NaCl脅迫下嗜鹽蒙地曲霉Aspergillus montevidensis ZYD4的轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析

摘 要：蒙地曲霉ZYD4是一株極端嗜鹽真菌，可在飽和鹽水中長(zhǎng)期存活，是探究真核細(xì)胞嗜鹽機(jī)制的重要微生物資源.利用NaCl誘導(dǎo)培養(yǎng)蒙地曲霉ZYD4菌株1 h，對(duì)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的菌絲體進(jìn)行透射電鏡觀察以及轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序和非靶標(biāo)代謝組分析.結(jié)果表明，鹽脅迫下真菌細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體（Autolysosome， ASS）的數(shù)量明顯增加；與對(duì)照相比，鹽誘導(dǎo)組共檢測(cè)到1982個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析發(fā)現(xiàn)，DEGs富集到MAPK（Mitogen-activated Protein Kinase）信號(hào)通路、細(xì)胞周期、核糖體、內(nèi)吞作用和氨基糖等代謝途徑；代謝組分析顯示，差異代謝物有134個(gè)，主要包括谷氨酸、天冬氨酸、海藻糖、半乳糖、檸檬酸和棕櫚酸等.本研究為探究嗜鹽真菌耐鹽脅迫及資源利用奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：嗜鹽真菌； 轉(zhuǎn)錄組； 代謝組

中圖分類號(hào)：TS201.3； Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Transcriptome and metabolome analysis of Aspergillus montevidensis

ZYD4 under NaCl stress

ZHANG Li-xu， LIU Kai-hui^*， DING Xiao-wei， LI Jian-miao， MA Xue-ni

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：Aspergillus montevidensis ZYD4 is an extremely halophilic fungi that can survive in saturated salt water for a long time and is an important microbial resource for exploring the salt-tolerant mechanisms of eukaryotic cells.The Aspergillus montevidensis ZYD4 strain was induced and cultured with NaCl for 1 h，and the induced and uninduced mycelia were observed by transmission electron microscopy.Transcriptome and non-target metabolome of mycelia were also conducted under the same treatment.The results showed that the number of autolysosomes （Autolysosome，ASS） in fungi cells increased significantly under salt stress.Compared with the negative control，a total of 1982 differentially expressed genes （Differentially Expressed Genes，DEGs） were identified in the salt-induced group; KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） analysis found that DEGs were enriched in the MAPK （Mitogen-activated Protein Kinase） signaling pathway，cell cycle，ribosomes，endocytosis，amino sugar and other metabolic pathways.Metabolome analysis revealed that there were 134 differential metabolites，mainly including glutamic acid，aspartic acid，trehalose，galactose，citric acid and palmitic acid，etc.This study laid a foundation for exploring salt-tolerance mechanism and resource utilization of halophilic fungi.

Key words：halophilic fungi; transcriptome; metabolome

0 引言

由于氣候變化和人類對(duì)水土資源的不合理利用，導(dǎo)致大量土壤鹽堿化及生態(tài)惡化.土壤鹽堿化嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致植株大量死亡^[1].嗜鹽真菌廣泛分布在鹽沼、鹽湖、鹽堿地和海水等高鹽堿環(huán)境中^[2]，這類微生物蘊(yùn)藏著特殊的耐鹽遺傳信息、生理特性和代謝調(diào)控機(jī)制.因此，深入探究嗜鹽真菌耐鹽機(jī)制對(duì)于認(rèn)識(shí)真核生物的演化，細(xì)胞同高鹽環(huán)境互作規(guī)律及應(yīng)用具有重要的理論意義^[3，4].

