高產玉米品種“玉農76”品種真實性及種子純度鑒定SSR核心引物篩選

摘 要：“玉農76”玉米雜交種是河南農業職業學院選育并大面積推廣種植的玉米品種。研究利用40對玉米SSR核心引物對2個待測樣品進行DNA指紋鑒定，確定高產、優質玉米品種“玉農76”的真實性，發現SSR標記umc2007y4、bnlg1940k7、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、bnlg240k1、phi080k15、umc1432y6、bnlg1520k1、umc1999y3、umc2160k3、bnlg2235y5、umc2084w2、umc2163w3能夠在待測樣品和“玉農76”間擴增出清晰、穩定的條帶，認為這14對SSR引物可用于“玉農76”品種真實性的快速鑒定；發現4對共顯性SSR標記phi053k2、bnlg2291k4、umc1125y3、bnlg1520k1能夠在“玉農76”及其親本自交系間擴增出清晰、穩定的共顯性條帶，認為這4對SSR引物可用于“玉農76”的種子純度鑒定；發現標記bnlg1520k1可同時對“玉農76”的品種真實性和種子純度進行鑒定。此外，研究構建了“玉農76”及其親本自交系的十進制數字指紋圖譜，為加強“玉農76”的品種保護及種子品質監管提供了理論依據與技術支持。

關鍵詞：“玉農76”；品種真實性；種子純度；DNA指紋圖譜

中圖分類號：S513 文獻標志碼：B 文章編號：1674-7909（2025）5-82-6

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2025.05.017

0 引言

玉米作為我國主要的糧食、飼料和能源作物，其雜交后獲得的F1雜交種表現出較強的雜種優勢。因此，利用雜種優勢培育高產、優質、穩產的新品種，是目前玉米品種選育的主要方式［1］。我國是玉米生產大國，高產的玉米品種為我國的糧食安全、飼料工業和畜牧業發展做出了巨大貢獻，其種子品質問題關系到我國糧食安全和農民的切身利益［2］。近年來，玉米種子產業發展迅速。由于玉米雜交種種子生產與銷售中蘊含著較高的經濟利潤，越來越多的企業投入玉米種子產業，其中難免出現如制售假劣種子、種子混雜及套牌侵權等違法行為，造成種子市場混亂，嚴重侵害農民、育種者及正規種子生產企業的合法權益，影響了我國種業的健康可持續發展［3］。因此，品種真實性和種子純度鑒定對玉米品種的保護和農業生產具有重要作用。目前，鑒定品種真實性和種子純度的方法較多，如表型鑒定、同工酶電泳、種子貯藏蛋白電泳、DNA分子標記等，但傳統的表型鑒定周期較長、工作量大、易受環境影響，不利于品種真實性和種子純度鑒定工作的開展，而同工酶電泳、種子貯藏蛋白電泳重復性差，不能滿足實際需要［4］。目前，DNA分子標記技術成為鑒定品種真實性和種子純度的重要手段。在常用的分子標記中，SSR（Simple Sequence Repeat，簡單序列重復）標記因其多態性高、數量豐富、重復性好、操作簡便等優點，在品種真實性鑒定和種子純度鑒定中最為常用［5］。玉米品種真實性和一致性鑒定的行業標準《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY/T 1432—2014）指出，可采用SSR標記技術對玉米品種進行鑒定。然而在行業標準中，鑒定工作需要檢測40對引物，鑒定工作量大、成本高，不利于在實際經營銷售時對品種真實性和種子純度進行快速鑒定。

“玉農76”是河南農業職業學院選育的擁有自主知識產權的高產、優質玉米品種，于2019年通過國家農作物品種審定（國審玉20190010號），2021年通過東華北春播區國家審定（國審玉20210049號）。“玉農76”是一種早熟型玉米品種，生育期較短，適合在北方地區種植，具有豐產、穩產、耐高溫干旱、抗倒伏、脫水速度快等優點，在市場上深受歡迎。研究利用行業標準中規定的40對SSR引物進行品種真實性鑒定，從中篩選出可用于鑒定“玉農76”種子純度的幾對少數核心引物，建立“玉農76”及其親本的DNA指紋圖譜，旨在為加強“玉農76”品種的產權保護和種子品質監測提供技術保障。在實際鑒定中優先使用核心引物進行檢測，在滿足種子鑒定工作簡便、快速、準確、高效的同時，能減少工作量、降低試驗成本。

