非洲豬瘟病毒H108R蛋白的制備及其免疫原性評價

摘 要： 本研究旨在制備ASFV H108R蛋白，通過免疫小鼠評價該蛋白的免疫原性，為該蛋白作為疫苗候選抗原的研究提供理論依據。利用生物信息學工具分析H108R蛋白的結構及基本理化性質，選擇編碼蛋白33～108 AA的基因序列串聯融合到原核表達載體，轉化后經IPTG誘導表達，用鎳親和層析純化目標蛋白質。免疫小鼠利用流式細胞術檢測脾臟活化的CD4+和CD8⁺T淋巴細胞，分離小鼠血清測定特異性抗體滴度，利用Western blot和IFA鑒定多克隆抗體的特異性。并用試劑盒檢測血清中細胞因子含量，將血清與ASFV-GFP病毒孵育評估抗體是否能抑制病毒的復制。生物信息學分析表明H108R蛋白為親水性蛋白質，有跨膜區，無信號肽，蛋白二三級結構中存在較多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot顯示IPTG誘導后，成功表達純化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能夠誘導小鼠脾臟T細胞的活化，刺激機體產生更高水平的細胞因子。免疫制備的多克隆抗體效價為1∶128 000，能與ASFV-GFP病毒特異性結合，與病毒孵育后能明顯抑制病毒的復制。本研究成功表達制備了ASFV H108R蛋白，免疫能夠誘導脾臟T淋巴細胞活化，引起細胞因子水平升高，制備的多克隆抗體能夠明顯抑制病毒的復制，具有較好的免疫原性，為深入研究H108R蛋白的生物學功能及疫苗研究奠定基礎。

關鍵詞： 非洲豬瘟病毒（ASFV）；H108R蛋白；多克隆抗體；免疫原性

中圖分類號：S852.659.1

文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1344-11

收稿日期：2024-04-28

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD1801302-3）；甘肅省自然科學基金重點項目（23YFNA0011）；中央高?；究蒲袠I務費專項（lzujbky-2022-ct02）；蘭州市青年科技人才創新項目（2023-QN-3）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（CAAS-ZDRW202409）；國家生豬產業技術體系（CARS-35）；甘肅省科技重大專項（23ZDKA0002）

作者簡介：張 越（1995-），男，甘肅華池人，博士生，主要從事動物疫病防控與檢疫研究，E-mail： 1969962334@qq.com

*通信作者：鄭海學，主要從事動物傳染病與流行病學研究，E-mail： zhenghaixue@caas.cn

Preparation and Immunogenicity Evaluation of African Swine Fever Virus H108R Protein

ZHANG" Yue1， RU" Yi1， HAO" Rongzeng1， YANG" Rui2， ZHAO" Longhe1， LI" Yajun2，

YANG" Yang1， ZHANG" Rong2， JIANG Chenghui 2， ZHENG" Haixue^1*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention，College of

Veterinary Medicine， Lanzhou University，Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000， China; 2.China

Agricultural Vet. Bio. Science and Technology Co.， Ltd.， Lanzhou 730046， China）

Abstract：" The aim of this study was to prepare the ASFV H108R protein， to evaluate the immunogenicity of the protein by immunization of mice and to provide a theoretical basis for the investigation of this protein as a candidate antigen for vaccines. The structure and basic physicochemical properties of the H108R protein were analyzed using bioinformatics tools， and the gene sequence encoding the protein 33-108 AA was selected for tandem fusion into a prokaryotic expression vector， transformed and induced to express by IPTG， and the target protein purified by nickel affinity chromatography. Immunized mice were examined by flow cytometry to detect spleen-activated CD4+and CD8+T lymphocytes， mouse serum was isolated to determine specific antibody titres， and the specificity of polyclonal antibodies was determined by Western blot and IFA. The cytokine content of the serum was determined using the kit， and the serum was incubated with ASFV-GFP virus to assess whether the antibody could inhibit virus replication. Bioinformatics analysis showed that the H108R protein is a hydrophilic protein with a transmembrane region， no signal peptide， and more α-helices exist in the protein’s ditertiary structure. SDS-PAGE and Western blot showed that the purified H108R protein was successfully expressed after IPTG induction. The protein was able to induce activation of mouse splenic T cells and stimulate the body to produce higher levels of cytokines after immunization of mice. The immunized polyclonal antibody with a potency of 1：128 000 was able to specifically bind to the ASFV-GFP virus and significantly inhibit viral replication after incubation with the virus. In this study， ASFV H108R protein was successfully expressed and produced， and immunization was able to induce activation of splenic T lymphocytes leading to an increase in cytokine levels， and the produced polyclonal antibody was able to inhibit virus replication， which had a good immunogenicity， and it lays a foundation for the in-depth study of the biological function of H108R protein and the research of vaccine.

