禽流感病毒與新城疫病毒多靶標核酸質譜檢測方法研究及應用

摘 要： 禽流感和新城疫是全球養禽業最具威脅的兩種病毒性傳染病，快速準確地病原檢測和分型對于這兩種動物疫病的早期防控和阻斷傳播具有至關重要的作用。本研究通過將微量多重RT-PCR、單堿基延伸和基于MALDI-TOF的質譜技術聯合使用，針對禽流感和新城疫病毒建立了一種高通量核酸質譜檢測方法，并對方法的靈敏度、特異性和重復性進行了評價。結果表明，建立的方法可即時同步檢測禽流感病毒（A型通用）、H5、H7、H9亞型，新城疫病毒及其中強毒株，各個靶標的檢測靈敏度為8.82～15.40 copies·μL^-1，與其他禽病病原核酸無交叉反應，對12 copies·μL^-1的6種混合靶標的檢測重復性均在75%以上。對179份實驗室收集的送檢樣品（包括拭子樣品和組織臟器）檢測結果表明，與熒光RT-PCR檢測方法相比，禽流感病毒通用檢測靶標符合率為98.9%；其他靶標的符合率均為100.0%。本研究為禽流感、新城疫病毒的快速鑒別檢測及重要亞型/株型的同步快速分型鑒定提供了一種新的高通量替代方法。

關鍵詞： 禽流感病毒；新城疫病毒；多靶標；核酸質譜

中圖分類號：

S851.34"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1386-10

收稿日期：2024-04-16

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFF0703804）；海關總署科研項目（2022HK125）

作者簡介：高志強（1974-），男，內蒙古烏蘭察布人，研究員，博士，主要從事動物檢疫研究，E-mail： gaozhiqiang02@163.com

*通信作者：種 焱，主要從事動物檢疫研究，E-mail： chongy1965@163.com; 賴平安，主要從事動物檢疫研究，E-mail： 1979669124@qq.com

Studies and Application of Multi-target Nucleic Acid Mass Spectrometry Detection Method

for Avian Influenza/Newcastle Disease Virus

GAO" Zhiqiang1， LAI" Ping’an^1*， SONG" Yueqian1， CHONGnbsp; Yan^1*， GUO" Youran2， BAI" Zilong1，

GUO" Huimin2， WANG" Lin1， PU" Jing1， SHI" Xiju1， REN" Tong1， ZHAO" Xiangpeng1

（1.Science and Technology Research Center of China Customs， Beijing 100026，" China;

2.Zhejiang Digena Diagnostic Technology Co. Ltd， Hangzhou 311100，" China）

Abstract：" Avian influenza （AI） and Newcastle disease （ND） are the two most threatening viral infectious diseases in the global poultry industry. Rapid and accurate pathogen detection and typing are of vital importance for the early control and transmission blocking of these two animal diseases. （Method） In this study， a high-throughput nucleic acid mass spectrometry method for detection of AIV and NDV was developed by combining micro multiplex RT-PCR， single base extension and MALDI-TOF mass spectrometry， and the sensitivity， specificity and repeatability of the method were evaluated. The results showed that the established method could detect AIV （type A）， subtype H5， subtype H7， subtype H9， NDV and its velogenic/mesogenic strains synchronously. The analytical sensitivity of targets was 8.82-15.40 copies·μL^-1， and there was no cross-reaction with other avian pathogen nucleic acid. The reproducibility of 6 mixed targets at 12 copies·μL^-1 was above 75%. The detection results of 179 samples （including swab samples and tissue organs） collected in laboratory showed that the coincidence rate of universal target of AIV was 98.9%， and the other targets were 100.0% compared with real-time RT-PCR. So a new high-throughput alternative method is provided for differential detection of AIV， NDV， and their important subtypes/strains synchronously in this study.

