鵝不食草水提液銀納米粒子的制備及其抑菌活性

摘 要：采用生物還原法，將天然草本植物鵝不食草的水提液作為還原劑與穩定劑，還原硝酸銀制備銀納米粒子（AgNPs），通過單因素實驗對反應過程中各項參數進行優化，確立最優制備條件為：鵝不食草水提液的pH=8，硝酸銀濃度為6 mM，兩者的物料比為1∶5（v/v），靜置反應時間為12 h.在最優條件下綠色合成的AgNPs呈近球形，具有面心立方晶體結構，平均水合粒徑為52.07±0.86 nm，電位值為-14.8 mV，多分散指數為0.25±0.01，粒子分散較為均勻.通過藥敏實驗進一步研究AgNPs的抑菌活性，結果表明：利用鵝不食草水提液通過生物還原法綠色制備的AgNPs對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現出良好的抑菌活性；AgNPs可在較低濃度下對兩種菌產生不同程度的抑制與殺滅作用，具有一定的廣譜抗菌性.因此，所制備的鵝不食草水提液銀納米粒子有望作為一種新型納米抗菌劑，用于治療各類細菌感染類疾病.

關鍵詞：鵝不食草水提液； 納米銀； 生物還原法； 抑菌活性

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼： A

Green synthesis of silver nanoparticles using aqueous extract of

Centipeda minima and their antibacterial activity

LI Han^1，2， ZHANG Xin-yu^1，2， JIANG Wan-teng^1，2， WU Teng1

（1.School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China; 2.Xi′an Key Laboratory of Antiviral and Antimicrobial-Resistant Bacteria Therapeutics Research， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：In this study，silver nanoparticles （AgNPs） were synthesized by the bioreduction method，and their antibacterial activity was investigated.In particular，the phytochemicals from the aqueous extract of Centipeda minima were utilized as reductants and stabilizers for synthesizing silver nanoparticles.The reaction parameters were optimized utilizing single-factor experiments.The optimal preparation conditions were as follows：the pH of the Centipeda minima aqueous extract was adjusted to 8，the concentration of silver nitrate was set at 6 mM，and the volume ratio of the extract to silver nitrate was 1∶5 （v/v），with a reaction time of 12 hours under static conditions.Quasi-spherical shaped AgNPs were synthesized with a face-centered cubic crystal structure，an average hydrodynamic diameter of 52.07±0.86 nm，a zeta potential of -14.8 mV，and a polydispersity index of 0.25±0.01，indicating a homogeneous particle dispersion.The antimicrobial susceptibility testing revealed that the synthesized AgNPs exhibited significant bacteriostatic and bactericidal activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria.Specifically，the MIC and MBC values for AgNPs against Staphylococcus aureus were both 16 μg/mL，while for Escherichia coli，the MIC was 16 μg/mL and the MBC was 32 μg/mL.Therefore，AgNPs synthesized by the aqueous extract of Centipeda minima have the potential to serve as a novel nano-antimicrobial agent for the treatment of various bacterial infections.

Key words：Centipeda minima aqueous extract; silver nanoparticles; bioreduction; antibacterial activity

0 引言

細菌感染可能導致多種疾病，如肺炎、腦膜炎、血液感染和腹瀉等，對人類健康構成了嚴重的威脅.據相關研究顯示^[1]，細菌感染已成為全球第二大死因，與全球八分之一的死亡有關.隨著現代醫藥學的發展，一些抗生素如四環素、鏈霉素和磺胺類藥物，已被開發用于治療細菌感染類疾病.然而，抗生素的過度使用使得細菌耐藥性急劇上升，傳統的抗菌劑已經不能滿足抑制多種類型細菌的需要，并且由于病原體在對抗藥物分子的生物殺滅作用方面的進化，出現了多重耐藥菌株^[2].因此，研究開發一種療效好、適用性廣且毒性低的新型抗菌劑，對于遏制傳染病的傳播和擴散極為關鍵.

銀納米粒子（AgNPs）是指粒徑在納米級別（至少有一維尺寸在 1～100 nm 范圍之內^[3]）的金屬銀單質.由于AgNPs在量子尺寸效應^[4]、體積效應^[5]和界面效應^[6]等理化特性方面的突出表現，目前已被廣泛應用于材料科學、醫藥、食品加工、農業、環境和新能源等多種領域.近年來，AgNPs在生物學領域的應用逐漸占據主導地位，銀離子（Ag⁺）與蛋白質功能團的結合及變性、干擾生物大分子如酶和DNA，以及使DNA失去復制能力等作用機制決定了其抗菌活性.AgNPs熱穩定性好，且比表面積較大利于儲存Ag^+[7]，對細菌、真菌、病毒以及其它致病微生物都表現出較強的抗菌效果，并被證明是醫藥學中有效的健康添加劑.因此，開發一種節能高效、不使用有毒化學物質且在合成過程中保護自然資源的環境友好型銀納米粒子制備方法是十分有意義的^[8].