由于長(zhǎng)期的滲透適應(yīng)，嗜鹽真菌形成了多種策略來應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境，如細(xì)胞壁的修飾、離子平衡、相容溶質(zhì)積累等^[5-7].例如，在高鹽環(huán)境中，Wallemia ichthyophaga會(huì)形成致密的多細(xì)胞團(tuán)塊，增厚細(xì)胞壁^[8]，Hortaea werneckii會(huì)形成黑色素化的細(xì)胞壁^[9]，Aspergillus sydowii會(huì)重塑細(xì)胞壁并增加其厚度，改變膜組成^[10].此外，在高鹽脅迫下，微生物會(huì)排除胞內(nèi)多余的Na⁺，進(jìn)而維持細(xì)胞滲透壓平衡.Wallemia sebi和Wallemia ichthyophaga通過增加P型H⁺ ATP酶和Na⁺/Pi共轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，避免胞內(nèi)大量積累Na^{+ [11，12]}.最新的研究發(fā)現(xiàn)，嗜鹽蒙地曲霉ZYD4在高鹽環(huán)境中特異積累甘油、可溶性糖、多種多元醇及多種氨基酸.

本研究以嗜鹽蒙地曲霉ZYD4為供試菌株，利用RNA-Seq和GC-TOF-MS技術(shù)，對(duì)嗜鹽蒙地曲霉ZYD4在鹽脅迫下的差異基因和代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，篩選與鹽脅迫相關(guān)的功能基因和差異代謝物，探究嗜鹽蒙地曲霉ZYD4對(duì)高鹽脅迫的滲透適應(yīng)規(guī)律，為嗜鹽真菌耐鹽機(jī)制研究及耐鹽基因挖掘奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜鹽蒙地曲霉（A. montevidensis）ZYD4分離自陜北花馬鹽湖，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC3.15762.

1.2 培養(yǎng)及菌株誘導(dǎo)

活化菌株接種至YPD液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨20.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.5）中，28 ℃靜置培養(yǎng)3 d，置于28 ℃、120 rpm搖床中再培養(yǎng)7 d.向上述液體培養(yǎng)基中加入NaCl，使其終濃度達(dá)到1.5 mol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h（以不加NaCl為對(duì)照組），收集菌絲體，用PBS緩沖液沖洗2～3次，液氮速凍后存放在-80℃冰箱中，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和代謝組分析，每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)（未經(jīng)誘導(dǎo)樣品命名為CK（代謝組中命名為AM.C），加NaCl誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h的樣品命名為AM）.

1.3 鹽脅迫對(duì)蒙地曲霉ZYD4顯微形態(tài)的影響

取少量菌絲體于EP管中，加入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h，低速離心至管底，用1%瓊脂糖將其包裹，0.1 M PBS緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min.用1%的鋨酸（0.1 M PBS pH 7.4配制）室溫（20 ℃）固定2 h.0.1 M磷酸緩沖液PBS（pH 7.4）漂洗3次，依次加入50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水，再用100%丙酮脫水兩次，每次15 min.經(jīng)滲透包埋后，切成60～80 nm超薄切片.用鈾鉛雙染色，干燥后進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察.

1.4 轉(zhuǎn)錄組分析

1.4.1 RNA的提取和文庫(kù)的構(gòu)建

對(duì)液氮速凍保存的菌絲體樣品提取總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)獲得的RNA，同時(shí)使用Qubit 3.0（Thermo Fisher Scientific），Nanodrop One（Thermo Fisher Scientific）檢測(cè)RNA濃度和純度，使用Agilent 4200系統(tǒng)準(zhǔn)確檢測(cè)RNA完整性（Agilent Technologies， Waldbron）.以mRNA 為模板合成cDNA，使用AMPure XP beads 試劑盒進(jìn)行純化、末端修復(fù)和片段大小選擇，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增與純化，獲得測(cè)序文庫(kù).轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序委托商業(yè)公司完成.

1.4.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

測(cè)序獲得每組樣品的原始測(cè)序序列（Raw Reads）.采用fastp^[13]軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的序列，以保證后續(xù)結(jié)果分析的準(zhǔn)確性.隨后，使用Bowtie2^[14]軟件將質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的核糖體序列進(jìn)行比對(duì)，得到過濾后的數(shù)據(jù).使用HISAT2^[15]將去除核糖體后的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，獲得BAM格式的結(jié)果文件，利用RSeQC^[16]軟件判斷本次測(cè)序質(zhì)量.

