雙酶水解-DNS 比色法測定白卡紙中淀粉含量的研究

摘要： 為測定白卡紙中的淀粉含量，本研究選用α-淀粉酶和糖化酶對白卡紙進行雙酶協同降解，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法對酶解產物葡萄糖進行測定，進而計算白卡紙中的淀粉含量。在單因素實驗分析研究的基礎上，采用響應面分析法優化雙酶水解-DNS比色法測定淀粉含量的最佳條件，建立數學模型，回歸方程失擬誤差不顯著（Plt;0. 000 1），理論值與測定值吻合（R2為0. 988 6）；雙酶水解-DNS比色法測定淀粉含量的最佳條件為：雙酶添加量5 mg/mL，酶解時間75 min，酶解溫度40 ℃。對該方法進行精密度和加標回收率測試，相對標準偏差為0. 8%，加標回收率為96. 2%～98. 0%。

關鍵詞：白卡紙；淀粉；α-淀粉酶；糖化酶；測定

中圖分類號：TS762. 2 文獻標識碼：A DOI：10. 11980/j. issn. 0254-508X. 2025. 03. 016

白卡紙具有定量高、堅挺厚實等特點，廣泛應用于印刷和包裝行業，卷煙行業中白卡紙每年需求量達50～60萬t[1]。作為一種高檔包裝材料，白卡紙應具有良好的印刷適應性和上機適應性。為了使白卡紙的挺度、平滑度、光澤度、白度、層間結合強度等指標滿足使用要求，在白卡紙的生產中需使用較多的原淀粉和改性淀粉[2]。原淀粉主要用于層間噴淋，增加纖維間的結合強度，使紙張厚度均勻，同時提高紙張的抗張強度、挺度、耐破度、層間結合強度；改性淀粉作為增強劑和助留助濾劑，廣泛應用于造紙濕部，用于提高紙張的強度，改善紙張表面性能；原淀粉和改性淀粉還被廣泛用作表面施膠劑，提高紙張強度，改善紙張的印刷適應性[3-4]。由此可知，淀粉在改善和提高白卡紙的性能方面發揮重要作用。對于造紙企業來說，了解淀粉在紙張中的留著率，可以調節生產工藝，控制產品質量；對于紙張研究而言，了解紙張中的淀粉含量，有利于研究淀粉對不同紙張性能的影響，從而開發新產品。因此，一種準確測定白卡紙中淀粉含量的方法亟需被建立。

目前，我國還沒有紙張中淀粉含量測定的相關標準。美國TAPPI T 419 om—2010提供了紙張中淀粉含量的測定方法，但該方法只適合紙張中原淀粉及僅通過常規氧化技術或酶轉化改性的淀粉定量測定，不適合陽離子淀粉、取代淀粉、接枝淀粉或與樹脂結合的淀粉等含量的測定。國內研究者依據淀粉遇碘會生成藍色絡合物的原理，建立了一種利用分光光度計測定紙張中淀粉含量的方法[5-7]，但由于影響淀粉-碘絡合物最大吸收波長的因素較多（如溫度、碘-碘化鉀濃度、淀粉聚合度等[8]），該方法的可靠性受到一定限制。

淀粉是天然存在的重要碳水化合物，廣泛存在于各種植物中；同時，淀粉在食品中有著廣泛的應用。研究者對植物和食品中淀粉含量的測定提出了多種方法[9]，其中經典的方法是淀粉經酶解或酸水解產生葡萄糖，通過滴定法、分光光度法和色譜法等方法測定葡萄糖含量，并由葡萄糖含量推算出淀粉含量[10-12]。對于白卡紙，酸水解可能會降解纖維素和半纖維素，產生葡萄糖，從而導致測定結果偏高。酶解法包括糖化酶直接水解淀粉的方法[13]、α-淀粉酶和糖化酶的雙酶法[14]、α-淀粉酶和鹽酸的酶酸法[15]。由于α-淀粉酶和糖化酶均具有專一性，在酶解淀粉的過程中，對紙張中纖維素和半纖維素不起作用，因此，α-淀粉酶和糖化酶的雙酶體系適合紙張中淀粉的水解[16]。3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法具有簡便、快捷、靈敏度高等特點，是目前還原糖實驗室檢測中最常用的方法[17]。針對白卡紙中淀粉難以分離、含量高、淀粉種類復雜的特點，本研究采用α-淀粉酶和糖化酶對白卡紙中淀粉進行酶解，生成葡萄糖，利用DNS法定量測定葡萄糖含量，再由葡萄糖含量計算出淀粉含量。該研究方法操作簡單、測試結果準確可靠，可為白卡紙中淀粉含量測定方法標準的制定提供新思路和新方法。