目前制備AgNPs的方法主要有物理法、化學法以及生物法^[9，10].物理法以大顆粒的銀單質為原料，通過機械粉碎、真空冷凝、激光燒蝕、高壓磁控濺射等手段制備AgNPs^[11]；化學法利用硝酸銀與甲醛、檸檬酸鈉等發生氧化還原反應后得到AgNPs^[12]；生物還原法又稱綠色合成法，主要利用微生物、植物提取物以及生物聚合物還原制備AgNPs，具有原料來源廣泛、成本低廉、反應條件溫和可控以及高效節能等優勢^[13]，能夠克服物理法耗能和成本較高以及化學試劑對環境的危害等缺點，因此受到了國內外科研人員的廣泛關注.在生物法制備納米銀過程中，植物法相較于微生物法容易改進，且沒有細胞培養生長等準備步驟，已逐漸成為最具價值的合成方法之一.

傳統中草藥的花、果實、種子、根、莖和葉中包含著大量的生物活性成分，可以在合成AgNPs的過程中發揮還原劑的功能，并且生物相容性較好，目前已有多項研究成功利用植物提取物合成AgNPs并將其應用于抗菌、藥物遞送、生物傳感器以及生物成像等多個領域^[14-18].鵝不食草為菊科石胡荽屬植物鵝不食草的干燥全草，別名三芽戟、通天竅、地芫荽、地胡椒等^[19].作為傳統中草藥，鵝不食草含有揮發油、酚類、萜類、黃酮及黃酮苷類、有機酸類等多種活性成分^[20]，這些生物活性分子在綠色合成過程中發揮雙重作用：一方面作為還原劑促進AgNPs的形成，另一方面則作為穩定劑吸附于納米粒子表面，有效防止粒子間的團聚.

本研究采用鵝不食草水提液作為還原劑與穩定劑、硝酸銀（AgNO3）作為銀源，通過生物法還原制備得到銀納米粒子；探討了鵝不食草水提液 pH值、提取液與AgNO3溶液的物料比、AgNO3溶液的濃度以及反應時間對還原反應、納米銀粒徑以及生成量的影響，確立了最優反應條件，并對銀納米粒子的抑菌活性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑與藥材

硝酸銀（AgNO3）（質量分數＞99%）：廣東光華科技股份有限公司；生理鹽水：上海泰坦科技股份有限公司；青鏈霉素混合液：北京索萊寶科技有限公司；MH（A）培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；CAMHB肉湯：青島海博生物技術有限公司；乙腈、乙酸銨：德國默克公司；氯化鈉、氫氧化鈉（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司.

實驗所用中藥材鵝不食草購于安徽亳州藥材市場，經鑒定為菊科石胡荽屬植物鵝不食草的干燥全草.供試菌種大腸桿菌 Escherichia coli（E.coli）、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus （S.aureus）均購于美國菌種保藏中心（ATCC），并經由陜西科技大學微生物實驗室進行形態學和生化學鑒定.

1.1.2 主要儀器與設備

微量移液槍（2～1 000 μL），大龍興創實驗儀器股份公司；渦旋混合儀（XW-80A），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H），上海躍進醫療器械有限公司；電子分析天平（JA2603B），上海天美天平儀器有限公司；多功能粉碎機（BJ-500A），德清拜杰電器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-4），金壇市江南儀器廠；臺式高速離心機（TG16-WS），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；數控超聲波清洗器（KH5200DE），昆山禾創超聲儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（JSM280G-24），寧波久興醫療器械有限公司；雙人雙面超凈工作臺（SW-CJ-2F），蘇州凈化設備有限公司；低溫高速離心機（Eppendorf 5430R），德國艾本德股份公司；質譜儀（AB Triple TOF 6600），上海愛博才思分析儀器貿易有限公司；超高壓液相色譜儀（Agilent 1290 Infinity LC），安捷倫科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5100），上海元析儀器有限公司；納米粒度表面電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；智能多功能X射線衍射儀（Smartlab SE），日本理學rigaku公司；傅里葉變換紅外光譜儀（VECTOR-22），德國布魯克Bruker公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 儲備液的配制

（1）鵝不食草水提液的配制

稱取干燥鵝不食草全草500 g，粉碎過篩，精確稱取5 g放入燒杯中，加入100 mL純凈水，室溫下超聲提取4 h，得到的溶液抽濾后再使用孔徑為0.45 μL濾膜過濾，制得鵝不食草水提液，備用.經測定鵝不食草水提液原液pH約為5.0.

（2）50 mM AgNO3 儲備液的配制

用電子天平準確稱取0.425 g AgNO3溶于一定體積蒸餾水，然后用蒸餾水定容至50 mL的棕色容量瓶中，配制成50 mM的硝酸銀儲備液，用錫箔紙包好，置于陰涼背光處保存備用.

1.2.2 UHPLC-Q-TOF MS 分析

（1）樣本提取方法

樣本（即鵝不食草水提液）在4 ℃ 環境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，v/v），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置 10 min，14 000 g 4 ℃離心20 min，取上清真空干燥，質譜分析時加入100 μL乙腈水溶液（乙腈∶水=1∶1，v/v）復溶，渦旋，14 000 g 4 ℃ 離心15 min，取上清液進樣分析.