Keywords： avian influenza virus; Newcastle disease virus; multi-target; nucleic acid mass spectrometry

*Corresponding authors：" CHONG Yan， E-mail： chongy1965@163.com; LAI Ping’an， E-mail： 1979669124@qq.com

禽流感（avian influenza， AI）及新城疫（Newcastle disease， ND）是危害世界養禽業最嚴重的兩種禽病，具有發病快，死亡率高的特點，常常給養禽業造成毀滅性打擊。對于禽流感，目前最為嚴重的是由H5、H7亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的高致病性禽流感和H9亞型病毒引起的禽流感^［1］。盡管H9亞型禽流感為低致病性的，但會導致蛋雞產蛋量大幅下降，肉仔雞發病率、死亡率升高，對我國家禽養殖效益影響巨大^［2］。新城疫目前仍然是危害養禽業最嚴重且是發病率高的疾病之一，在養殖業的多年發展過程中，盡管采取了密集免疫措施，但也不時發生疫情，特別是自我國發現基因Ⅵ、Ⅶ型等新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）毒株感染以來，這些毒株的流行時有發生并造成較為嚴重的經濟損失^［3］。

AIV和NDV均為RNA病毒，變異迅速，特別是禽流感病毒HA基因和新城疫F基因，在免疫選擇壓力下，亞型內或同一基因型毒株基因序列可存在較大差異^［1，3］。因此針對單一基因靶位的分型檢測技術常常會漏檢同一亞型的變異毒株。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是一種新型質譜檢測技術，通過將生物大分子與芯片上基質分子共結晶后，在激光轟擊后與基質分離形成帶正電的離子，在真空飛行中將不同質核比的離子分開并進行檢測。該方法通過與超微量多重（RT-PCR）聯用，設計針對不同靶標的一系列延伸引物（UEP）進行單堿基延伸反應，通過對多種特異性延伸片段進行質量檢測，從而實現對樣品的多靶標同步檢測^［4］。目前，核酸飛行質譜可實現最多單管數十個靶點的同步檢測，可顯著降低單個靶點檢測的時間和物料成本^［5］。禽流感病毒主要亞型和新城疫中強毒株變異大，多靶點檢測思路可快速對禽流感病毒主要亞型和中強毒力新城疫病毒株作出精準鑒別。由于禽流感病毒H5/H7/H9亞型以及中強毒力新城疫病毒株型復雜，目前尚未有快速、靈敏的針對以上病毒亞型/毒株的多靶點分子檢測技術。

本研究針對禽流感、新城疫病毒、禽流感病毒重要亞型（H5/H7/H9）、新城疫中強毒株以及β-actin 內參基因，設計多重RT-PCR引物及UEP延伸引物，建立并優化了對樣品中禽流感、新城疫病毒及重要亞型/株型的多靶點同步檢測的飛行質譜方法，為口岸相關產品中禽流感、新城疫病毒的精準智能監測提供了新的高通量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸及被檢樣品

滅活病毒核酸A/Chicken/JL（H3），A/Chicken/JL（H4），A/Duck/HB （H5N1），A/Chicken/HD （H5N1），A/Duck/LCR （H5N1），A/Duck/SY（H5N1），A/Bird/WV（H5N1），A/Duck/BJ（H5N5），A/Chicken/BJCIQ GDV1（H7），A/Chicken/SDV（H9N2），NDV F48E9，NDV Lasota，NDV I系疫苗株，IBV/H52，DVEV/BJ，GPV/BJ 均為本實驗室保存，鴿源鴿新城疫病毒YQ/SPF F3（基因VI型）核酸，北京市農林科學院惠贈；NDV NA-1M株（基因VII型）F基因體外轉錄RNA，本實驗室制備保存。滅活拭子及組織樣品，本實驗室收集保存。

1.2 主要試劑

Labserv預分裝磁珠法病毒核酸提取試劑盒，購自賽默飛公司；多重RT-PCR擴增試劑及酶混合物，購自翌圣生物公司；蝦堿性磷酸酶（SAP）、單堿基延伸試劑以及SpectroChip CPM384芯片，購自浙江迪譜診斷技術有限公司；引物及探針，均委托上海生工生物工程公司合成；RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7及SP6體外轉錄試劑盒，購自Promega公司。