1.4.3 差異表達(dá)量和差異表達(dá)基因分析

采用RSEM^[17]計(jì)算轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)量，通過edgeR^[18]軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行差異基因（DEGs）分析.差異表達(dá)基因的篩選條件：FDR ≤ 0.05和|log2 FC| ≥ 1，篩選出可能受鹽脅迫調(diào)控的基因.

1.4.4 差異表達(dá)基因GO功能注釋、KEGG富集分析

為了分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，闡明鹽脅迫下菌株蒙地曲霉ZYD4的分子調(diào)控機(jī)制.將數(shù)據(jù)與GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類分析，并進(jìn)行KEGG富集分析.

1.5 代謝組分析

1.5.1 樣品處理

取液氮速凍后的菌絲體樣品50±1 mg于2 mL的EP管中，加入1 000 μL的提取液（氯仿∶甲醇=1∶3），含10 μL核糖醇，旋渦震蕩30 s；加入鋼珠，35 Hz研磨4 min，超聲5 min（冰水浴），重復(fù)3次；12 000 rpm，4 ℃離心15 min；移取200 μL上清液于1.5 mL EP管中，將每個(gè)樣各取50 μL組成QC樣本；將提取物在真空濃縮器中進(jìn)行干燥；干燥后的提取物中加入40 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶中，濃度為20 mg/mL），混合均勻，80 ℃烘箱中孵育30 min；向樣品中加入60 μL BSTFA（含1%TMCS，v/v），混合均勻，75 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向樣本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；隨機(jī)上機(jī)檢測(cè)^[19]，每個(gè)樣品重復(fù)4次.

1.5.2 GC-TOF-MS數(shù)據(jù)處理

使用ChromaTOF^[20]軟件（V 4.3x，LECO）對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析.對(duì)物質(zhì)定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫(kù)，包括質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配.最后，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD gt; 30%的峰去除^[21].采用主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA）^[22]相結(jié)合的方法分析差異代謝物，以P lt; 0.05，VIP gt; 1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物.最后使用KEGG、PubChem等數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異代謝物的代謝途徑.

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽脅迫下的顯微形態(tài)觀察

與對(duì)照組相比，1.5 M NaCl誘導(dǎo)1 h下的菌絲細(xì)胞整體損傷相對(duì)嚴(yán)重，呈重度水腫，胞內(nèi)基質(zhì)稀疏、溶解，大多細(xì)胞器腫脹、空泡變性.細(xì)胞壁（CW）薄厚不均勻.細(xì)胞壁外側(cè)黏液層（ML）稀疏、消失.細(xì)胞膜出現(xiàn)破損、溶解現(xiàn)象.此外，自噬溶酶體（ASS）明顯增加（圖1）.

2.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 差異表達(dá)基因分析

以FDR ≤ 0.05，且|log2FC| ≥ 1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因.如圖2所示，鹽誘導(dǎo)組和對(duì)照組相比共有1 982個(gè)DEGs，其中包含997個(gè)上調(diào)基因和985個(gè)下調(diào)基因.

2.2.2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG富集分析

差異基因的GO功能注釋如圖3所示，差異基因主要富集到生物學(xué)過程（Biological Process）中，其中大量基因被注釋到細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生物調(diào)節(jié)和應(yīng)激響應(yīng)等過程中；在細(xì)胞組分（Cellular Component）中，差異基因主要集中在細(xì)胞部分、細(xì)胞，其次是細(xì)胞器、細(xì)胞器部分和含蛋白質(zhì)復(fù)合物；參與分子功能（Molecular Function）的差異表達(dá)基因主要富集在催化活性和結(jié)合過程中.KEGG通路富集分析（圖4），DEGs主要富集在MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞周期、核糖體、內(nèi)吞作用、氨基糖和核苷酸糖代謝途徑.

