兩種掃描電鏡處理方法對海南金枕榴蓮花粉形態的影響

摘 要 以金枕榴蓮的花粉為材料，采用新鮮花粉直接噴金法和常規生物電鏡樣品制備2種方法處理，對榴蓮花粉進行了掃描電鏡觀察，分析了榴蓮花粉的形態特征并比較了2種處理方法對花粉電鏡觀察的影響。結果表明：金枕花粉粒為球形，大小為（60.99±3.50）μm×（62.57±3.77）μm，P/E值為0.98±0.04。花粉萌發器官為散孔，萌發孔有圓形和橢圓形兩種，大小為（14.04±1.70）μm×（9.29±1.35）μm，P/E值1.53±0.17，單個花粉粒萌發孔數量不一，萌發孔數量（單面）多為1～3個。榴蓮花粉含水量較豐富，外壁柔軟易褶皺變形，直接噴金法很難維持花粉的正常形態，常規制樣方法雖處理復雜，但能保持花粉形態與表面特征完整。明晰了金枕榴蓮花粉粒形態特征，為研究榴蓮的遺傳多樣性提供科學依據，并對榴蓮花粉電鏡樣品處理有重要的指導意義。

關鍵詞 金枕榴蓮；花粉形態；掃描電鏡；制樣方法

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.05.016

榴蓮（Durio zibethinus Murr.）屬錦葵科（Malvaceae）榴蓮屬（Durio），又名韶子、麝香貓果，是一種全球聞名的熱帶水果，因其獨特的香氣、特色的外殼和濃郁的味道在全世界范圍內大受歡迎，被譽為“水果之王”[1]。榴蓮富含蛋白質、脂類和氨基酸，有強大的保健功能，在現代醫學中，榴蓮提取物可作為消炎藥治療炎癥和水腫，榴蓮蛋白酶還可治療支氣管炎、急性肺炎等多種炎癥[2]。榴蓮原產于東南亞[3]，根據泰中農業貿易協會提供的數據，2023年全球榴蓮產量主要集中在印度尼西亞（35.4%）、泰國（33.2%）、越南（19.3%）和馬來西亞（11.2%）等國，其中印度尼西亞是全球最大的榴蓮生產國，榴蓮產量高達158萬t。2024年中國—東盟榴蓮產業大會發布的數據表明，我國是榴蓮消費大國，2023年鮮榴蓮進口量與進口額均創歷史新高，分別達142.59萬t和67.16億美元，約占全球出口榴蓮的82%，較2022年分別增長了72.87%和65.56%[4]。自2019年德勝40株景觀榴蓮開花結果事件以來，我國榴蓮種植業進入規模化種植階段[5]。目前，我國榴蓮栽培區域主要集中在北緯18°以南，即海南省三亞、樂東、保亭和萬寧等地；廣西、廣東和云南均有少量種植。據2024年相關數據統計，我國榴蓮栽培面積約2 667 hm2，掛果面積約267 hm2，產量約250 t，榴蓮產業展現出了巨大的發展潛力和市場價值。

前人研究發現，我國榴蓮研究領域主要集中在外殼吸附性能、風味物質、果實采后貯藏品質、果實營養物質功能成分等方面，而種植技術、種質資源引種試種、優良品種選育、病蟲害防控等方面研究較少[6]。花粉，作為植物界中承載著遺傳信息的雄性生殖細胞，在漫長的進化歷程中演化出獨特形態特征。花粉結構遺傳保守性好，因此在花粉分析、鑒定時，花粉形態研究是基礎之一[7]，而掃描電鏡的發展帶動了花粉形態學研究[8]。掃描電鏡能提供高分辨率的圖像，常用于觀察植物的根莖表皮及其橫切面形態，如花粉粒的三維立體形態、種子與果實的整體形態、種皮特征和孢子的微觀形態等[9]。近年來掃描電子顯微鏡的應用能直接且清晰地揭示植物花粉的形狀、大小及外壁紋飾、生殖孔形態等超微結構特征，不僅加深了對花粉形態復雜性的認識，更為植物在屬、亞屬乃至種間水平的分類、鑒別與分析提供了強有力的證據與依據[10]。榴蓮自交授粉很難，授粉不良，有的自花不育，因此主要依賴異花授粉。而在榴蓮栽培中，人工輔助授粉才能保障榴蓮生長，因此，研究榴蓮花粉對榴蓮育種具有重要影響。在榴蓮花粉的研究方面，對不同品種榴蓮花粉活性及人工授粉已有相關研究[11]，而關于榴蓮花粉掃描電鏡的形態觀察未見有報道。

