小麥胚芽提取物的系統毒性研究和安全性評價

目的：研究小麥胚芽提取物的毒理安全性，指導業內化妝品原料企業在進行化妝品原料備案時的規范操作。

方法：根據《化妝品安全技術規范（2015年版）》對小麥胚芽提取物開展急性經皮毒性實驗、急性經口毒性實驗、細菌回復突變實驗和體外哺乳動物細胞染色體畸變實驗，進行系統的毒理學安全評價。

結果：小麥胚芽對家兔急性經皮實驗采取一次性限量法，劑量為 2000mg/kg·bw，未見毒性反應亦無個體死亡現象； 小鼠急性經口毒性試驗LD50>5000mg/kg·bw，根據急性經口毒性分級，小麥胚芽提取物屬于與實際無毒級；Ames實驗結果表明在加或不加S9的情況下，5個劑量組的細菌回變菌落數均未超過溶劑對照組的2倍，同時陽性對照組回變菌落數均為溶劑對照組的2倍以上；體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗中受試物各劑量組致畸變率均小于陽性對照組，差異有統計學意義（P<0.005）。

結論：在以上實驗條件下，小麥胚芽提取物作為化妝品原料具有良好的安全性。

【基金項目】抗衰類化妝品產品及原料功效評估和安全性評價平臺建設（廣東省藥品檢驗所2024ZDZ15）

【創業訓練項目】2024年廣東藥科大學大學生創新創業訓練計劃項目，Bio-gen A新型化妝品原料——開啟細胞級科技抗衰時代（項目號：S202410573014X ）

關鍵詞：小麥胚芽提取物；系統毒性；化妝品原料

植物源化妝品原料是指利用植物資源開發的植物提取物、從植物中提取的活性成分或按原料的活性結構合成的化合物。近年來，隨著消費者對化妝品功效性和安全性重視程度的提高，天然植物護膚以其天然、綠色、健康的理念深入人心[1]?；瘖y品中的植物活性成分不僅不良反應小，而且功效溫和，以植物資源為原料開發的化妝品越來越受到消費者追捧。但是大多數的植物提取物的化學成分與其功效的對應關系缺乏科學的數據支撐和權威標準[2]。大部分的原料企業或化妝品企業僅依據經驗或同行交流進行原料生產，這使得植物提取物的制備工藝合理性存疑，質量一致性和穩定性難以保證[3]。化妝品新原料安全是產品質量安全的源頭，在2021年5月國家藥監局制定發布了《化妝品新原料注冊備案資料管理規定》（以下簡稱“《規定》”）。該法規中明確規定了化妝品新原料注冊備案的資料要求。本實驗根據該法規中新原料毒理學安全性評價要求對小麥胚芽提取物進行了一系列的毒理學實驗[4]。

小麥作為中國主要膳食作物具有較高的營養價值，其生理活性成分主要集中在小麥加工副產品：胚芽、麩皮和次粉中[5]。小麥胚芽（Wheat Embryo）呈金黃色，占整個小麥籽粒的2%-3%，內含豐富的生物所需的多種功能物質，包括蛋白質、維生素、礦物質、膳食纖維、不飽和脂肪酸以及多種生物活性成分，被稱為“人類天然的營養寶庫”[6]。小麥胚芽提取物不僅可用于食療保健，在美容化妝品方面更具有不凡的魅力。小麥胚芽提取物主要有谷胱甘肽、胚芽蛋白、小麥胚芽油、小麥胚芽凝集素等[7]。已有研究發現，小麥胚芽油中富含的維生素E和黃酮類化合物有助于提高皮膚的抗氧化能力、能刺激皮膚膠原蛋白的生成， 促進皮膚細胞的修復和再生[8]。小麥胚芽提取物中的還原型谷胱甘肽，還參與清除自由基并抑制酪氨酸酶活性，從源頭抑制黑色素的形成[9]。故小麥胚芽提取物在化妝品行業具有巨大的開發潛力。