Keywords： African swine fever virus （ASFV）; H108R protein; polyclonal antibodies; immunogenicity

*Corresponding author：" ZHENG Haixue， E-mail： zhenghaixue@caas.cn

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的，可使感染的家豬和野豬出現急性出血性熱、高致死性的一種傳染病^［1］。該病被世界動物衛生組織（The World Organisation for Animal Health，WOAH）列為法定報告動物傳染疫病^［2］，在我國被農業農村部列為一類動物疫病。根據世界動物衛生組織報道，2022—2024年全球因非洲豬瘟導致超過138萬只豬死亡^［3］，是全球養豬業的“頭號殺手”。非洲豬瘟早在1921年就被發現，但由于病毒結構的復雜性、對病毒和宿主相互作用以及免疫保護機制的認知有限，目前仍然沒有有效的商品化疫苗和藥物可用。

ASFV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，也是已知唯一的蟲媒DNA病毒^［4］。病毒的基因組大小170～194 kb，編碼超過150種蛋白質，許多蛋白質的結構和功能仍然未知^［5］。ASFV在自然界長期傳播，造成病毒遺傳多樣。目前根據B646L基因（p72）C-末端的核苷酸序列差異和紅細胞吸附差異可將非洲豬瘟病毒分為24個基因型和8個血清型^［6-7］。在我國主要是基因Ⅱ型毒株^［8］，但據報道已經出現Ⅰ型^［9］以及Ⅰ型和Ⅱ型的重組強毒株^［10］。

非洲豬瘟病毒粒子呈正二十面體結構，具有5層膜結構，每個病毒顆粒包含3萬多個蛋白質亞基，病毒粒子直徑約為260 nm^［11］。其中非洲豬瘟病毒H108R蛋白位于病毒內囊膜上^［12］，是一種重要的毒力基因，在ASFV-Georgia2007（ASFV-G）基因組敲除該基因后能夠影響病毒在巨噬細胞的復制，免疫后能抵抗親本毒株的攻擊^［13］，但對該蛋白的參與的生物學功能及機制研究并不全面，尤其是尚未對該蛋白是否可作為非洲豬瘟亞單位疫苗候選抗原的潛力進行評估。本研究通過對ASFV H108R蛋白進行生物信息學分析，設計合成原核表達載體，利用大腸桿菌表達目標蛋白質，并免疫小鼠從體液和細胞免疫評價其免疫原性，旨在為H108R蛋白的結構和生物學功能研究及疫苗候選抗原開發提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實驗動物

BALB/c小鼠購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器

BL21（DE3）感受態細胞和TMB顯色液均購自索萊寶生物公司；小鼠抗6×His 標簽單克隆抗體、HRP-山羊抗小鼠IgG （H+L）和HRP-山羊抗豬IgG （H+L）、DAPI染色液和山羊抗小鼠IgG Hamp;L （Alexa Fluor 594）均購自英國 Abcam 公司；HisTrap HP親和層析柱購自Cytiva 公司；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性核酸內切酶、弗氏完全和弗氏不完全佐劑、蛋白質分子量標準均購自賽默飛科技公司；小鼠淋巴細胞分離液、小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-4 的ELISA檢測試劑盒均購自達科為生物公司；FITC anti-mouse CD3e、APC anti-mouse CD4和PE anti-mouse CD8a流式抗體均購自聯科生物；刺激成熟的豬骨髓巨噬細胞（BMDC）由本實驗室分離保存；ASFV-GFP重組病毒（在ASFV-CN-GS/2018毒株基因重組插入GFP標簽）和ASFV豬陽性血清由中國農業科學院蘭州獸醫研究所非洲豬瘟區域實驗室提供。

主要儀器：AKTA pure150蛋白純化儀（Cytiva 公司）；美國激光共聚焦顯微鏡（萊卡公司）；熒光倒置顯微鏡（賽默飛公司）。

1.2 H108R蛋白生物信息學分析

NCBI下載非洲豬瘟HLJ/2018毒株H108R蛋白的氨基酸序列（GenBank登錄號：QBH90605.1），利用Protparam^［14］（https：//web.expasy.org/protparam/）在線進行分析H108R蛋白質的氨基酸組成及理化性質；使用TMHMM-2.0^［15］（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析H108R蛋白的跨膜區；利用SignalP 5.0^［16］（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）分析H108R蛋白是否存在信號肽；通過ExPASY網站的SOPMA^［17］（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）預測H108R蛋白的二級結構。利用I-TASSER（https：//zhanggroup.org/I-TASSER/）^［18］在線預測H108R蛋白的三級結構。