1 材料與方法

1.1 供試材料

“玉農76”是以優良自交系牟994和牟389組配選育出的優質、高產、早熟雜交種，紫色葉鞘，紫色花藥，株型半緊湊，株高291.5 cm，穗位高103 cm，長筒型果穗，黃色籽粒。

母本牟994紫色葉鞘，淺紫色花藥，株型緊湊，株高261.5 cm，穗位高78.2 cm，筒型果穗，黃色籽粒。

父本牟389青色葉鞘，黃色花藥，株型緊湊，株高275.6 cm，穗位高81.2 cm，錐型果穗，黃色籽粒。

試驗品種為“玉農76”標準品、親本自交系牟994、牟389及2個待檢測品種。以上材料均由河南農業職業學院現代種業學院玉米育種課題組提供，玉米均種植于河南省農業高新科技園。

1.2 DNA提取及質量檢測

研究采用改良CTAB法［6］提取玉米種子DNA，將種子充分研磨成粉，取0.2 g左右提取DNA，在室溫下干燥后加入100 μL TE緩沖液，充分溶解后備用。使用超微量紫外可見分光光度計對DNA質量進行檢測。

1.3 SSR引物合成

試驗所用40對引物名稱及序列信息見《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY/T 1432—2014），由北京擎科生物科技有限公司合成。這些引物均勻分布在玉米10條染色體上，擴增帶型穩定且多態性較高。

1.4 PCR擴增

試驗使用的PCR擴增體系包含DNA 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、10×Buffer 1 μL、MgCl2 1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、Taq酶0.5 μL，加ddH2O至10 μL。PCR擴增反應程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。在10 μL PCR產物中加入2 μL 6×加樣緩沖液，混勻后在PCR儀運行變性程序，95 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。

PCR產物變性后，在4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。使用80 W恒功率電泳儀進行電泳，當凝膠中指示條帶到達膠板中部時，停止電泳，將凝膠置于10%冰醋酸固定液中輕輕晃動3 min，ddH2O漂洗10 s；再將凝膠置于染色液（0.2% AgNO3）中染色5 min，ddH2O漂洗10 s；最后將凝膠置于顯影液（3% NaOH、0.5%甲醛）中，輕輕晃動至條帶紋路顯現，置于10%冰醋酸固定。在燈箱上讀帶、拍照并分析。

1.5 結果判定

結果判定方法按照行業標準《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY/T1432—2014）進行。當樣品間差異位點數大于2時，為不同品種；當差異位點數為1時，為近似品種；當差異位點數為0時，為極近似或相同品種。

1.6 田間性狀調查

在玉米苗期調查葉鞘顏色，開花期調查花藥顏色、潁殼顏色，收獲前調查株高、穗位、穗長、穗行數、穗型、百粒質量、粒型、粒色。

1.7 數字指紋圖譜構建

在SSR標記檢測結果中讀帶時，描述條帶的相對位置，在相同遷移率位置上，條帶缺失的記為0，條帶清晰的記為1，根據分子量由小到大的順序進行讀帶。然后將每對引物的二進制數據轉換成十進制數據，不具有多態性的數據不再統計，以位數最多的十進制數據為標準，將位數不夠的數據在數字前加上0，補成相同的數字位數，用該十進制數據代表SSR標記擴增結果，按照行業標準給出的引物順序，將這些十進制數據組合成數字串，該數字串作為“玉農76”及其親本牟994和牟389的數字指紋［7］。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

經超微量紫外可見分光光度計檢測，測試樣品“玉農76”、牟994、牟389、待測樣品1、待測樣品2的OD260與OD280的比值為1.7～1.9，OD260與OD230的比值大于2.0，DNA質量濃度為100～200 μg/μL，DNA質量較好，可用于后續試驗鑒定。

2.2 “玉農76”品種真實性鑒定

利用行業標準中的40對SSR核心引物對“玉農76”標準品和2個待測樣品進行鑒定，發現待測樣品1與“玉農76”之間不存在SSR差異位點，推測待測樣品1與“玉農76”為同一品種；待測樣品2與“玉農76”之間存在14個差異位點，差異位點數大于2（見表1），說明待測樣品2與“玉農76”不是同一品種。