（2）色譜條件

樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統（UHPLC）C-18 色譜柱進行分離；柱溫40℃；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；流動相組成A：水+25 mM乙酸銨+0.5%甲酸，B：甲醇；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% B；0.5～10 min，B從5% 線性變化至100% ；10.0～12.0 min，B維持在100% ；12.0～12.1 min，B從100% 線性變化至5%；12.1～16 min，B維持在5%；整個分析過程中樣品置于4℃ 自動進樣器中.為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續分析.樣本隊列中插入QC樣品，用于監測和評價系統的穩定性及實驗數據的可靠性.

（3）Q-TOF質譜條件

采用 AB Triple TOF 6600 質譜儀進行樣本一級、二級譜圖的采集.

HILIC色譜分離后的ESI源條件如下：Ion Source Gas1（Gas1）：60，Ion Source Gas2（Gas2）：60，Curtain gas（CUR）：30，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating（ISVF）±5 500 V（正負兩種模式）；TOF MS scan m/z range：60-1 000 Da，product ion scan m/z range：25-1 000 Da，TOF MS scan accumulation time 0.20 s/spectra，product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra；二級質譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正負兩種模式），Collision Energy：35±15 eV，IDA 設置如下：Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：10.

（4）數據分析

Wiff格式的原始數據經ProteoWizard轉換成.mzXML格式，然后采用MSDAIL軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積.將MSDAIL提取的數據與本地數據庫中代謝物的保留時間、分子質量（分子質量誤差在lt;10 ppm 內）、二級碎裂譜圖、碰撞能等信息進行匹配，對生物樣本中的代謝物進行結構鑒定.

1.2.3 AgNPs的制備

（1）鵝不食草水提液制備AgNPs

取1.0 mL鵝不食草水提液，加入稀釋一定倍數的AgNO3儲備溶液5.0 mL，靜置反應一定時間.將合成的AgNPs用臺式高速離心機在10 000 rpm的轉速下離心20 min，棄去上清液保留沉淀，隨后將沉淀重新分散于純水中，以10 000 r/min 轉速離心15 min，重復清洗3次.放入超聲波清洗機中設置功率500 w，室溫超聲10 min.放入-80 ℃ 冰箱中預冷6 h，接著用冷凍干燥機凍干48 h，得到的黑色粉末即為AgNPs粉末.

制備過程中使用的所有玻璃器皿都使用洗滌劑和王水溶液（HCl∶HNO3為3∶1）進行徹底清洗，以清除潛在的人工成核位點.

（2）制備AgNPs反應參數的優化

①鵝不食草水提液pH的優化

②水提液與AgNO3溶液的物料比的優化

③AgNO3溶液濃度的優化

④反應時間的優化

設置上述四組單因素實驗，在進行單一變量的優化時確保其他條件保持不變；制備條件篩選實驗中，鵝不食草水提液的pH使用0.1 M氫氧化鈉或硫酸進行調節.

1.2.4 AgNPs的表征

在最優制備條件下合成AgNPs膠體溶液后，通過與第 1.2.3 節所述相同的方法得到AgNPs粉末，進行后續的測試與表征.

使用紫外-可見分光光度計（Ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis）、納米粒度表面電位分析儀、智能多功能X射線晶體衍射儀（XRD）和傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對AgNPs的粒徑分布及穩定性能、晶型結構以及參與還原過程的化合物等進行表征.

1.2.5 AgNPs 的抑菌活性測定

（1）細菌的復蘇活化

取甘油凍存的菌株進行復蘇活化，使用一次性接種環挑取少許菌液在平板上進行劃線，于恒溫培養箱中倒置培養約18 h.挑取分離純化后的單菌落，于另一平板上繼續劃線進行二次轉接，培養相同時間后留待進行后續實驗.

（2）濾紙片擴散法

根據CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）標準^[21]，采用濾紙片擴散法初步測定AgNPs的抑菌效果.具體操作步驟為：

將AgNPs凍干粉用培養基進行梯度稀釋，依次吸取20 μL 不同濃度的AgNPs稀釋溶液分別滴于滅菌濾紙片上，在無菌條件下自然晾干或低溫烘干.取二次轉接后的平板，挑取一定量的菌落至生理鹽水中，渦旋均勻后通過測定吸光度（OD值）或通過比對麥氏比濁管調節至菌濃約為 1*10⁸ CFU/mL（OD約為0.1 或 MacFarland 0.5），用棉花棒充分蘸取菌液，均勻涂布于MH（A）瓊脂平板上，將制備的干燥濾紙片輕輕貼于培養基表面.將平板倒置于恒溫培養箱中，培養18 h 后觀察抑菌結果.