1.3 重組表達載體的設計合成

根據H108R蛋白生物信息學分析結果，去掉蛋白質的跨膜區部分，以（G3S）3柔性Linker將H108R的33～108位的氨基酸重復串聯連接設計基因序列，選擇EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點由金唯智生物公司合成并插入到pET-28a原核表達載體中。合成的質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證并測序正確后命名為pET-H108R。

1.4 重組 pH108R 蛋白的表達及可溶性分析

將pET-H108R原核表達質粒轉化至E. coil BL21（DE3）感受態細胞中。挑選單菌落轉接LB液體培養基（含20 μg·mL^-1卡那霉素）中，37 ℃搖床培養至菌液OD600 nm吸光值約0.8時，加入終濃度為0.1 mmol·L^-1 IPTG誘導，同時設置未加IPTG的對照組。轉移至17 ℃搖床培養15 h，收集菌體并用PBS溶液重懸，超聲破碎后，高速離心收集上清和沉淀，進行 SDS-PAGE確定蛋白質表達形式。并以小鼠抗His標簽單克隆抗體作為一抗，HRP 標記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進行Western blot鑒定目標蛋白質。

1.5 重組pH108R 蛋白的純化及特異性鑒定

收集超聲破碎后的菌體沉淀，利用含8 mol·L^-1尿素的PBS溶液重懸后，置于4 ℃搖床震蕩過夜。12 000 r·min^-1高速離心收集上清，利用PBS稀釋至含2 mol·L^-1尿素后用于上樣。將HisTrap HP親和層析柱連接到AKTA蛋白純化系統進行純化，將稀釋后的上清樣品通過親和層析柱后，用含2 mol·L^-1尿素100 mmol·L^-1咪唑的PBS緩沖液去除雜蛋白，用含2 mol·L^-1尿素500 mmol·L^-1咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白。目標蛋白質通過PBS緩沖液透析后，用于后續試驗。并以ASFV豬陽性血清（稀釋比1∶600）作為一抗，HRP-山羊抗豬IgG （H+L）為二抗（稀釋比1∶5 000）進行Western blot鑒定目標蛋白質。

1.6 小鼠免疫及血清抗體效價檢測

取10只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機均分為兩組，將100 μg H108R重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化后，在背部皮下免疫，同時對照組用等體積PBS與弗氏佐劑乳化后免疫。間隔14 d后將H108R與弗氏不完全佐劑1∶1乳化進行加強免疫，在14 d后摘眼球采血，分離血清，用于抗體的反應原性及效價檢測。將H108R 稀釋蛋白至1 mg·L^-1，100 μL·孔^-1加入酶標板，4 ℃過夜包被。PBST洗滌后，用5% 脫脂奶粉封閉2 h。再用PBST洗滌后，將制備的多克隆抗體從1∶1 000開始進行倍比稀釋，同時設置陰性對照。每個梯度重復3孔，每孔加入100 μL，室溫結合1.5 h。洗滌5次，加入 HRP-山羊抗小鼠IgG （H+L）（1∶5 000稀釋），室溫結合1 h。洗滌6次，加入TMB顯色液顯色后，加入50 μL終止液（2 mol·L^-1 H2SO4）終止反應，用酶標儀檢測各孔OD450 nm吸光度值。

1.7 多克隆抗體的特異性檢測

1.7.1 Western blot檢測

將純化的目標蛋白質H108R蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，電轉移到硝酸纖維素膜上，以H108R多克隆抗體為一抗（稀釋比例為1∶800），HRP-山羊抗豬IgG （H+L）作為二抗（稀釋比1∶10 000）進行Western blot驗證。

1.7.2 細胞免疫熒光（IFA）試驗

將豬骨髓巨噬細胞鋪于專用的共聚焦小皿，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中過夜，接種ASFV-GFP毒株48 h后，棄去上清。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS輕柔洗滌3次，用PBS配制3%的BSA封閉2 h。PBS 輕柔洗滌，以小鼠 H108R多克隆抗體作為一抗，加小鼠陰性血清作為對照組（1∶200稀釋），加PBS作為Mock組，在37 ℃，孵育1 h。以山羊抗小鼠IgG Hamp;L （Alexa Fluor 594）作為二抗（1∶500稀釋），避光室溫孵育30 min。再加入DAPI染色液約2 min后，用PBS 洗滌干凈后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 脾組織T細胞活化水平檢測