1995年，聯合國糧農組織（FAO）提出，小麥是世界8類常見過敏食物之一。因小麥中含有豐富的蛋白質[5]，如小麥中的清蛋白、球蛋白、谷蛋白、麥醇溶蛋白等可能會引起嚴重的過敏反應，如乳糜瀉腸炎、職業哮喘、接觸性蕁麻疹等[10]。小麥胚芽提取物中同樣具有這些蛋白質，這些蛋白質在小麥胚芽提取物中也有可能會引起一些不良反應。但目前卻缺乏小麥胚芽提取物作為化妝品新原料毒理學安全評價的科學數據支撐，這依舊是化妝品安全的一個隱患。本實驗根據藥監局發布的《規定》中新原料的備案要求，對小麥胚芽提取物進行毒理學安全評價，以期為小麥胚芽提取物作為化妝品原料在毒理學方面提供一定的理論基礎，指導業內原料企業在新原料注冊備案時的規范操作。

Part 1材料與方法

1.1受試物

小麥胚芽提取物，批號：XM221024；由深圳中科欣揚生物科技有限公司提供。

1.2實驗動物及菌株

急性經皮實驗用新西蘭白色家兔10只，雌雄各半，普通級，體重2.3kg～2.6kg。由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK （粵）2019-0035；急性經口實驗用健康無孕小鼠10只，雌雄各半，普通級，體重19.1g～21.4g。由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK （粵）2022-0002；實驗動物飼料按照標準由廣東省醫學實驗動物中心制定（見表1），使用SPF維持鼠料，符合飼料衛生標準和營養標準，經鈷60輻照滅菌，適用于SPF級和無菌級成年大小鼠或生長、繁殖階段以外的大小鼠。動物飲水采用經紫外線照射等處理后的純水。實驗動物于實驗前在動物房先適應3天，檢疫合格后使用。動物飼養溫度23℃-24℃，相對濕度45%-68%，自由采食和飲水。

Ames實驗采用組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌突變菌株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535。經上海寶錄生物科技有限公司購自美國Moltox公司，標準株源于Ames實驗室，經生物學檢定合格后進行實驗；體外哺乳動物染色體畸變實驗使用中國地鼠肺細胞株（CHL），來源于中國科學院上海細胞庫，經生物學鑒定無支原體污染后使用。

1.3試劑

Ames實驗、體外染色畸變實驗采用滅菌純化水為溶劑對照；哺乳動物微粒體酶（S9；美國Moltox）；胰蛋白胨、牛肉浸膏（廣東環凱生物科技有限公司）；瓊脂粉（900-950g/cm2；廣東環凱生物科技有限公司）；瓊脂粉（1200g/cm2；上海如吉生物科技發展有限公司）；D-生物素、輔酶Ⅱ（氧化型）、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽（上海源葉生物科技有限公司）；L-組氨酸（上海伯奧生物科技有限公司）；除菌濾膜（0.22μm，MTLLEX）；Dexon （Ehrenstorfer GmbH）；NaN3 （天津市福晨化學試劑廠）；絲裂霉素C （羅恩試劑公司）；2-氨基芴（Aladdin）；1，8-二羥蒽醌（Aladdin）；DMEM（GIBCO，賽默飛）；胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek LTD）；胰酶、環磷酰胺（麥克林）；秋水仙素（普西唐）；Giemsa染液（廣州和為化工有限公司）。

1.4儀器

LRH-250F型生化培養箱；MLS-3781型高壓滅菌器；BT125D電子天平；TW20型電熱恒溫震蕩水浴箱；ED53恒溫干燥箱；SANYO二氧化碳培養箱；OLYPUMS IX71倒置相差顯微鏡；HITACHI CR21離心機；Julabo恒溫水浴箱；蔡司染色體分析系統；METTLER電子天平。