2.3 “玉農76”農藝性狀鑒定

分別在玉米苗期、開花期、收獲前對“玉農76”、待測樣品1、待測樣品2進行農藝性狀調查，結果見表2。待測樣品1與“玉農76”標準品的農藝性狀基本一致。結合SSR標記檢測結果，待測樣品1為“玉農76”。待測樣品2的籽粒性狀與“玉農76”相似，都是半馬齒型的黃色籽粒，百粒質量區別不大，穗型相同，但是株高、穗位、葉鞘顏色、潁殼顏色、花藥顏色等植株性狀與“玉農76”差異明顯。結合SSR標記結果，再次證明待測樣品2不是“玉農76”。

2.4 “玉農76”種子純度鑒定特異引物篩選

利用行業標準中給出的40對SSR核心引物，在“玉農76”及其親本牟994、牟389中進行擴增，發現共有26對SSR標記能夠在牟994和牟389間擴增出多態性條帶，其中有18個顯性標記、8個共顯性標記。為了進一步明確可用于“玉農76”種子純度鑒定的SSR核心標記，對這8個共顯性標記再次進行PCR擴增，發現SSR引物phi053k2、bnlg2291k4、umc1125y3、bnlg1520k1能夠在自交系牟994和牟389間擴增出清晰穩定的多態性條帶，并且在“玉農76”中擴增出雙親雜合性帶型（見圖1）。因此，推測SSR核心引物phi053k2、bnlg2291k4、umc1125y3、bnlg1520k1可用于鑒定“玉農76”的種子純度。

2.5 “玉農76”及其親本數字指紋圖譜構建

為了使DNA指紋更加便于識別，將擴增條帶清晰的35對核心引物在“玉農76”及其親本中的擴增結果轉換成由0和1組成的計算機語言（見表3），再將具有多態性的結果進行轉換，將二進制數據轉換成十進制數據，將所有的十進制數據串聯起來，形成數字串，用該數字串構建“玉農76”及其親本的數字指紋圖譜。例如，bnlg1940k7在母本牟994中擴增結果為1110，將二進制數轉換為十進制數為16，數字位數由4位變成2位；bnlg439w1在母本中擴增結果為0100，轉換為十進制數為4，補足至2位數后為04，數字位數由4位變成2位；由這2個標記組成的牟994的二進制數字指紋為11100100，十進制數字指紋為1604。根據表3的結果，共有26對SSR引物可在自交系牟994、牟389和雜交種“玉農76”中擴增出多態性片段。因此，將標記數目擴大到26個，則母本自交系牟994、父本自交系牟389及雜交種“玉農76”的數字指紋圖譜如圖2所示。

3 討論

玉米作為我國的主要糧食、飼料和能源作物，種植面積廣、產量高，受到育種專家的廣泛關注。近年來，隨著分子育種技術、傳統育種技術的結合與發展，以及國家對玉米品種審定程序的簡化，新品種數量呈現井噴式增加［8］。種子品質直接影響我國的糧食安全和農民的切身利益，品種真實性與種子純度是衡量種子品質的重要指標，是保證品種充分發揮優良遺傳特性的前提。因此，在種子生產銷售環節進行品種真實性鑒定和種子純度鑒定是不可缺少的環節。鑒定種子真實性和種子純度，可以有效降低假種子、劣種子等不合格種子流入市場的可能性，減少農民在農業生產過程中的經濟損失。

傳統的鑒定方法一般依賴田間種植和人工觀察，但這些方法鑒定周期長、投入成本高，結果易受環境因素和人為因素的影響。分子標記檢測技術能夠直接鑒定不同品種、材料在DNA水平上的差異，且更加快速、高效、簡便。其中，SSR分子標記能夠鑒定共顯性遺傳，具有豐富的多態性、較好的重復性，是目前較為理想、應用廣泛的鑒定品種真實性和種子純度的方法［9］。

張振良等［10］利用行業標準《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY/T 1432—2014）中公布的20對SSR核心引物，對5個玉米疑似雜交種進行品種真實性鑒定，鑒定結果與田間鑒定結果一致；車卓等［6］利用行業標準中的20對SSR核心引物，對玉米雜交種“吉祥1號”進行種子純度鑒定，篩選出2對SSR引物，可明顯區分親本和雜交種，鑒定結果準確；盧媛等［2］利用行業標準中的40對SSR核心引物，對“滬玉糯3號”玉米品種真實性和種子純度進行鑒定，篩選出6對SSR引物用于品種真實性鑒定，6對SSR引物用于種子純度鑒定。以上研究表明，行業標準中的40對SSR引物可以對玉米品種真實性和種子純度進行準確鑒定。