2.2.3 差異表達(dá)基因的功能分析

糖代謝功能基因?qū)}脅迫的響應(yīng)：共有87個(gè)DEGs參與了碳水化合物代謝.由表1可知，在糖酵解/糖異生途徑中，2個(gè)編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因分別上調(diào)表達(dá)1.59、2.34倍，該酶參與磷酸二羥丙酮和甘油醛-3-磷酸相互轉(zhuǎn)化，同時(shí)，編碼果糖二磷酸縮醛酶的基因上調(diào)表達(dá)2.17倍，而編碼葡萄糖磷酸變位酶的基因的表達(dá)被下調(diào)1.46倍；在三羧酸循環(huán)中，編碼琥珀酸脫氫酶、檸檬酸合成酶的基因分別上調(diào)表達(dá)1.61、1.74倍，編碼琥珀酰輔酶A合成酶的3個(gè)基因上調(diào)表達(dá)1.25～2.02倍，編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶的基因下調(diào)1.56倍，該酶可催化草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸；在磷酸戊糖途徑中，編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因上調(diào)表達(dá)2.37倍，編碼果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶基因分別上調(diào)3.06、2.78倍，編碼轉(zhuǎn)醛縮酶的基因分別上調(diào)了1.75、4.04倍.此外，編碼葡糖淀粉酶的兩個(gè)基因分別上調(diào)了1.15、1.75倍，編碼海藻糖-6-磷酸合酶的基因上調(diào)了4.95倍.

氨基酸代謝功能基因?qū)}脅迫的響應(yīng)：共有51個(gè)DEGs參與了氨基酸代謝.由表1可知，在精氨酸的生物合成和丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸的代謝途徑中，編碼7種酶（谷氨酸脫氫酶、乙酰基鳥氨酸脫乙酰酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺-果糖-6磷酸轉(zhuǎn)氨酶和1-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶）基因的表達(dá)被下調(diào).在苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的代謝途徑中，編碼色氨酸合成酶β鏈的基因下調(diào)表達(dá)3.2倍，編碼預(yù)苯酸脫氫酶（NADP⁺）的基因上調(diào)表達(dá)1.37倍，催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴醌，促進(jìn)黑色素的形成.Hortaea werneckii在最適鹽濃度（0.86 M NaCl）下也會(huì)產(chǎn)生黑色素.此外，編碼蘇氨酸醛縮酶的基因表達(dá)上調(diào)了2.0倍，該酶催化甘氨酸分別與L-異丙氨酸和蘇氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化.值得注意的是，參與氰基氨基酸代謝的氰化物水合酶編碼基因顯著上調(diào)1.8倍，促使胞內(nèi)氰化物的分解.本研究中發(fā)現(xiàn)編碼色氨酸合酶的基因顯著下調(diào)，編碼D-3-磷酸甘油脫氫酶的基因顯著上調(diào)，可能促使了絲氨酸的積累，這與嗜鹽古生菌在高鹽環(huán)境中無絲氨酸的積累的研究報(bào)道不同^[23].

脂代謝功能基因?qū)}脅迫的響應(yīng)：共有27個(gè)DEGs在脂代謝中被差異表達(dá).由表1可知，編碼磷脂酶C、甘油-3-磷酸脫氫酶、溶血磷脂酶、甘油激酶和磷脂酶D1/D2的5個(gè)基因下調(diào)表達(dá)1.15～2.86倍，積累了甘油和卵磷脂.而編碼磷脂酰絲氨酸脫羧酶的基因上調(diào)了1.99倍.由此表明，蒙地曲霉ZYD4會(huì)通過積累脂類物質(zhì)（甘油等）來適應(yīng)鹽脅迫.

2.3 鹽脅迫下代謝組分析

2.3.1 主成分分析與正交偏最小二乘法判別分析

將鹽誘導(dǎo)組和對(duì)照組代謝物進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別（OPLS-DA）分析.通過PCA分析（圖5），4個(gè)組內(nèi)樣本聚集效果良好，組間差異明顯，可以用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)與分析.

通過OPLS-DA分析，得到兩組樣品的得分散點(diǎn)圖（圖6），兩組樣品間具有明顯的空間區(qū)分，且各組內(nèi)聚集性良好，說明鹽誘導(dǎo)組和對(duì)照組之間代謝物差異顯著，而且當(dāng)前模型對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本可以進(jìn)行有效區(qū)分.