（3）最低抑菌濃度（MIC）的測定

根據 CLSI標準^[21]，采用微量肉湯稀釋法進一步測定AgNPs最低抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）.具體操作步驟為：

稱取一定量的AgNPs凍干粉末，溶于CAMHB肉湯培養基中，配置為1.024 mg/mL的母液待用.以CAMHB培養基為溶劑，將AgNPs母液先梯度稀釋為256 μg/mL，再進行二倍連續稀釋，得到濃度為1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL的AgNPs稀釋溶液，每個濃度各吸取50 μL分別加入96孔板中；

取二次轉接后的平板，挑取2-3個單菌落至生理鹽水中，調節至菌濃約為1*10⁸ CFU/mL，以1∶100（v/v）稀釋至肉湯培養基中，取50 μL菌懸液依次加入到含有不同濃度梯度AgNPs稀釋溶液的孔中.

將50 μL菌液分別加入50 μL青鏈霉素混合液和CAMHB培養基中作為陽性與生長對照，陰性對照組只含有100 μL CAMHB培養基.每孔總體積為100 μL，每個樣品重復3次.將96孔板放入恒溫培養箱中培養，24 h后肉眼觀察到不產生渾濁的孔所對應的最低濃度即為AgNPs對該菌的最低抑菌濃度.

（4）最小殺菌濃度（MBC）的測定

MBC實驗在MIC實驗基礎上進行，選取1/2 MIC、MIC、2*MIC、4*MIC等濃度孔，各吸取 100 μL 菌液涂布至MH（A）瓊脂板中，倒置培養24 h，根據培養基平板上生長的菌落個數判定AgNPs的MBC值.

2 結果與討論

2.1 UHPLC-Q-TOF MS 結果分析

以鵝不食草水提液為檢測對象，在第 1.2.2 節條件下進樣測定，正、負離子模式下QC樣品的總離子流圖如圖1所示，共鑒定到568個化合物，其中正離子模式（POS）362個，負離子模式（NEG）206個.將鑒定到的化合物根據其化學分類歸屬信息進行分類統計，其中包括165個脂類和類脂分子，70個苯丙素類和聚酮化合物，67個有機雜環化合物（吡啶、吡咯、呋喃等），58個苯類，54個有機酸類，34個有機含氧化合物（醇、酚、醚、醛、酮、酯等），17個生物堿類，15個核苷類，13個胺類，2個木脂素類，以及73個其他類.通過對比保留時間、化學式、質量數誤差等信息，篩選出其中含量較高的36個生物活性成分，如表1所示.

2.2 制備AgNPs反應參數的優化

2.2.1 鵝不食草水提液pH的優化

植物提取液在合成銀納米粒子時，其合成條件（如溫度、pH值、反應時間等）會顯著影響最終產物的物理特性，如粒子的大小和形狀.而這些物理特性的變化，又會影響銀納米粒子的光學性質，特別是表面等離子共振（SPR）特性^[22].故而在優化制備條件的過程中，可以使用紫外-可見分光光度計監測納米粒子的生成.有研究表明，AgNPs通常會在350～450 nm范圍內出現特征峰^[23]；一般來說，吸收峰強度越強，則表明其生成的銀納米粒子越多；吸收峰位置可能與AgNPs粒徑大小有關，藍移表明其粒徑減小，紅移反之；吸收峰的半峰寬越窄，表明粒子分散越均勻，越寬則表明粒子越聚集.

將鵝不食草水提液調至不同的pH值：5、6、7、8、9，從各溶液中分別取出1 mL，加入AgNO3溶液5 mL，靜置過夜.

實驗結果如圖2所示：當使用pH=5的溶液（即鵝不食草水提液原液）直接參與反應時，生成的AgNPs吸收峰強度較低，且在300～400 nm 之間出現一處較弱的吸收峰，可能標志著銀納米粒子形態的各向異性^[24]；當pH增加為6、7時，350 nm處的吸收峰消失，光譜中形成單個SPR帶，紫外吸收峰藍移，半峰寬逐漸變窄，峰強度緩慢增加，表明單一尺寸的近球形銀納米粒子的生成；當pH=8時，紫外吸收峰的強度達到最高，表明此時生成的納米銀最多；當pH繼續增加到9時，雖然紫外吸收峰藍移，但吸收峰強度迅速下降，半峰寬也呈現增大趨勢，表明生成的銀納米粒子的量大大減少，粒子分散性變差.

已有相關文獻報道^[25]，酸性環境不利于AgNPs的生成，可能是由于在pH較小的條件下，水提液中用于誘導Ag+還原的活性化合物的功能基團可用率較低.而在堿性條件下，水提液中具有的還原性多羥基化合物，容易失去1個H⁺從而使得整個分子帶負電荷，方便同Ag⁺相互作用，且更易失電子發生還原反應^[26].NaOH的加入也可以作為一種促進劑，在短時間內形成高濃度的晶核，從而提高成核速率.由于在給定時間內同時自發地形成更多的晶核，所得AgNPs的尺寸更小，分布也更均勻.從圖2中可以觀察到，隨著反應體系中堿性逐漸增強，生成的納米銀粒徑更小，反應速率也隨之加快，對AgNPs的制備過程產生了較為顯著的影響.