研究利用行業標準《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY/T 1432—2014）公布的40對SSR核心引物對2個玉米疑似品種進行品種真實性鑒定。SSR引物umc2007y4、bnlg1940k7、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、bnlg240k1、phi080k15、umc1432y6、bnlg1520k1、umc1999y3、umc2160k3、bnlg2235y5、umc2084w2、umc2163w3能夠在待測樣品2和“玉農76”標準品間擴增出條帶清晰、穩定性好的多態性條帶，說明這14個SSR位點在“玉農76”中的多態性和特異性較好，并且鑒定結果與田間鑒定結果一致，進一步說明這14個標記可用于鑒定“玉農76”品種的真實性。此外，標記umc2007y4、bnlg1940k7、bnlg1520k1位于2號染色體，umc1999y3位于4號染色體，umc1705w1、bnlg2305k4位于5號染色體，bnlg1702k1位于6號染色體，umc2160k3位于7號染色體，bnlg240k1、phi080k15、bnlg2235y5位于8號染色體，umc2084w2位于9號染色體，umc1432y6、umc2163w3位于10號染色體。在今后的“玉農76”品種真實性鑒定中，可優先選擇分布在不同染色體上的不連鎖的核心引物，以減少工作量、降低試驗成本。

在種子純度鑒定過程中，有研究人員認為，通過1對特異引物即可鑒定［11］。也有研究人員認為，僅用1對引物進行鑒定的結果準確度較低，需要3～5對引物才可得到準確的鑒定結果［12］。研究從行業標準《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》（NY/T 1432—2014）中公布的40對多態性較高的SSR引物中，篩選出4對能夠在“玉農76”中擴增出清晰穩定的雙親互補性條帶的共顯性標記引物phi053k2、bnlg2291k4、umc1125y3、bnlg1520k1，可滿足對“玉農76”種子純度鑒定的需要。

玉米SSR指紋圖譜的構建為品種真實性和種子純度鑒定提供了分子檢測的方法，為品種DUS測試和品種保護提供了重要依據。早期的指紋圖譜構建多使用電泳圖譜結果，目前較多采用01二進制或二進制轉化成十進制來構建數字指紋圖譜，更加方便觀察、記錄、比較和分析［7，13］。研究選用了26對具有多態性的SSR核心引物，將擴增得到的01二進制數據轉換成十進制數據，同時構建了“玉農76”及其親本自交系牟994和牟389的數字指紋圖譜，為“玉農76”雜交種的真實性鑒定和純度鑒定提供了方法和數據支撐。

4 結論

研究利用行業標準《玉米品種鑒定技術規程" SSR標記法》（NY/T 1432—2014）公布的40對核心引物，對“玉農76”的品種真實性和種子純度進行鑒定，篩選出14對可用于“玉農76”品種真實性鑒定的引物、4對可用于“玉農76”種子純度鑒定的引物，其中SSR標記bnlg1520k1可同時用于品種真實性和種子純度的鑒定，可優先使用；同時，構建了DNA數字指紋圖譜，可在短時間內對“玉農76”進行品種真實性和種子純度鑒定，在滿足種子鑒定快速、簡便、準確、高效要求的同時，降低了檢測成本，為“玉農76”品種保護及種子品質監管提供了理論依據與技術支撐。

參考文獻：

［1］石德權，郭慶法，汪黎明，等.我國玉米品質現狀、問題及發展優質食用玉米對策［J］.玉米科學，2001（2）：3-7.

［2］盧媛，韓晴，王義發，等.糯玉米品種‘滬玉糯3號’種子真實性與純度鑒定的SSR核心引物篩選［J］.上海農業學報，2018，34（3）：45-49.

［3］ 孫衛永，尹航，郝德榮.玉米雜交種生產中存在的主要問題及關鍵措施［J］.中國種業，2015（5）：17-20.

［4］高珊，李成軍，盧凌霄，等.淺談玉米品種檢驗的方法［J］.種子科技，2021，39（19）：125-126.