2.3.2 差異代謝物的篩選與KEGG代謝通路富集分析

以P lt; 0.05，VIP gt; 1為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到134個(gè)顯著差異的代謝產(chǎn)物（圖7），其中已知代謝物75個(gè)（表2）.在鹽誘導(dǎo)樣品中，69個(gè)代謝物顯著上調(diào)，6個(gè)顯著下調(diào).差異代謝物主要集中在44個(gè)KEGG代謝途徑中，如主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨酰基-tRNA生物合成、丁酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、半乳糖代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和谷胱甘肽代謝.

特異積累糖類和有機(jī)酸響應(yīng)鹽脅迫：在顯著差異的代謝物中，總體上糖類和有機(jī)酸的含量在鹽誘導(dǎo)組增加.由表2可知，參與糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的差異代謝物含量均增加，如核糖、葡萄糖酸內(nèi)酯和葡萄糖酸參與了磷酸戊糖途徑，上調(diào)倍數(shù)分別為1.58、1.40和4.03，其中檸檬酸含量變化最大，上調(diào)5.18倍.參與半乳糖代謝的物質(zhì)含量也顯著積累，其中肌醇和N-乙酰基-D-半乳糖胺含量分別上調(diào)7.29倍和7.64倍，其次是山梨糖醇和半乳糖，上調(diào)2.67和1.35倍.此外，還有海藻糖、葡萄糖庚酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和N-氨基葡萄糖等糖類及其衍生物的含量顯著升高，其中海藻糖的含量上調(diào)5.05倍.綜上，蒙地曲霉ZYD4除了積累海藻糖和肌醇等促進(jìn)真菌在高鹽環(huán)境調(diào)節(jié)滲透平衡的物質(zhì)外，還會(huì)在胞內(nèi)積累其它可溶性糖及衍生物和有機(jī)酸.

特異積累氨基酸響應(yīng)鹽脅迫：在鹽誘導(dǎo)下，其代謝物中氨基酸的含量發(fā)生了顯著變化.KEGG富集分析顯示，在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中7個(gè)顯著差異代謝物.由表2可知，N-乙酰基-L-天冬氨酸含量的增加最大，為11.73倍，谷氨酸和天冬氨酸，分別增加3.61和2.6倍數(shù).此外，氨甲酰天冬氨酸和高絲氨酸分別為8.05和8.01，酪氨酸和N-乙酰基-鳥氨酸，增長(zhǎng)倍數(shù)分別為5.11和5.51.結(jié)果表明，真菌可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)氨基酸水平來適應(yīng)高滲環(huán)境.

由表2可知，在脂肪酸和酯類物質(zhì)中，6種代謝物（2，6-二氨基庚二酸、亞油酸甲酯、棕櫚油酸、棕櫚酸、硬脂酸和葡萄糖酸內(nèi)酯）顯著上調(diào)了1.4～10.44倍，而二十四烷酸的含量下調(diào)了2.92倍.因此，這些代謝物的積累可能是嗜鹽真菌適應(yīng)鹽脅迫的一個(gè)重要機(jī)制.

3 結(jié)論

在高鹽環(huán)境中，嗜鹽蒙地曲霉ZYD4通過增加胞內(nèi)自噬溶酶體（ASS）含量來響應(yīng)鹽脅迫.轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析顯示，該真菌通過調(diào)控氨基酸、可溶性糖、有機(jī)酸和飽和脂肪酸等相關(guān)基因的差異表達(dá)，積累相關(guān)代謝產(chǎn)物（谷氨酸、天冬氨酸、赤蘚糖、海藻糖、半乳糖、琥珀酸、檸檬酸、棕櫚酸、硬脂酸等）來減少NaCl的毒害作用，維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝.本研究通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析探究了蒙地曲霉ZYD4在鹽脅迫下的滲透適應(yīng)規(guī)律，為嗜鹽真菌耐鹽機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，挖掘耐鹽基因，對(duì)于鹽堿環(huán)境修復(fù)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】