基于以上討論，綜合考慮納米粒子的產量、粒徑與分散性等因素，選定鵝不食草水提液的pH=8進行后續實驗.

2.2.2 水提液與AgNO3溶液的物料比的優化

以優化后的pH為標準，保持水提液1 mL不變，將AgNO3溶液依次添加至1 mL、2 mL、4 mL、5 mL、9 mL，即二者的物料比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9（v/v），靜置過夜.

結果如圖3所示：在兩者以1∶1、1∶2的物料比進行反應時，未檢測出AgNPs的特征峰，推測是由于水提液過量，導致合成的銀納米粒子與提取液中的成分結合，粒子數量極少可以忽略不計，不足以引起整個反應體系的變化；當AgNO3溶液體積增大至水提液的4倍時，300～400 nm 之間出現紫外吸收峰，表明體系開始生成AgNPs；兩者的體積比為1∶5時，在410 nm處出現強烈的吸收峰，且半峰寬變窄，峰的對稱性較高，此時反應充分進行，生成的AgNPs數量最多，且粒子分散性好；當AgNO3溶液的體積變為9 mL時，吸收峰強度減小，且峰位置發生紅移，說明納米粒子的粒徑增大，推測可能是由于AgNO3溶液過量，短時間內AgNPs產生過多，致使粒子碰撞概率增大發生團聚現象；也有可能是氧化還原反應接近飽和，抑制了納米粒子的生成，此時水提液中還原性活性物質不足，納米粒子之間無法產生較大的靜電斥力，容易發生團聚.

綜上所述，水提液與AgNO3溶液的物料比選擇為1∶5.

2.2.3 AgNO3溶液濃度的優化

以優化后的pH以及物料比為標準，改變溶液中的AgNO3溶液濃度為4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM，靜置過夜.

紫外吸收光譜如圖4所示：當AgNO3溶液濃度為4 mM時，無明顯的SPR特征峰，說明過低的AgNO3濃度不利于AgNPs的產生；當其濃度增至5 mM與6 mM時，在400 nm處出現較強的吸收峰，峰位置基本一致，且吸收峰的強度隨著AgNO3濃度的升高而增強，表明生成的AgNPs粒徑大小相近，此時反應體系中鵝不食草水提液過量，所以納米銀產量隨著AgNO3濃度的變化而變化；在濃度為6 mM時，吸收峰強度最大，且半峰寬最窄，說明合成的納米粒子粒徑均勻且分散性能良好；當濃度升高至7 mM與8 mM時，吸收峰的強度開始呈現遞減趨勢，且峰位置逐漸發生紅移，表明此時AgNO3過量，AgNPs生成量由水提液的初始添加量決定，由于此反應體系下總體積保持不變（即最初投料量固定），故而再繼續增大其濃度沒有意義，并且還會使得納米粒子的粒徑發生變化.

綜上分析，選擇最優的AgNO3溶液濃度為6 mM.

2.2.4 反應時間的優化

納米銀的合成過程涉及多個關鍵步驟，包括Ag⁺的還原、成核、晶體生長、表面封端以及最終的穩定化.為了確保銀離子的完全還原，必須精心選擇并優化反應時間^[27].通過精確控制反應動力學，可以最大化銀離子的還原效率，從而獲得高質量的納米銀產物.以優化后的pH、物料比和AgNO3溶液濃度條件為標準，利用紫外-可見分光光度計在3 h、6 h、9 h、12 h、15 h等不同時間間隔下測量反應溶液的吸光度，選擇最佳反應時間.

由于已經確立了鵝不食草提取液以及AgNO3溶液的最佳反應比例體系，預測此反應過程會產生有單一SPR帶的特征峰，并且隨著時間的增長，只有峰強度會發生改變，峰位置保持不變.

實驗結果與預測情況基本吻合，如圖5所示：隨著時間的變化，吸收峰的位置只發生了略微的藍移，峰強度逐步升高，但相同時間段內生成納米銀的速率有所不同.在3～6 h以及6～9 h這兩段反應時間內，由于是反應的初始階段，參與反應的各物質較為充足，反應體系的氧化還原過程活躍，因此納米銀的合成速率快，吸收峰強度顯著升高，為反應的快速增長期；當反應進入9～12 h，吸收峰增長速率明顯放緩，此時反應體系已經進入了穩定增長期；當時間由12 h 延長至15 h 時，吸收峰的增長速率進一步下降，峰強度只能觀察到小幅變化，表明納米銀單位時間內產率降低.為節約時間成本，提高經濟效益，選定最佳反應時間為12 h.

2.3 AgNPs的表征

通過對鵝不食草水提液pH、水提液與AgNO3溶液的物料比、AgNO3溶液濃度以及反應時間的優化，確立最優制備條件：鵝不食草提取液的pH=8，硝酸銀濃度為6 mM，兩者的物料比為1：5（v/v），靜置反應時間為12 h.