1.5實驗方法

1.5.1家兔急性經皮毒性實驗

根據《化妝品安全技術規范（2015年版）》中急性經皮毒性實驗，本身低毒的受試物，可采用一次最大限度實驗，受試物劑量為2000mg/kg。選取家兔10只，雌雄各半。試驗前將家兔軀干背部被毛剪掉，剪毛過程不損傷皮膚表面。試驗前先以純化水潤濕家兔皮膚，取受試物粉末均勻涂敷于動物背部皮膚染毒區，涂皮面積約為180cm2。用無刺激玻璃紙、紗布覆蓋，無刺激膠布固定。封閉接觸24h。染毒結束后，用純化水清除殘留受試物。染毒后觀察實驗動物的中毒表現和死亡情況，包括被毛和皮膚、眼睛和黏膜以及呼吸、循環、自主神經和中樞神經系統、肢體運動和行為活動等的改變。觀察期內存活動物每周稱重、觀察期結束存活動物應稱重，處死后進行尸檢。

1.5.2小鼠急性經口毒性實驗

本實驗參照《化妝品安全技術規范（2015年版）》急性經口毒性實驗中一次最大限度試驗法進行。實驗時精密稱取受試物3.2951g溶于純化水中，終體積為6.5mL。每組5只實驗動物（雌雄分開），試驗前禁食過夜，試驗當天采用經口灌胃給予受試物溶液。體積為0.2ml/20g，給予的劑量為5069mg/kg，觀察期為14天。染毒后繼續禁食3h～4h。觀察實驗動物的中毒表現和死亡情況，觀察期內存活動物每周稱重、觀察期結束存活動物應稱重，處死后進行尸檢。

1.5.3細菌回復突變（Ames）實驗

實驗參照《化妝品安全技術規范（2015年版）》中細菌回復突變實驗中平板滲入法進行試驗。以經鑒定符合生物學要求的組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535試驗菌株進行試驗。根據預實驗結果，將樣品設置5個劑量組（加代謝活化系統（+S9）：64.96 、 32.48、16.24、8.12和4.06mg/皿；不加代謝活化系統（-S9）：32.48、16.24、8.12、4.06和2.03mg/皿）。同時設置3個對照組，分別為空白對照組、溶劑對照組（滅菌純化水）、陽性對照組（ -S9：Dexon （50μg/皿）作為TA97a、TA98菌株的陽性對照物；NaN3 （1.5μg /皿）作為TA100菌株的陽性對照物；絲裂霉素C（0.5μg/皿）作為TA102菌株的陽性對照物；NaN3 （ 0.5μg/皿）作為TA1535菌株的陽性對照物； +S9：2-氨基芴（10μg/皿）作為 TA97a、TA98、TA100、TA1535菌株陽性對照物；1，8-二羥蒽醌（60μg/皿）作為TA102菌株陽性對照物）。

每個組別需要3個平行皿，計數每皿回變菌落數，并求平均值和標準差。如果實驗結果發現受試物回變菌數超過溶劑對照組菌數的2倍及以上，且存在劑量依賴性關系則結果為陽性。試驗在相同的情況下重復進行3次。

1.5.4體外哺乳動物染色體畸變實驗

實驗參照《化妝品安全技術規范（2015年版）》體外哺乳動物染色體畸變實驗進行。選用生物鑒定合格的CHL細胞株，根據細胞毒性（MTT法）的結果，在加與不加S9的情況下，受試物濃度為5000mg/L時細胞存活率均大于50%。本實驗設5000、2500和1250mg/L 3個劑量組，并設置陰性對照組和陽性對照組。將CHL細胞按1×106mL的密度接種于6孔板中，置37℃二氧化碳培養箱內培養24h后，加入各組受試物。陰性對照組給予滅菌純化水（+S9/-S9）；陽性對照組分別給予環磷酰胺（+S9） 20mg/L，絲裂霉素C （- S9） 2mg/L；+S9組均加入0.3mL S9混合物；-S9組均不加S9混合物。