此研究以金枕榴蓮為材料，利用新鮮花粉直接噴金法和常規生物電鏡樣品制備2種方法對金枕榴蓮花粉的形態特征進行觀察，以明確適合榴蓮成熟花粉掃描電鏡觀察的方法，進一步明晰榴蓮花粉粒形態特征，為研究榴蓮遺傳多樣性奠定基礎。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

采樣地位于海南省保亭黎族苗族自治縣七仙嶺全球熱帶果樹博覽中心的榴蓮種植基地。保亭黎族苗族自治縣屬于熱帶季風氣候，雨熱充沛，年平均氣溫24.2～26.2 ℃，年平均降水量1 575.1～2 324.7 mm，是適宜榴蓮種植的區域之一。于2022年5月和8月榴蓮盛花期，任意選取3株3～5年生健康的金枕榴蓮樹，每株環繞四周采摘6朵花瓣剛展開、大小相似、無損傷的榴蓮花，每朵花單獨置于1個封口袋中備用。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 常規掃描電鏡樣品制備及觀察

榴蓮花粉常規掃描電鏡樣品的制備參考何樂平等[12]方法。選取新鮮榴蓮花，用鑷子摘取完好的花囊5～8個，置于2 mL 離心管中，加入1 mL 由0.1 mol·L-1、pH值6.8磷酸緩沖液配制而成的2.5%戊二醛溶液，4 ℃條件下固定12 h；0.1 mol·L-1、pH值6.8磷酸緩沖液漂洗15 min，漂洗3次，以確保沖洗掉固定液；然后進行酒精梯度脫水，酒精濃度梯度由低至高依次為30%、50%、70%、85%、95%和100%，每梯度脫水15 min；隨后用乙酸異戊酯置換材料中的酒精，每次15 min，重復2次；用二氧化碳臨界點干燥儀進行干燥，干燥后在解剖鏡下用解剖針剖開花藥，取出花粉，將花粉粘在樣品臺上，噴金，使用日立TM4000PIus 掃描電鏡對花粉的形狀、外壁紋飾等進行觀測拍照，測量單粒花粉的極軸長（P）和赤道軸長（E）。

1.2.2" 新鮮花粉直接噴金法掃描電鏡樣品的制備及觀察

在顯微鏡下，直接取出花粉粒群粘于導電膠的一面，另一面粘于掃描顯微鏡樣品臺，使用直接噴金的方法，用掃描電鏡（日立 HITACHI S-3400N）對花粉進行觀察并拍照記錄相關數據，具體方法見參考文獻[12]。使用日立TM4000PIus 掃描電鏡對榴蓮花粉的形狀、花粉狀態、外壁紋飾和萌發孔等進行觀測拍照，并測量單粒花粉的極軸長（P）和赤道軸長（E），萌發孔大小等數據。

2" 結果與分析

由圖1a、1b、1c可知，金枕榴蓮的花粉粒為圓球形，大小為（60.99±3.50）μm×（62.57±3.77）μm，P/E值為0.98±0.04。花粉萌發器官為散孔，萌發孔有圓形和橢圓形兩種，大小為（14.04±1.70）μm×（9.29±1.35）μm，P/E值1.53±0.17，單個花粉粒萌發孔數量不一，萌發孔數量（單面）多為1～3個（圖1a、圖1b），包括孔蓋和孔環，無花粉外壁的區域呈環狀，被一圈向外突起的、類似于瓶口的“孔環”結構包圍，中央則被蓋子狀的“孔蓋”結構覆蓋（圖1b）。萌發孔散布于球面，花粉外壁光滑，無明顯紋飾。