在上述條件下經過多次對鵝不食草的提取以及AgNPs的合成，其紫外吸收峰的位置與強度均未發生明顯變化，故而可以認為不同批次的提取液不會對AgNPs的制備過程產生重要影響.使用100 mL鵝不食草水提液（pH=8）還原500 mL硝酸銀溶液（6 mM），靜置反應 12 h 后通過離心洗滌、冷凍干燥，可生成AgNPs約100 mg.

以最優制備條件生物合成AgNPs，反應前后溶液顏色變化如圖6（a）所示：鵝不食草提取液成功將無色的AgNO3還原為黑褐色的銀納米溶膠；圖6（b）則展現了AgNO3溶液中加入提取液靜置反應1 min和12 h后混合溶液的顏色變化.

本實驗利用紫外-可見分光光度計對合成的AgNPs進行初步表征.如圖7（a）所示：在最優制備條件下，與鵝不食草提取液原液相比，在410 nm處出現了較為強烈的紫外吸收峰，產生單個SPR帶，且半峰寬較窄，表明生成了粒徑小、形態穩定且分布均勻的近球形銀納米粒子.紫外圖譜中位于300 nm處的吸收可能是由于溶液中形成的銀粒子簇導致的，其被認為是生成銀粒子的前驅體，Ag4²⁺吸收峰位置在265～275 nm，在水溶液中十分穩定^[28].

使用納米粒度表面電位分析儀對合成的AgNPs膠體溶液進行平均水合粒徑、多分散指數（PDI）和Zeta電位評估.如圖7（b）所示：AgNPs平均水合粒徑為52.07±0.86 nm；PDI為0.25±0.01，表明生成的納米粒子分散性較好（PDI范圍為0～1，一般情況下該值≤0.3時認為體系尺寸分散度良好，而≥0.7則表明樣品粒度分布非常寬，不適于此分析方法）.Zeta電位的數值可以用來判斷納米粒子的穩定性^[29]，經離心后測得納米銀溶膠表面電位為-14.8 mV，表明具有較好的穩定性；推測其表面呈負電荷可能是由于吸附了鵝不食草水提液中的活性成分，從而使納米粒子在溶液中獲得相對穩定的分散狀態.

使用傅里葉變換紅外光譜儀對生成AgNPs前后水提液中參與還原過程的化合物官能團變化情況進行表征.如圖7（c）所示：鵝不食草水提液的紅外吸收光譜顯示：3 431 cm^-1（O-H）和1 060 cm^-1（C-O）提示具有羥基與苷鍵，1 600 cm^-1（N-H）和1 380 cm^-1（C-N）提示有氨基存在，與文獻報道基本一致^[30]，說明水提取物中含有豐富的黃酮類、酚類以及醇類等多羥基與胺類化合物，基本符合第 2.1 節中UHPLC-Q-TOF MS的化合物檢測鑒定結果；合成的AgNPs與鵝不食草水提液相比，特征吸收峰位置未發生顯著變化，然而吸收峰的強度卻出現了不同程度的減弱，說明水提液中的活性成分與AgNO3之間發生了相互作用；根據反應前后不同特征峰強度的變化，推測參與反應的主要活性成分有黃酮類、酚類和胺類等，這些物質不僅在合成過程中起到了還原劑的作用，而且在合成后還可能在AgNPs表面形成穩定的配位鍵，為納米粒子提供保護性.

使用X射線晶體衍射儀對AgNPs凍干粉末的晶體結構進行表征.XRD分析結果如圖7（d）所示：2θ 在38.05 °、46.2 °、64.4 °和76.85 °四處的XRD峰分別對應于（111）、（200）、（220）和（311）晶面，表明合成的AgNPs具有面心立方（FCC）晶體結構.此外，在32.19 °處也檢測到強烈的XRD峰信號，推測可能與AgNPs在由膠體狀向粉末狀的轉化過程中氧化銀顆粒的產生有關^[25].圖譜中的其他峰可能是鵝不食草水提液中的活性成分，吸附于納米粒子上避免團聚；也可能合成過程中產生了氯化銀納米顆粒，推測氯污染可能來自水提液或蒸餾過程^[31].

2.4 AgNPs 的抑菌活性測定

2.4.1 抑菌圈實驗結果

如圖8與表2所示，以生理鹽水作為陰性對照（a1、b1），其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑制作用；陽性對照組青鏈霉素混合液（a2、b2）對兩種菌的抑制效果最為明顯；鵝不食草水提液原液（a3、b3）對兩種菌均未顯示抑菌圈；利用水提液生物還原硝酸銀制備為納米粒子后，AgNPs（a4、b4）對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現出良好的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為11 mm與9 mm.

固體瓊脂培養基的濕度、厚度以及藥物的分子量大小及其在瓊脂中的擴散性都會對抑菌圈的大小產生影響，故而除非是在CLSI中有明確金標準的藥物，抑菌圈的大小與藥物濃度并不一定都成線性關系.考慮到濾紙片擴散法可能無法對AgNPs的抑菌活性進行定量分析，進一步設計實驗，使用微量肉湯稀釋法對其MIC與MBC進行測定.