分離加強免疫兩周小鼠的脾臟，置于無菌培養皿中，加入5 mL RPMI 1640培養基，利用2 mL注射器的活塞溫和研磨。將研磨后的細胞懸液利用70 μm尼龍網過濾到新的50 mL離心管中，將細胞離心后棄去上清液，加入3 mL紅細胞裂解液重懸細胞靜置3 min后，加入5 mL PBS并離心。用PBS重懸細胞，細胞懸液使用FITC anti-mouse CD3e、 APC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8a標記，并利用流式細胞儀檢測，利用FlowJo軟件分析試驗結果，用GraphPad Prism 9.0統計分析數據。

1.9 細胞因子檢測

分離加強免疫兩周的小鼠血清，利用細胞因子ELISA定量檢測試劑盒檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的含量，并利用GraphPad Prism 9.0統計分析數據的差異性。

1.10 H108R多克隆抗體抑制ASFV-GFP病毒復制

在將1×105 BMDC細胞接種到96孔細胞培養板中，并在37 ℃含5% CO2培養箱中培養過夜。將小鼠 H108R多克隆抗體和陰性血清（PBS組）56 ℃ 30 min滅活，分別進行倍比稀釋到1∶64，同時設置RPMI 1640培養基（Mock組）分別與等體積的ASFV-GFP病毒在37 ℃孵育3 h，棄掉細胞上清液，將病毒孵育混合物加入到細胞中進行孵育2 h，用含5% FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640培養基替換上清液。并繼續在37 ℃含5%二氧化碳培養箱中培養48 h后，利用熒光顯微鏡觀察細胞中還有綠色熒光的斑點差異。選擇1∶64稀釋的血清孵育后感染的細胞反復凍融3次后，通過絕對定量PCR^［19］測定樣品的病毒拷貝數。

2 結 果

2.1 H108R生物信息學分析

H108R蛋白含原子總數為1 772，分子式組成C580H880N140O169S3，對應的分子質量為12.614 ku。其氨基酸組成見表1，帶負電荷的殘基數（Asp+Glu）為11， 帶正電荷的殘基數（Arg+Lys）為7，等電點pI 5.20；總評價親水性平均疏水性Grand average of hydropathicity （GRAVY）為-0.218，判斷H108R為親水性蛋白。跨膜區和信號肽及親疏水性分析結果顯示，H108R蛋白全長 108個氨基酸，其中10—32 AA 為跨膜區（圖1），不存在信號肽序列（圖2），對其氨基酸序列親疏水性預測前，1—35 AA疏水性較強（圖3）。SOPMA軟件在線預測H108R蛋白二級結構，顯示其二級結構主要含有α-螺旋（Ｈh）、延伸鏈（Ｅe）及無規則卷曲（Ｃc），占比分別為37.96％、17.59％和36.11%（圖4）。根據I-TASSER預測三級結構顯示，H108R蛋白的三維空間結構存在較多的α-螺旋（圖5），與二級結構相似。本研究我們選取編碼H108R 33～108 AA 的基因序列串聯融合，選擇酶切位點EcoRI和XhoI連接到pET-28a載體中，獲得pET-H108R。

2.2 重組質粒pET-H108R的鑒定

重組質粒pET-H108R經雙酶切后，利用瓊脂糖凝膠電泳分析，可見與預期設計基因大小相一致的目標條帶（見圖6）。測序結果與設計序列相一致，成功構建了含有H108R基因序列的重組質粒。

2.3 重組蛋白H108R的表達鑒定

pET-H108R 重組質粒轉化到表達感受態細胞誘導表達。通過SDS-PAGE 和Western blot鑒定結果顯示，在27 ku左右有一條明顯的條帶，重組H108R 蛋白主要是在超聲破碎后的菌體沉淀中（見圖7），以包涵體形式存在。

2.4 重組H108R蛋白純化及鑒定

通過利用8 mol·L^-1尿素變性后的菌體沉淀進行純化，成功獲得重組蛋白 H108R。利用ASFV陽性血清進行Western blot鑒定，也在與預期目標蛋白大小處出現特異性條帶（見圖8），表明成功純化后得到ASFV H108R蛋白。