1.3 主要設備

核酸飛行時間質譜儀為浙江迪譜診斷技術有限公司產品；QuantStudio 5熒光定量PCR儀為賽默飛公司產品；數字 PCR 儀為新羿生物公司產品。

1.4 樣品前處理及核酸提取

樣品按照GB/T 19438.1—2004 所述方法進行前處理后，使用商品化磁珠法病毒核酸提取試劑盒提取核酸，洗脫于 80 μL無核酸酶水中，4 ℃保存備用。

1.5 核酸質譜檢測引物的設計合成

對于禽流感、新城疫病毒通用檢測，選擇M基因作為靶區域，對于H5、H7和H9亞型檢測，選擇HA基因作為靶區域，對于新城疫病毒中強毒株檢測，選擇其F基因112—117位氨基酸位點編碼基因及其附近序列作為靶區域，內參基因選擇禽類和哺乳動物β-actin 基因作為靶區域。根據 GISAID 和NCBI發布的相關序列，采用MAFFT v7.52 分別進行序列比對，設計合成 7 套含質量標簽的擴增引物和15條延伸引物。用于核酸質譜檢測的擴增及延伸引物名稱、序列及分子量見表1。

1.6 陽性質控品制備

分別克隆構建以下含有各個靶標完整基因片段的質粒pGEM-T-Influ A-M，pBSK-HA（H5N2），pMD20-T-HA（H7N1），pMD20-T-HA（H9N2），pGEM-T-Lasota-M以及pGEM-T-F48E9-F。將各個質粒線性化后，使用Promega T7或SP6體外轉錄試劑盒制備出以上各個靶標基因的體外轉錄試劑盒，測定計算出拷貝數，使用含有5 ng·μL^-1雞肉總RNA的稀釋液分別稀釋后，混合作為多靶標陽性質控品。

1.7 反應體系建立與優化

將上述陽性質控品稀釋至各個病原靶標均為100 copies·μL^-1作為模板，引物起始終濃度從1 μmol·L^-1開始，UEP初始濃度按照分子量4 000～5 000 u為5 μmol·L^-1，5 000～6 000 u為7.5 μmol·L^-1，6 000～7 000 u為10 μmol·L^-1，7 000 u以上15 μmol·L^-1的原則進行混合，以所有靶標均能同步檢出作為標準進行反應體系優化。經多重擴增、SAP 反應及單堿基延伸反應后，在384反應板中設定位置先加入18 μL DEPC水，將反應產物全部置于已加入反應板中預先添加DEPC水的各個孔中，貼膜離心。將預先編輯好包括各條UEP引物分子量以及單堿基延伸后分子量信息的測試文件導入軟件，打開核酸飛行質譜儀甲板，將384反應板封板膜去掉后放入指定位置。然后將檢測芯片放入指定位置。設置樹脂純化產物后進行質譜檢測。

1.8 最低檢出限（LOD）測定

為確定各個靶標同步檢測的LOD，將103、102、50、25、12、6、3、1、0.5 copies·μL^-1的6種靶標混合體外轉錄RNA，應用“1.7”建立的MALDI-TOF質譜檢測方法進行每個稀釋度8個重復的檢測，使用概率回歸計算出各個靶標的檢測下限。

1.9 與熒光RT-PCR檢測極限的比較

以H7檢測靶標為例，將pMD20-T-HA（H7N1）體外轉錄RNA作適當稀釋后使用數字PCR測定其拷貝數，作10倍系列稀釋，分別采用建立的MALDI-TOF質譜檢測方法和標準的H7亞型熒光RT-PCR檢測方法進行比較，比較兩種方法的靈敏度差異。

1.10 特異性試驗

采用建立的MALDI-TOF質譜檢測方法對“1.1”所收集病毒核酸進行檢測，評估方法的特異性。

1.11 重復性試驗

采用建立的MALDI-TOF質譜檢測方法對濃度分別為50、25以及12 copies·μL^-1的6種混合靶標體外轉錄RNA進行8次重復性試驗，以SNR（信噪比）gt;6作為判定標準，評價方法的可重復性。