將CHL細胞經24-48小時培養后，棄其培養液，收獲細胞前4小時，加入秋水仙素溶液（終末濃度為1μg/ml），阻斷細胞于有絲分裂中期相。按常規方法消化、低滲、固定、制片和染色，每一處理組選100個分散良好的中期分裂相（染色體數為2n±2）進行染色體分析。觀察記錄顯微鏡視野畸變類型及畸變數目，計算染色體畸變細胞率。（裂隙和多倍體不作為畸變率統計）

畸變率/%=（染色異常細胞數-裂隙數-多倍體積）/100×100%

1.6統計學方法

SPSS統計軟件對試驗數據進行統計學分析。計數資料采用非參數統計法，并按動物性別分別統計； 計量資料用單因素方差分析，以平均值±標準差（ x ！±s） 表示，以 P<0.05為差異有統計學意義。

Part 2結果

2.1 家兔急性經皮毒性實驗結果

小麥胚芽提取物對2種性別家兔的進行經皮毒性試驗，一次經皮涂抹劑量為2000mg/kg·bw。由表2可知，家兔的體重變化符合動物正常生長規律。在14天的觀察期內家兔毛發、皮膚、眼睛和黏膜、呼吸、循環、自主神經和中樞神經系統、肢體運動和行為活動等均未見異常。上述結果表明在本實驗條件下，小麥胚芽提取物在家兔急性經皮實驗時未觀察到皮膚毒性和個體死亡。

2.2小鼠急性經口毒性實驗結果

小麥胚芽提取物對2種性別的小鼠進行急性經口毒性試驗，一次灌胃劑量達 5069mg/kg·bw。由表3可知，小鼠體重變化情況符合動物正常生長規律。在14天的觀察期內小鼠毛發、皮膚、眼睛和黏膜、呼吸、循環、自主神經和中樞神經系統、肢體運動和行為活動等均未見異常。處死實驗動物后檢查胸腹部主要臟器，包括肝臟、脾、胃、腸、心臟、腎臟、肺部、腦部和生殖系統，均未見任何明顯病理變化。上述結果表明在本實驗條件下，小麥胚芽提取物的小鼠急性經口毒性LD50大于5000mg/kg，按照《化妝品安全技術規范（2015年版）》中經口毒性分級，小麥胚芽提取物屬于實際無毒級。

2.3細菌回復突變（Ames）實驗結果

受試樣品小麥胚芽提取物對鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535等5種試驗菌株的細菌回復突變結果顯示（表4、表5），在加或不加S9的情況下，5個劑量組的細菌回變菌落數均沒有超過溶劑對照組的2倍，同時陽性對照組回變菌落數均為溶劑對照組的2倍以上。因此，在本實驗的受試物劑量和觀察條件下，小麥胚芽提取物未呈現致突變性。

2.4體外哺乳動物細胞染色體畸變實驗結果

細胞毒性實驗結果見表6：由表6可見，在加或不加S9的情況下，受試物濃度為5000mg/L時，細胞存活率均大于50%。故正式試驗時受試物濃度選取了5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L 3個劑量組。

由表7可知，陽性對照組與陰性對照組相比，在-S9/+S9條件下，染色體畸變細胞率均有顯著性差異（P<0.01）；小麥胚芽提取物與陰性對照組相比，在-S9/+S9條件下，染色體畸變細胞率均無顯著性差異（P>0.05）。因此，在該試驗條件下，小麥胚芽提取物的體外哺乳動物染色體畸變實驗結果為陰性。

Part 3討論

小麥作為人類主要的糧食作物，在世界各地都廣泛種植，具有悠久的食用歷史[11]。小麥具有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸以及多種活性成分。小麥胚芽的充分利用將具有很高的經濟效益和社會效益。隨著小麥胚芽功能性成分提取技術漸趨成熟，小麥胚芽提取物具有廣闊的開發與利用前景。

