，隨著注射濃度的添加，雞胚體內的VB2含量也顯著增加，但是添加200 μg時VB2含量變化并不顯著，其平均水平與添加50 μg組相似。機體貯存過多或補充過量VB2會造成吸收率下降^［33］，因此本研究表明每只胚蛋VB2的添加劑量不宜超過100 μg，以免造成營養素的浪費和對雞胚吸收造成負擔。此外，結果發現VB2的添加并沒有改變18胚齡時的胚蛋重、胚胎重和腿肌重，但是注射50 μg VB2添加組和200 μg VB2添加組的胸肌重與注射生理鹽水對照組相比顯著升高。汪張貴等^［34］的研究具有相似的結果，不同水平的核黃素添加能夠增加雛雞部分免疫器官的重量，但對其體重無明顯影響，這可能與添加劑量、遺傳背景、品種特性及應激等多種因素有關。此外，VB2添加對腿肌重無顯著影響，而胸肌和腿肌在表型上的差異可能源于胚胎發育后期兩者生長速度的不同所導致^［35］。Hughes^［36］研究表明，過量添加VB2對于機體生長并無下降的影響，但由于添加200 μg組與50 μg組的VB2吸收率一樣，因此本研究試驗結果表明每只胚蛋給養VB2的最適劑量為50 μg。此外，50 μg VB2添加組胸肌肌纖維直徑也顯著升高。本研究進一步檢測增殖和分化標志基因的表達變化，進而探索VB2促進胸肌發育表型背后的分子機制，結果發現，與細胞水平結果相似，50 μg VB2添加組增殖標志基因CDK1和PCNA顯著升高。已有研究表明CDK1在成肌細胞增殖階段高度表達，具有促進成肌細胞增殖的作用^［37］，PCNA作為一種參與DNA復制的蛋白質，在細胞周期的S期表達量最大，是細胞增殖的分子標記^［38］。但是與細胞水平不同的是分化標志基因MYOD和MYOG也顯著升高，MYHC變化不顯著。MYOD作為一種骨骼肌特異性表達的轉錄因子^［39］，與MYOG共同作用，在肌肉發育和再生過程中發揮調節肌肉生成的關鍵作用，是重要的成肌調節因子^［40］，因此，這些基因的變化可能是導致活體水平肌纖維變化的原因。此外，推測與細胞水平存在的差異一方面是不同水平所添加的VB2劑量的不同，另一方面可能由于作用時間的不同所導致。本研究結果表明，VB2具有顯著促進成肌細胞增殖的作用，這為肌纖維在活體水平的形成提供了重要基礎。因此，本研究深入解析了VB2對雞原代成肌細胞增殖、分化以及胚胎胸肌發育影響的分子機制，為肉雞分子營養調控機制提供研究思路。

4 結 論

本研究明確了在細胞水平添加6.25 μmol·L^-1 VB2促進雞原代成肌細胞增殖的作用。此外，在胚胎水平添加50 μg VB2可以顯著增加雞胚胸肌重和肌纖維直徑。本試驗為我國優質肉雞分子營養調控機制研究提供了重要的理論依據和應用價值。

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（編輯 郭云雁）