1.12 樣品檢測

對179份實驗室收集保存的送檢樣品（包括拭子樣品和組織臟器）應用建立的飛行質譜方法和標準的熒光RT-PCR方法進行檢測比較，在實際樣品中驗證方法的實用性。

2 結 果

2.1 反應體系建立與優化

為獲得最佳效果，首先通過對 16 條擴增引物濃度進行優化，建立總體積為 5 μL多重微量RT-PCR 體系：其中包括RNA 模板2 μL，2×HU MP緩沖液 2.5 μL，酶混合物 0.3 μL，NDV M 基因擴增引物濃度為 0.16 μmol·L^-1，其余擴增引物濃度均為 0.1 μmol·L^-1。多重RT-PCR擴增反應的反應條件：50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環。反應結束后，加入 2 μL SAP 反應液：其中 SAP 緩沖液 0.17 μL，SAP 酶 0.3 μL，DEPC 水 1.53 μL。反應條件為37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。SAP 反應結束后，加入優化好的單堿基延伸反應體系 2 μL，其中包括iPLEX 延伸緩沖液0.2 μL，iPLEX終止Mix 0.2 μL，iPLEX 延伸酶0.04 μL，延伸引物濃度為 4.7～23.5 μmol·L^-1。單堿基延伸反應條件：預變性94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，40個循環，其中每個循環中，94 ℃ 5 s后，52 ℃ 5 s與80 ℃ 5 s連續循環5次；72 ℃ 3 min。結果顯示建立的反應可同時檢出均為100 copies·μL^-1所有病原靶標，詳見圖1。

2.2 最低檢出限（LOD）測定結果

應用建立的反應體系對各個靶標同步檢測的LOD 進行測定，概率回歸結果顯示6 種病原靶標的檢測限分別為AIV 通用 13.43 copies·μL^-1，H5 8.82 copies·μL^-1，H7 13.55 copies·μL^-1，H9 15.4 copies·μL^-1，NDV 通用 12.81 copies·μL^-1，NDV 中強毒株 11.28 copies·μL^-1。詳見圖 2。

2.3 與熒光RT-PCR檢測極限的比較

數字 PCR 測定 H7 體外轉錄 RNA拷貝數為18 891 copies·5 μL^-1。作 10 倍系列稀釋后，對濃度為0.037 8～3.78×104copies·μL^-1的體外轉錄 RNA，分別采用建立的MALDI-TOF質譜檢測技術熒光 RT-PCR 檢測方法進行比較，結果顯示兩種檢測方法的檢測極限均為0.378 copies·μL^-1，表明對于單一靶標，兩種檢測方法的檢測極限在同一數量級水平，詳見圖3、 4。

2.4 特異性試驗

特異性試驗結果表明建立的MALDI-TOF質譜檢測方法均只能在各自延伸產物產生特異性單峰，其中H3和H4亞型毒株核酸僅A型通用靶標出現特異延伸峰；6個不同來源H5亞型毒株核酸H5靶標均出現特異性延伸峰，其他亞型靶標未出現延伸峰；H7和H9亞型毒株核酸均在相應亞型靶標出現特異延伸峰；NDV中期毒株包括I系（中毒）、F48E9（強毒）、YQ/SPF F3（強毒）以及NDV NA-1M株（強毒）均在F基因靶標出現特異性延伸峰；NDV LaSota（弱毒）僅在通用M基因靶位出現延伸峰；而其他病原核酸的各個病原靶位均未出現特異性延伸峰。表明建立的方法能夠特異性對禽流感病毒和新城疫病毒進行檢測和主要亞型的鑒別，且與其他病原靶標無交叉反應，特異性強。“1.1” 所述的禽流感和新城疫病毒核酸的特異性質譜圖見圖5。

2.5 重復性試驗

以SNRgt;6作為判定標準，結果顯示僅在各個靶標濃度為12 copies·μL^-1時，總計有5個檢測值為陰性，其中AIV通用 1個（陽性率87.5%），H7 1個（陽性率87.5%），H9 2個（陽性率75%），新城疫通用1個（陽性率87.5%）。表明方法的重復性與穩定性良好，結果匯總見表2。

2.6 樣品檢測結果

檢測結果如表3所示，對于57份熒光RT-PCR檢測為AIV陽性樣品，AIV通用檢測敏感性96.5%，特異性100%，符合率為98.9%，兩種方法的Kappa值為0.974。其他靶標檢測敏感性、特異性及符合率均為100%；Kappa值為1.0。以上結果表明對于真實送檢樣品，兩種方法檢測結果無顯著差異。