2.4.2 AgNPs的MIC與MBC測定結果

本實驗采用微量肉湯稀釋法測定了AgNPs對標準菌株金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）和大腸桿菌（ATCC 25922）的最低抑菌濃度，并在此基礎上測定了其對兩種菌的最小殺菌濃度.結果如表3所示：AgNPs對兩種菌的MIC均為16 μg/mL，AgNPs對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的MBC值為2倍MIC值，對革蘭氏陰性大腸桿菌的MBC值與其MIC值相同.實驗結果表明：通過鵝不食草水提液綠色合成的納米銀具有一定的廣譜抑菌性，并可以在較低的濃度下對受試菌產生抑菌活性，但在同一濃度下AgNPs對大腸桿菌的殺菌效果強于金黃色葡萄球菌.Verma等^[32]、Choudhary等^[33]的實驗也有類似的結論.

AgNPs對兩種菌株不同的抑菌活性可能是由于細菌結構與分子組成上的差異，也可能取決于最終接種的細菌濃度以及AgNPs的濃度、大小和形狀等因素.AgNPs的粒徑越小，其與細菌細胞膜接觸的比表面積越大，則抗菌活性越強.推測AgNPs的抑菌機制可能與Ag+的釋放有關：Ag+的正電荷與細菌細胞壁上的負電荷相互作用，導致細胞壁形態的改變和細胞通透性的增加，或細胞內容物的泄漏，最終導致細胞死亡；Ag+對氮和硫具有親和力，能夠通過與巰基和氨基團結合來抑制和破壞蛋白質結構，還可能干擾蛋白質中的硫醇基團來阻止細菌DNA的復制，從而影響細胞分裂、呼吸作用，最終影響細胞的存活^[34].

3 結 論

本文將天然草本植物鵝不食草的水提液作為還原劑與穩定劑，還原硝酸銀從而得到了銀納米粒子.通過單因素實驗對制備過程中各項參數進行了優化，確立了最優制備條件為：鵝不食草提取液的pH=8，硝酸銀濃度為6 mM，兩者的物料比為1∶5（v/v），靜置反應時間為12 h.在最優條件下制備出黑褐色的銀納米溶膠，離心洗滌凍干后得到AgNPs黑色粉末，對其進行后續表征.表征結果表明：AgNPs的紫外吸收峰在410 nm處，平均水合粒徑為52.07±0.86 nm，電位值為-14.8 mV，多分散指數為0.25±0.01，合成的銀納米粒子具有面心立方晶體結構，基本呈球形，粒子分散較為均勻.

通過藥敏實驗對納米銀的抑菌活性進行測定，通過抑菌圈可以觀察到：利用鵝不食草水提液通過生物還原法綠色制備的AgNPs對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現出良好的抑菌活性；MIC與MBC結果表明：納米銀可在較低的濃度劑量下對革蘭氏陽性菌和陰性菌產生不同程度的抑制與殺滅作用，具有一定的廣譜抗菌性.

本研究采用生物法利用鵝不食草水提液制備銀納米材料，具有原料來源廣、成本低、反應可控、高效低毒、綠色環保等多種優勢，可以實現工業化生產，有望應用于納米抗菌劑領域，為臨床治療細菌感染類疾病提供新的選擇.

參考文獻

[1] Ikuta K S，Swetschinski L R，Aguilar G R，et al.Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019：A systematic analysis for the global burden of disease study 2019[J].The Lancet，2022，400（10369）：2 221-2 248.

[2]Davies J，Davies D.Origins and evolution of antibiotic resistance[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2010，74（3）：417-433.

[3]Li R，Xiao F，Amirkhanian S，et al.Developments of nano materials and technologies on asphalt materials：A review[J].Construction and Building Materials，2017，143：633-648.

[4]Jie J，Zhang W，Bello I，et al.One-dimensional II-VI nanostructures：Synthesis，properties and optoelectronic applications[J].Nano Today，2010，5（4）：313-336.

[5]Sivakumar P，Nethradevi C，Renganathan S.Synthesis of silver nanoparticles using Lantana camara fruit extract and its effect on pathogens[J].Asian J Pharm Clin Res，2012，5（3）：97-101.

[6]Vishnevskiy K，Yaroslavtsev A.Russian Samp;T foresight 2030：Case of nanotechnologies and new materials[J].Foresight，2017，19（2）：198-217.

[7]Razavi R，Amiri M，Alshamsi H A，et al.Green synthesis of Ag nanoparticles in oil-in-water nano-emulsion and evaluation of their antibacterial and cytotoxic properties as well as molecular docking[J].Arabian Journal of Chemistry，2021，14（9）：103 323.

[8]Lagashetty A，Ganiger S K.Synthesis，characterization and antibacterial study of Ag-Au Bi-metallic nanocomposite by bioreduction using piper betle leaf extract[J].Heliyon，2019，5（12）：e02 794.

[9]康晶晶，雙少敏，董 川，等.銀納米粒子的綠色合成及在生物醫學中的應用進展[J].分析科學學報，2021，37（6）：837-842.