采用常規掃描電鏡樣品制備方法處理金枕榴蓮成熟花粉，在掃描電鏡下可觀察到完整的花粉形態，花粉顆粒飽滿，萌發孔結構、花粉外壁形態清晰可見，十分容易辨認，花粉間分散性較好，粘連程度低（圖1c），但花粉粒表面容易粘連其他細小雜質，但不影響總體形態結構的觀察。相比之下，使用新鮮花粉直接噴金法觀察榴蓮花粉，花粉粒凹陷變形，脫水皺縮，花粉外壁出現褶皺甚至破裂，萌發孔形態模糊變形，難以辨認（圖1d、圖1e）；花粉間分散性差，花粉粒成堆粘連、交叉重疊（圖1f），難以觀察其外壁形態與結構。

3" 討論與結論

榴蓮屬于被子植物門雙子葉植物綱錦葵目錦葵科榴蓮屬，也有人認為榴蓮屬于錦葵目木棉科。錦葵目錦葵科的蜀葵Althaea rosea、木芙蓉Hibiscus mutabilis、海島棉Gossypium barbadense、冬葵 Malva crispa花粉的掃描電鏡發現，這些花粉均為球形，花粉粒比榴蓮花粉略大[13]。其中蜀葵花粉表面紋飾均有刺狀紋，具體表現為二型刺，其突起（第二型刺）明顯短于第一型刺，形似瘤狀突起，先端圓滑，不同品種蜀葵花粉的突起長度不一、數量不一[14]。據前人研究總結，錦葵科植物花粉形態的進化趨勢基本如下：花粉形狀由近球形轉變為球形，花粉大小由中等（直徑25～50 μm）演變為較大（直徑50～100 μm），再到大（100～200 μm），萌發孔由3孔溝演變為散孔，表面紋飾由短刺轉變為二型刺；花粉表面平滑轉變為花粉表面密集顆粒狀突起[15-16]。金枕榴蓮花粉粒為球形，大小為（60.99±3.50）μm×（62.57±3.77）μm，P/E值為0.98±0.04，花粉萌發器官為散孔，說明金枕榴蓮在錦葵科中可能屬于較原始的類群。

植物各品種間的花粉特征存在差異，因此，可以根據花粉形態等特征進行歸類，并大致判斷物種間的親緣關系。在錦葵目木棉科木棉樹Bombax malabaricum的花粉觀察實驗中發現，木棉花粉粒比金枕榴蓮花粉略大，且極面觀為三角形，赤面觀為橢圓形，表面紋飾為粗網狀[11]，花粉形態與金枕榴蓮花粉差異較大。因此，推測金枕榴蓮在分類上更接近錦葵科。

掃描電鏡具有高分辨率、圖像清晰、立體直觀等優良特點，目前已被廣泛運用于植物孢子、花粉等微觀形態的觀察。花粉樣品制備是保證掃描電鏡觀察結果清晰且準確的關鍵步驟[17]。不同種類或相同種類不同成熟度的花粉，有不同的花粉樣品制備方法。何樂平等[12]認為，采用直接噴金的方法更適合成熟的擬南芥花粉觀察；而常規的樣品制作方法能保持發育早期的花粉形態結構的完整度，更有利于發育早期的花粉形態結構觀察。在梔子屬花粉的研究中發現，花粉外壁較薄且含水量較高，如果使用直接干燥的方法，花粉粒的水分流失迅速，同時受到表面張力的作用，花粉表面結構易塌陷、皺縮及變形[18]，因此，梔子屬花粉形態掃描電鏡觀察宜采用常規掃描電鏡樣品制備方法。直接噴金法簡單便捷、費時短、能保持花粉的活體狀態等優點，此法能較好地保持青島老鸛草花粉的原始狀態，且花粉表面的細微結構清晰可見[19]。因此，直接噴金處理材料的方法更適合老鸛草花粉的掃描電鏡觀察。在枇杷花粉電鏡觀察的實驗中，研究者比較觀測了新鮮花粉、風干花粉、戊二醛固定花粉和醋酸酐分解花粉的形態，發現戊二醛固定花粉、醋酸酐分解花粉與新鮮花粉的形狀、大小均無差異，僅風干花粉外壁表面大都發生不同程度的凹陷或萎縮[20]，因此，使用戊二醛固定花粉的常規制作方法更適合枇杷花粉的掃描電鏡觀察。