1 實驗

1. 1 實驗材料和儀器

1. 1. 1 實驗材料

白卡紙，湖北中煙技術中心；3，5-二硝基水楊酸（DNS） 顯色液，飛凈生物科技有限公司；陽離子淀粉，江西六和化工實業有限公司；糖化酶（酶活性130 000 U/g），湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司；α-淀粉酶（酶活性4 000 U/g），北京雙旋微生物培養基制品廠；葡萄糖、冰醋酸、醋酸鈉、碘、碘化鉀，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水為實驗室自制超純水。

1. 1. 2 實驗儀器

V-1100D可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；SHZ-82B水浴恒溫振蕩器，常州市國旺儀器制造有限公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 水分的測定

紙張中水分按照GB/T 462—2008《紙、紙板和紙漿 分析試樣水分的測定》進行測定。

1. 2. 2 葡萄糖標準溶液的配制

準確稱取在105 ℃的溫度下干燥至質量恒定的葡萄糖0.5 g，加入少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至1 000 mL，葡萄糖標準溶液的質量濃度為0.5 g/L。

1. 2. 3 淀粉溶液的配制

準確稱取5.000 0 g淀粉于500 mL燒杯中，倒入少量蒸餾水攪拌均勻，加入到正在沸騰的蒸餾水中，用蒸餾水對燒杯進行少量多次洗滌，洗滌水也加入燒杯中，繼續加熱沸騰5 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至500 mL，淀粉溶液的質量濃度為10 g/L。

1. 2. 4 白卡紙中淀粉的酶解及酶解液中葡萄糖含量的測定

稱取0.5 g樣品，加入100 mL pH值為4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液浸泡12 h， 在分散器上分散， 用100 mL緩沖溶液分多次洗滌后，倒入500 mL的具塞三角燒瓶中，置于水浴恒溫振蕩器保溫30 min后，加入糖化酶與α-淀粉酶的混合液，使溶液的總體積為300 mL。反應結束后用移液管吸取0.5 mL 酶解液，加入0.5 mL DNS 顯色液， 于沸水浴中加熱5 min，取出后用流動水迅速冷卻，加入4.0 mL蒸餾水，搖勻， 用過濾頭過濾后在540 nm 波長處測定光吸收值。

1. 2. 5 單因素實驗設計

在糖化酶與α-淀粉酶雙酶水解白卡紙淀粉的過程中，影響淀粉水解的因素主要有雙酶質量比、雙酶添加量、酶解時間、酶解溫度等。本研究選擇雙酶質量比、雙酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個因素分別進行單因素實驗。通過多次預實驗，對各單因素條件的酶解條件進行設定，具體見表1，實驗操作按1.2.4 進行。

1. 2. 6 淀粉含量的計算

白卡紙中淀粉含量由式（1）計算。

2 結果與討論

2. 1 葡萄糖標準曲線及方法檢出限

取6支10 mL比色管并編號，按表2順序加入各種試劑，混合均勻后置于沸水浴中加熱5 min進行顯色處理，取出后用流動水迅速冷卻，向各比色管中加入去離子水4.0 mL，搖勻，在540 nm波長下，用0#管調零，分別讀取各管的吸光度值（A540）。以A540值為橫坐標，葡萄糖含量（m） 為縱坐標，采用線性擬合繪制標準曲線，標準曲線方程見式（2），R2=0.999。

采用扣除空白樣吸光度后，A540=0.01所對應的濃度值為檢出限，此時300 mL反應液對應的葡萄糖質量濃度約為12.2 mg/L，換算為淀粉濃度約11.0 mg/L，因此紙張樣品中淀粉含量的檢出限為0.66%。

2. 2 白卡紙中淀粉含量測定單因素實驗分析

2. 2. 1 雙酶質量比對白卡紙中淀粉水解的影響

圖1為雙酶質量比對白卡紙中淀粉水解的影響。由圖1可知，當α-淀粉酶和糖化酶的質量比為2∶1時，酶解液中葡萄糖質量濃度最高，淀粉水解的最徹底。與此同時，反應溶液與I2-KI溶液顯色為試劑本身的顏色，表明白卡紙中的淀粉已水解完全。因此，α-淀粉酶和糖化酶的最佳質量比選為2∶1。

2. 2. 2 雙酶添加量對白卡紙中淀粉水解的影響

圖2為雙酶添加量對白卡紙中淀粉水解的影響。由圖2可知，隨著雙酶添加量的增加，白卡紙淀粉水解液中的葡萄糖質量濃度也升高，這一階段影響淀粉水解的因素主要是雙酶添加量。當雙酶添加量達5 mg/mL時，白卡紙淀粉水解液中的葡萄糖質量濃度最高；之后再增加雙酶添加量，淀粉水解液中的葡萄糖質量濃度基本不變。這是因為此時影響淀粉水解的主要因素是底物的含量，雙酶添加量已達到飽和，沒有多余的底物與酶反應。