［5］林顯鳳，羅友明，尚玥，等.玉米品種真實性SSR分子檢測體系優化［J］.安徽農業科學，2023，51（6）：93-99.

［6］車卓，常宏，張偉.利用SSR分子標記鑒定玉米雜交種‘吉祥1號’純度［J］.中國農學通報，2016，32（18）：28-32.

［7］潘兆娥，王希文，孫君靈，等.中棉所48的SSR數字指紋圖譜的構建［J］.中國農學通報，2010，26（7）：31-35.

［8］史慶玲，閆瑾，肖琳琳.河南省玉米品種真實性鑒定的探索與思考［J］.河南農業，2019（25）：57-58.

［9］王若丁，鐘鵬，王建麗，等.SSR分子標記在玉米研究中的應用［J］.飼料博覽，2024（1）：76-80.

［10］張振良，郝德榮，陳國清，等.SSR標記在糯玉米品種鑒定上的應用［J］.江蘇農業科學，2016，44（6）：104-106.

［11］ YASHITOLA J， THIRUMURUGAN T， SUNDARAM M R， et al. Assessment of purity of rice hybrids using microsatellite and STS markers［J］.Crop Science，2002，42（4）：1369-1373.

［12］譚君，楊俊品.玉米種子DNA快速提取及雜交種純度的快速鑒定［J］.分子植物育種，2009，7（4）：811-816.

［13］戴寶生，南策雄，陳曉偉，等.岡雜棉8號SSR數字指紋圖譜的構建［J］.湖北農業科學，2015，54（9）：2057-2060.

Screening of SSR Core Primers for Identification of Seed Authenticity and Purity in High-Yield Maize Variety \"Yunong 76\"

WANG Yangming WANG Xiaoqiong LIU Songtao ZHANG Yafei ZHAO Wei LI Xuehui

ZHENG Beibei SANG Ziqian

Henan Vocational College of Agriculture， Modern Seed Industry College， Zhengzhou 451450， China

Abstract： \"Yunong 76\" is a major maize hybrid variety， which was selected and cultivated by Henan Vocational College of Agriculture. To determine the authenticity of the high yield and quality maize variety \"Yunong 76\"， two test varieties were assessed by DNA fingerprinting using 40 pairs of maize SSR core primers. The result showed that 14 pairs of SSR primers （umc2007y4， bnlg1940k7， umc1705w1， bnlg2305k4， bnlg1702k1， bnlg240k1， phi080k15， umc1432y6， bnlg1520k1， umc1999y3 and umc2160k3） could amplify clear and stable bands between the two-test sample and \"Yunong 76\". Therefore， these 14 pairs of SSR primers were able for rapid authenticity assessment of \"Yunong 76\". Meanwhile， 4 pairs of co-dominant SSR primers （phi053k2， bnlg2291k4， umc1125y3， bnlg1520k1） could amplify clear and stable co-dominant bands between \"Yunong 76\" and its parent inbred lines. Thus， these 4 pairs of SSR primers can be used for purity identification of \"Yunong 76\". The SSR primer bnlg1520k1 can be used to identify both authenticity and purity of \"Yunong 76\". This study also constructed a decimal digital fingerprint maps of \"Yunong 76\"and its parents， providing the theoretical basis and technical support for strengthening the variety protection of \"Yunong 76\" and seed quality supervision.

Key words： \"Yunong 76\"; seed authenticity; seed purity; DNA fingerprint

基金項目：河南農業職業學院校級科研項目（HNACKY-2023-02）；河南省高等教育教學改革研究與實踐項目（2024SJGLX0896）；河南農業職業學院科研創新團隊（ZZ2405TD04）。

作者簡介：王曉瓊（1988—），女，碩士，講師，研究方向：分子生物學；劉松濤（1971—），男，碩士，教授，研究方向：作物遺傳育種；張亞菲（1987—），女，碩士，講師，研究方向：種子檢驗；趙威（1981—），男，碩士，講師，研究方向：種子檢驗；李學慧（1979—），女，碩士，副教授，研究方向：作物遺傳育種；鄭貝貝（1986—），女，碩士，講師，研究方向：作物栽培；桑子謙（1994—），男，碩士，助教，研究方向：生物信息學。

通信作者：王楊銘（1990—），女，博士，講師，研究方向：作物遺傳育種。