與直接噴金法相比，常規電鏡處理方法主要用到戊二醛、磷酸緩沖液、超臨界CO2等樣品。戊二醛作為一種高效的固定劑，在維持花粉等細微生物結構方面起著重要作用，能夠牢固地固定花粉顆粒，確保在后續處理步驟中，花粉形態與表面特征得以完好保留。采用磷酸緩沖液進行漂洗是這一流程中的關鍵步驟。磷酸緩沖液不僅能有效去除花粉表面附著的雜質、多余黏液等不利因素，還能通過其適宜的pH值環境保護花粉內部的生物活性物質不受破壞，進一步提升了樣品的純凈度和觀察質量。在干燥環節，利用超臨界CO2的獨特性質，在接近其臨界溫度和壓力的條件下進行干燥，能徹底消除傳統干燥方法中因液體表面張力引起的樣品收縮和損傷問題。這樣一來，花粉樣品在干燥過程中能保持原有的形態和細節，極大地提高了掃描電鏡下觀察的圖像清晰度和分辨率。

在選擇花粉掃描電鏡處理方法時，應根據花粉的種類、發育時期及實驗目的等具體情況進行處理。常規制作方法適用范圍廣，花粉形態與表面特征完整度較高，但制作方法復雜、實驗條件要求嚴格，對于某些外壁較厚且含水量低的花粉[21]來說，直接噴金法掃描電鏡觀察即可滿足研究需要。榴蓮花粉含水量較豐富，外壁柔軟容易褶皺變形，直接噴金法掃描電鏡觀察很難維持花粉較正常的形態，因此，在榴蓮花粉的電鏡觀察實驗中建議采用常規制樣方法。

榴蓮的生殖生物學研究中，榴蓮花粉形態對于理解榴蓮的適應性、進化歷程及繁殖機制至關重要。為了更深入地探究榴蓮花粉的形態特征，采用新鮮材料花粉直接噴金與常規生物電鏡樣品制備2種方法對金枕榴蓮花粉進行了觀察，豐富了對榴蓮屬花粉形態的認識，并推動榴蓮屬花粉聚類分析等相關研究的進程。將新鮮材料花粉直接噴金與常規生物電鏡樣品制備2種方法相結合對比，能夠相互驗證2種方法所得結果的準確性和可靠性。通過對比分析2種方法下榴蓮花粉的形態特征可進一步探討樣品制備過程對花粉形態的影響，優化樣品處理流程，提高形態分析的準確性和效率。此外，這一研究還將為榴蓮種質資源的保護、遺傳改良及人工授粉技術的優化提供科學依據，促進榴蓮產業可持續發展。未來，隨著電鏡技術的不斷進步和跨學科融合，更簡單可靠的掃描電鏡處理方法將在榴蓮花粉形態學、植物系統學及農業育種等領域發揮更加重要的作用，為探索植物生殖生物學的奧秘貢獻更多力量。

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（責任編輯：易" 婧）

收稿日期：2024-10-03

基金項目：熱帶果樹榴蓮種質資源的收集引進、鑒定評價及本土種苗繁育技術研究（ZDYF2021XDNY116）。

作者簡介：張琳（2001—），在讀碩士，主要從事熱帶果樹栽培及病蟲害防治研究。E-mail：luckyliana@163.com。

*為通信作者，E-mail：zhifu555@163.com。