2. 2. 3 酶解時間對白卡紙中淀粉水解的影響

圖3 為酶解時間對白卡紙中淀粉水解的影響。由圖3 可知，酶解時間對淀粉水解的影響顯著。隨著酶解時間的增加，酶解液中葡萄糖質量濃度逐漸升高，但當酶解時間達到60 min時，酶解液中葡萄糖質量濃度趨于穩定，說明酶與淀粉已經充分反應。

2. 2. 4 酶解溫度對白卡紙中淀粉水解的影響

圖4為酶解溫度對白卡紙中淀粉水解的影響。由圖4可知，酶解溫度對淀粉水解的影響不顯著。具體來說，盡管酶解溫度從30 ℃逐漸升高到70 ℃，但葡萄質量濃度量的變化幅度相對較小，表明酶解溫度變化并未顯著影響淀粉水解的效率。

2. 3 響應面實驗

2. 3. 1 實驗設計方案與結果

根據單因素探索實驗結果，以雙酶添加量（X1）、酶解時間（X2）、酶解溫度（X3） 3個參數為自變量，葡萄糖質量濃度為響應值，設計了三因素三水平17個實驗點的響應面實驗，水平設計見表3，分析結果見表4。

2. 3. 2 回歸方程的建立及方差分析

對表4數據進行回歸分析，獲得葡萄糖質量濃度對雙酶添加量、酶解時間和酶解溫度的二次多項回歸方程見式（3）。

對該回歸方程及系數進行顯著性檢驗，結果見表5。由表5 可知，R2 為0.988 6，失擬誤差不顯著（Plt;0.000 1），說明該模型顯著，擬合程度良好。一次項X1、X2對響應值的影響極為顯著，X3對響應值的影響不顯著，也即雙酶添加量和酶解時間對淀粉水解的影響顯著，酶解溫度影響較小；二次項X22的P 值lt;0.01，說明響應值的變化相對復雜，3個實驗因子對淀粉水解的影響不是簡單的線性關系，曲面效應顯著；交互項X1X2、X1X3 的P 值為lt;0.05，說明雙酶添加量與酶解時間和酶解溫度交互作用差異顯著，X2X3的Pgt;0.05， 說明酶解時間和酶解溫度交互作用不明顯。

2. 3. 3 響應面的分析

圖5～圖7為根據回歸分析結果做出的響應面圖和等值線圖。由圖5～圖7可知，雙酶添加量和酶解時間對白卡紙中淀粉水解葡萄糖質量濃度影響明顯，酶解溫度影響不明顯；X1與X2，X1與X3，也即雙酶添加量與酶解時間，雙酶添加量與酶解溫度的交互作用顯著[17-18]，與上述分析結果一致。

2. 3. 4 最佳反應條件及驗證實驗

由Design-Expert V 13.0.5 軟件分析得出最佳條件：雙酶添加量4.995 mg/mL，酶解時間74.7 min，酶解溫度40.1 ℃，該條件下葡萄糖的理論質量濃度為0.219 mg/mL。考慮實際操作，將條件修正為雙酶添加量5 mg/mL，酶解時間75 min，酶解溫度40 ℃。在此條件下，通過6次平行實驗，測得最佳條件下白卡紙中淀粉水解葡萄糖質量濃度為0.220 mg/mL，測得白卡紙中淀粉含量為13.1%，相對標準偏差（RSD）為0.8%。

2. 4 加標回收率

稱取實驗紙張樣品，在反應溶液中加入與紙張樣品中淀粉含量相近和加倍量的淀粉溶液進行反應，測定加標回收率，結果見表6。由表6可知，紙張樣品加標回收率為96.2%～98.0%。

3 結論

采用淀粉酶與糖化酶雙酶對白卡紙中的淀粉進行水解， 使其生成葡萄糖， 利用3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法定量測定葡萄糖含量，再由葡萄糖含量計算出紙張中淀粉含量。雙酶水解-DNS比色法測定淀粉含量的最佳條件為雙酶添加量5 mg/mL，酶解時間75 min，酶解溫度40 ℃。該方法相對標準偏差為0.8%，加標回收率為96.2%～98.0%，具有操作簡單、重復性好、回收率高、測試結果準確可靠等特點，可用于白卡紙中淀粉含量的測定，也為紙和紙板中淀粉含量的測定提供新思路、新方法。

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（責任編輯：呂子露）