3 討 論

禽流感及新城疫是世界養禽業最重要的兩大傳染病，具有流行范圍廣，傳播速度快，基因型復雜，危害大，難以防控等特征。使用單一靶標檢測方法不僅檢測周期與成本加大，而且由于亞型或株型內變異大，容易發生變異株漏檢^［6］；而開發多靶標高通量檢測方法，可實現禽流感或新城疫重要亞型或株型的同步快速鑒別，提升檢測效率的同時，還可防止變異株漏檢，從而為防控提供高效技術保障。

對于禽流感及新城疫的快速核酸精準檢測，主要包括RT-PCR結合一代測序，熒光RT-PCR，等溫擴增技術等。比較前沿的技術平臺包括高通量測序（NGS），靶向納米孔測序以及數字PCR技術等。目前應用最為廣泛的是熒光RT-PCR技術，該技術靈敏、特異，實現了閉管實時檢測，可精準檢出1～10拷貝的靶核酸，但該技術每一檢測通道僅能對單一靶位進行檢測。數字RT-PCR盡管可實現真正意義上的絕對定量，但同樣存在檢測通量低，一次性檢測樣本量和靶標數有限的缺點^［7］。RT-PCR結合第一代測序技術由于引物容錯能力較強，可較好規避病原變異對檢測帶來的影響，但一般適用于檢測小于600 bp的核酸序列中的檢測，多重檢測往往會顯著影響擴增靈敏度。二代及三代全基因組測序（WGS）目前也已經用于禽流感病毒的分子溯源研究^［8］，但WGS耗時長，成本高，技術要求高，因此一般只用于重要樣品的分子變異和溯源分析，不適合常規樣品快速篩查^［9］。

研究中發現，由于單堿基延伸的高靈敏度和質譜技術的高分辨率，將多重RT-PCR、單堿基延伸及基于MALDI-TOF核酸質譜技術聯合使用，可顯著提升多重RT-PCR反應的靈敏度，并降低多重引物設計難度，通過精準寡核苷酸分子量測定，進而推算出延伸位點的堿基類型，實現SNP位點測定，特別適合于亞型、基因型或株型多且復雜病原的多靶位檢測^［10］。而且該技術具有開放和可擴展性，可以根據需要添加新的檢測位點，用于病原多變異位點的靶向識別和追蹤^［11］。

本研究針對禽流感病毒及其重要亞型（H5/H7/H9）、新城疫病毒及其中強毒株以及用于質控采樣和檢測過程β-actin 內參基因，在對不同地域或進化分支的毒株進行序列比對的基礎上進行多重RT-PCR引物及UEP延伸引物的設計，為能覆蓋不同來源的毒株，避免變異株漏檢，對于變異最大的H5毒株、NDV中強毒株等均設計了多套擴增引物或UEP引物，并取得較好效果。特異性試驗中顯示該體系能夠檢出收集的多個不同來源的 H5、H7以及H9亞型流感病毒核酸，和常見的基因II型、VI型和VII型NDV強毒株核酸，但不能檢出Lasota弱毒株。靈敏度試驗中發現，對所有靶標的同步檢測，本方法的LOD略低于熒光RT-PCR方法，為8.82～15.40 copies·μL^-1。但對于樣品中單一靶標，本方法與熒光RT-PCR方法靈敏度在同一水平，推測是由于多靶標同步檢測中各個靶標的擴增存在一定競爭抑制。在對臨床送檢樣品的檢測中發現，本方法與熒光 RT-PCR方法具有較好的一致性，Kappa為0.974～1.0，僅在禽流感通用靶標檢測中，存在2份樣品的差異，由于這兩份樣品為弱陽性，且測試人員和測試時間存在差異，推測可能是人員誤差或低濃度核酸管內分布不均勻所致。

4 結 論

聯合使用微量多重RT-PCR、單堿基延伸和基于MALDI-TOF的質譜技術，針對禽流感和新城疫病毒建立了一種高通量核酸質譜檢測方法，建立的方法可即時同步檢測禽流感病毒（A型通用）、H5亞型、H7亞型、H9亞型、新城疫病毒及其中強毒株，各個靶標的檢測靈敏度為8.82～15.40 copies·μL^-1，特異性好，與熒光RT-PCR檢測方法相比，禽流感病毒通用檢測靶標符合率為98.9%；其他靶標的符合率均為100%。該方法可用于禽流感、新城疫病毒的快速鑒別檢測及重要亞型/株型的同步快速分型鑒定。

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（編輯 白永平）