2.5 H108R蛋白多克隆抗體的制備及效價測定

分離加強免疫后2周的血清，通過間接 ELISA 測定血清抗體效價。結果顯示（圖9）其抗體效價可達1∶128 000。

2.6 H108R多克隆抗體的特異性鑒定

以多克隆抗體為一抗，經Western blot鑒定（圖10A），多克隆抗體能識別純化的H108R蛋白質，說明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。以多克隆抗體為一抗，經間接免疫熒光鑒定ASFV-GFP感染的細胞。與陰性血清相比（圖10B），在H108R多克隆抗體組中出現特異性紅色熒光。即制備的抗H108R多克隆抗體與ASFV-GFP病毒感染的細胞具有良好的反應性。

2.7 H108R蛋白能誘導細胞免疫應答

通過流式細胞術檢測脾淋巴細胞T細胞的變化，結果顯示（圖11）H108R蛋白免疫后脾臟產生CD4+和CD8+T淋巴細胞的比例都明顯升高，表明該蛋白能夠誘導脾臟T淋巴細胞的活化。

2.8 H108R蛋白能誘導機體產生更高水平的細胞因子

通過檢測外周血的細胞因子水平，結果顯示（圖12）H108R蛋白免疫能誘導機體產生更高水平的細胞因子。

2.9 H108R多克隆抗體抑制病毒的復制

H108R多克隆抗體與ASFV-GFP病毒孵育后，在48 h后明顯觀察到病毒復制形成的熒光病毒的斑點數減少，對應的病毒基因拷貝數也更低，結果表明（圖13）H108R多克隆抗體可以抑制病毒的復制。

3 討 論

ASF是WOAH法定報告的豬烈性傳染病，急性致死率可達100%^［2］。2018年8月，ASF首次傳入我國并迅速擴散，給我國生豬產業造成了巨大的經濟損失，目前尚無可用的疫苗和藥物防控，主要依賴嚴格的生物防控以及早期診斷及感染豬群撲殺策略^［20］。非洲豬瘟已在我國流行了6年多，由早期的Ⅱ型強毒株流行為主^［8］到田間出現基因Ⅰ型毒株^［9］，并與基因Ⅱ型毒株發生混合感染，其后出現Ⅰ/Ⅱ型重組毒株^［10］，更為嚴峻的是，利用基因Ⅱ型毒株制備的減毒疫苗不能對重組毒株提供交叉保護，這對國內疫病的防控帶來了更大的挑戰^［21-22］。

ASFV一種細胞質巨DNA病毒，基因組龐大，編碼超過150種蛋白質，其中結構蛋白超過50種，但大多數蛋白質的結構和功能并不清楚^［5］。目前已經有多種非洲豬瘟蛋白質利用原核系統表達，如p72、p30、p54、CD2v等結構蛋白可用于非洲豬瘟血清學診斷和相關疫苗的研究^［23-25］。H018R蛋白又名J5R是一種位于病毒內膜的蛋白^［26］，在ASFV-G毒株的基因組中刪除H108R基因后，病毒的毒力降低，并能夠對親本毒株的攻擊產生免疫性保護，是一個重要的毒力基因，但對該蛋白質在病毒參與的生物學具體過程和機制有待進一步研究，以及能否作為亞單位疫苗候選抗原的潛力也需要評估。

本文利用生物信息學分析軟件，對HLJ/18毒株H108R蛋白質的理化性質及二、三級結構進行預測。我們選取親水性好的區域（33～108 AA），串聯后合成質粒并利用大腸桿菌系統進行表達，誘導后pH108R蛋白主要以包涵體形式表達，可能是由于原核表達量高，蛋白質不能有效正確折疊，以及抗原串聯的形式增加了蛋白質可溶形式表達的難度。在本研究中原核表達產量較高，利用尿素變性再復性后能獲得大量的可溶性蛋白質，且具有較好的抗原反應性。但與真核系統相比缺少蛋白質翻譯后修飾，后續也可選擇利用真核系統表達來提高蛋白質的可溶性^［27］。將H108R蛋白免疫小鼠后，制備的多克隆抗體效價可達1∶128 000。免疫后能夠刺激小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細胞的比例升高，產生更高水平的細胞因子，將抗體稀釋到1∶64與ASFV-GFP病毒孵育仍能明顯抑制病毒復制，本研究表明了H108R蛋白具有良好的免疫原性，具有作為亞單位疫苗候選抗原的潛力。這也為該蛋白質參與的病毒生物學功能研究，以及在疫苗抗原研究方面提供良好的生物材料支持。

4 結 論

本研究成功制備了非洲豬瘟 H108R蛋白，免疫小鼠能夠誘導脾臟T細胞的活化，刺激產生更高水平的細胞因子，制備的H108R多克隆抗體能夠抑制ASFV-GFP病毒的復制，具有較好的免疫原性。

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（編輯 白永平）