目前小麥胚芽及其加工產品主要集中于食品和保健品領域[12]。隨著國內對小麥胚芽的應用研究逐漸加深，小麥胚芽提取物在醫藥和化妝品領域展現了極高的應用價值[11]。同時小麥胚芽油因其豐富的營養成分被廣泛用于化妝品領域， 小麥胚芽提取物可以提高皮膚的抗氧化能力、刺激膠原蛋白的生成， 促進皮膚細胞的再生和修復[13]。Raghda Zakaria等[13]人連續3周使用摻入20%小麥胚芽油的藥膏可以使大鼠傷口直徑縮小90%， 傷口恢復50%。

雖然小麥胚芽提取物的應用越來越廣泛，但是目前仍缺乏小麥胚芽提取物的毒理學安全評價?；瘖y品安全性評價是化妝品新原料注冊備案的必備環節，主要以毒理學領域的實驗研究為手段，通過對化妝品原料的毒性進行全面系統的研究，掌握物質有無毒性、毒性大小等，并依次推斷該原料是否可以作為化妝品新原料進行注冊備案。

小麥胚芽提取物作為化妝品原料主要的暴露途徑是以經皮涂抹的方式，也可能經口攝入或被兒童誤食等情況，故先對小麥胚芽提取物進行急性經皮和急性經口實驗。采用一次限量法給藥，以期在短期內了解小麥胚芽提取物是否對實驗動物體征產生損傷和是否導致動物死亡等方面的毒性信息。獲取參數作為急毒分級的主要依據。實驗結果表明，小麥胚芽提取物對家兔急性經皮毒性經過一次性給藥2000mg/kg·bw，未見皮膚毒性和個體死亡；小麥胚芽提取物對小鼠急性經口實驗的LD50>5000mg/kg·bw，根據《化妝品安全技術規范》中經口毒性分級，小麥胚芽提取物屬實際無毒。

遺傳毒性研究主要用于預測化合物潛在的遺傳毒性和致癌性[14]。目前遺傳毒性的檢測方法主要有基因突變檢測、對染色體和染色體組畸變檢測以及DNA損傷的檢測?！兑幎ā分忻鞔_規定化妝品原料在備案時必須要有遺傳毒性實驗。因為原料誘發基因突變和染色體畸變的能力可能不一致，為避免單一實驗結果得到假陰性結果，故遺傳毒性實驗最少應包括一項基因突變實驗和一項染色體畸變實驗[15]。故本實驗采取Ames實驗和體外哺乳動物染色體突變實驗對小麥胚芽提取物進行安全性評價。Ames實驗結果表明在不加代謝活化系統的情況下，無論是否添加S9，5個劑量組的細菌回變菌落數均沒有超過溶劑對照組的2倍，同時陽性對照組回變菌落數均為溶劑對照組的2倍以上。因此，在本實驗的受試物劑量和觀察條件下，小麥胚芽提取物未呈現致突變性；體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗中受試物各劑量組致畸變率均小于陽性對照組，且具有顯著性差異（P<0.005）。

以上結果表明，在本實驗的研究劑量和觀察條件下，小麥胚芽提取物在急性經口毒性中屬于實際無毒物、無急性皮膚刺激性、無致基因突變毒性、亦無致染色體畸變毒性。本研究結果為小麥胚芽提取物作為化妝品原料的安全性評價提供科學依據。

作者介紹

第一作者 陳琪：供職于廣東省藥品檢驗所，國家藥品監督管理局化妝品風險評估重點實驗室，從事藥物安全性評價及藥理毒理研究

通訊作者 顏林：供職于廣東省藥品檢驗所，國家藥品監督管理局化妝品風險評估重點實驗室，從事醫療器械/藥包材的檢驗及標準化研究

盧麗，王琳：供職于廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院

許姿敏，陳素珍：供職于廣東省藥品檢驗所，國家藥品監督管理局化妝品風險評估重點實驗室

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