[10] 劉 忠，徐 艷，朱榮耀，等.納米銀的制備及其應用研究進展[J].天津科技大學學報，2023，38（2）：75-80.

[11]張 琳，李 群，劉蓉蓉，等.納米銀的制備及應用[J].天津造紙，2019，41（1）：28-34.

[12]Wu Z，Yang S，Wu W.Shape control of inorganic nanoparticles from solution[J].Nanoscale，2016，8（3）：1 237-1 259.

[13]Behravan M，Panahi A H，Naghizadeh A，et al.Facile green synthesis of silver nanoparticles using Berberis vulgaris leaf and root aqueous extract and its antibacterial activity[J].International Journal of Biological Macromolecules，2019，124：148-154.

[14]李 菡，張光財，趙艷霞，等.甜瓜蒂抗氧化、降糖活性及化學成分分析的研究[J].陜西科技大學學報，2023，41（5）：42-49.

[15]代 磊.蘄艾納米銀復合物的制備、表征及抗菌性能研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2021.

[16]Willian N，Syukri S，Zulhadjri Z，et al.Marine plant mediated green synthesis of silver nanoparticles using mangrove Rhizophora stylosa：Effect of variable process and their antibacterial activity[J].F1000Research，2022，10：768.

[17]Jalab J，Abdelwahed W，Kitaz A，et al.Green synthesis of silver nanoparticles using aqueous extract of Acacia cyanophylla and its antibacterial activity[J].Heliyon，2021，7（9）：e08 033.

[18]Tarannum N，Gautam Y K.Facile green synthesis and applications of silver nanoparticles：A state-of-the-art review[J].RSC Advances，2019，9（60）：34 926-34 948.

[19]梁 軍.鵝不食草的資源、提取工藝及藥理研究[J].黑龍江醫藥，2009，22（6）：835-837.

[20]張 鑫.鵝不食草化學成分的初步研究[J].第一軍醫大學分校學報，2004，27（1）：7，16.

[21]Wayne，Pa.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[M].12th ed.Wayne，PA：CLSI，2024.

[22]Paul T K，Jalil M A，Repon M R，et al.Mapping the progress in surface plasmon resonance analysis of phytogenic silver nanoparticles with colorimetric sensing applications[J].Chemistry amp; Biodiversity，2023，20（8）：e202 300 510.

[23]Velgosová O，Mraíková A，MarcinAcˇáková R.Influence of pH on green synthesis of Ag nanoparticles[J].Materials Letters，2016，180：336-339.

[24]Desai R，Mankad V，Gupta S K，et al.Size distribution of silver nanoparticles：UV-visible spectroscopic assessment[J].Nanoscience and Nanotechnology Letters，2012，4（1）：30-34.

[25]Isa N，Osman M S，Abdul Hamid H，et al.Studies of surface plasmon resonance of silver nanoparticles reduced by aqueous extract of shortleaf spikesedge and their catalytic activity[J].International Journal of Phytoremediation，2023，25（5）：658-669.

[26]魏思敏，唐志書，李慧敏，等.山茱萸水提液銀納米顆粒的制備及其抑菌活性的研究[J].中草藥，2019，50（1）：52-58.

[27]楊博玥，張 衛，孫 奕，等.基于陳皮提取物的納米銀綠色合成方法研究[J].當代化工，2020，49（8）：1 605-1 608，1 612.

[28]Rodríguez Sánchez M L，Rodríguez M J，Blanco M C，et al.Kinetics and mechanism of the formation of Ag nanoparticles by electrochemical techniques：A plasmon and cluster time-resolved spectroscopic study[J].The Journal of Physical Chemistry B，2005，109（3）：1 183-1 191.

[29]Heydari R，Rashidipour M.Green synthesis of silver nanoparticles using extract of oak fruit hull （Jaft）：Synthesis and in vitro cytotoxic effect on MCF-7 cells[J].International Journal of Breast Cancer，2015，2015（1）：846 743.

[30]倪 紅，馬安寧，張 云，等.石胡荽有效成分滅螺的初步研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2009，27（4）：377-379.

[31]Kanniah P，Chelliah P，Thangapandi J R，et al.Green synthesis of antibacterial and cytotoxic silver nanoparticles by Piper nigrum seed extract and development of antibacterial silver based chitosan nanocomposite[J].International Journal of Biological Macromolecules，2021，189：18-33.

[32]Verma D K，Hasan S H，Banik R M.Photo-catalyzed and phyto-mediated rapid green synthesis of silver nanoparticles using herbal extract of Salvinia molesta and its antimicrobial efficacy[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2016，155：51-59.

[33]Choudhary M K，Kataria J，Cameotra S S，et al.A facile biomimetic preparation of highly stabilized silver nanoparticles derived from seed extract of Vigna radiata and evaluation of their antibacterial activity[J].Applied Nanoscience，2016，6：105-111.

[34]Patil M P，Kim G D.Eco-friendly approach for nanoparticles synthesis and mechanism behind antibacterial activity of silver and anticancer activity of gold nanoparticles[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2017，101：79-92.

【責任編輯：蔣亞儒】