實時重組酶輔助擴增技術快速檢測狗源性成分

摘 要：為快速檢測狗源性成分，針對cytb基因保守區域設計3 對重組酶輔助擴增（recombinase aided amplification，RAA）引物和1 條核酸外切酶（exonuclease，exo）探針，通過引物和探針濃度的篩選，構建一種實時RAA（real-time RAA，Rt-RAA）方法。利用交叉反應和重復性實驗對該檢測方法的特異性和穩定性進行評估，并將Rt-RAA方法靈敏度以及對混合模擬樣品和市售樣品的檢測結果與相應的國標檢測方法進行對比。結果表明，Rt-RAA檢測方法特異性強、穩定性好，在30 min內可檢測到目的序列，對狗源性成分的檢出限為0.2%，明顯優于實時熒光聚合酶鏈式反應檢測方法，應用Rt-RAA方法與國標方法對模擬樣品和市售實際樣品檢測結果完全一致。因此，本研究建立的Rt-RAA檢測方法適用于狗源性成分的檢測，為肉源性成分鑒定提供了另一種快速、準確的新方法。

關鍵詞：實時熒光重組酶輔助擴增技術；狗源性成分；肉制品摻假

Rapid Detection of Dog-Derived Ingredients by Real-Time Recombinase-Aided Amplification

LIU Mingming， YAN Haiyan， ZHOU Zhaoxu ， YE Yuhua， LI Zhigang， XIAO Zhaojing*

（Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection （National Center of Quality Supervision amp; Inspection of Agricultural Processed Products and Condiments）， Chongqing 401123， China）

Abstract： In order to establish a real-time recombinase aided amplification （Rt-RAA） method to rapidly detect dog-derived ingredients， three pairs of primers and one exonuclease （exo） probe were designed targeting the conserved region of the cytochrome B （cytb） gene. The designed primer combinations and probe concentration were optimized. The specificity and stability of the method were evaluated by cross-reactivity and repeatability experiments. The sensitivity of the Rt-RAA method and its results for simulated mixed samples and commercial samples were compared with those of the national standard method. The results showed that the Rt-RAA method had strong specificity and good stability and could detect the target sequence in less than 30 min. The detection limit for dog-derived ingredients was 0.2%， which was significantly better than that of real-time fluorescence polymerase chain reaction （PCR）. The results of the Rt-RAA method for simulated mixed samples and commercial samples were completely consistent with those of the national standard method. Therefore， Rt-RAA is suitable for the detection of dog-derived ingredients， providing a fast and accurate new method for the identification of

meat-derived ingredients.

Keywords： real-time recombinase-aided amplification; dog-derived ingredients; meat adulteration

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261

中圖分類號：TS251.7 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2025）04-0024-06

引文格式：

劉明明， 顏海燕， 周朝旭， 等. 實時重組酶輔助擴增技術快速檢測狗源性成分[J]. 肉類研究， 2025， 39（4）： 24-29. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261. " http：//www.rlyj.net.cn

LIU Mingming， YAN Haiyan， ZHOU Zhaoxu， et al. Rapid detection of dog-derived ingredients by real-time recombinase-aided amplification[J]. Meat Research， 2025， 39（4）： 24-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241009-261. " http：//www.rlyj.net.cn

狗肉自古有“香肉”和“白狗”等別稱，在傳統的醫學記載中具有一定的滋補功效[1]，但作為一種存在諸多爭議的食材，其在市場上的流通狀況復雜多樣。由于狗的養殖成本高、供應稀缺且價格居高不下，一些不法商販為謀取高額利潤，通過非法途徑或養殖場棄用的毛皮動物肉摻入或替代進行銷售。近年來，狗肉摻假事件屢禁不止。2023年5月曝光線上銷售的桂林靈川狗肉，實則為鴨肉烹飪制成。甚至有報道稱某些食品加工商戶將未經檢驗的狐貍肉、貂肉加工成熟食，以狗肉的名義出售。狐貍、貂與狗同屬犬科動物，可能攜帶多種病毒[2]，失去毛皮的狐肉、貂肉被低價收購冒充狗肉銷售流通，不僅嚴重侵犯了消費者合法權益，貿然食用還會給食用者健康帶來潛在的危險。尤其在新冠肺炎全球肆虐的背景下，食用野味的危險性愈發凸顯。此外，對于穆斯林消費者而言，不明標簽的狗肉成分摻入清真食品，無疑于嚴重侵犯了他們的宗教信仰[3]。為應對一系列嚴峻問題，2020年深圳市和珠海市相繼立法禁食狗肉[4]。

隨著科學技術不斷發展，越來越多的分子生物學技術被應用于肉源性成分檢測，主要包括基于外源蛋白和基于外源核酸的2 種檢測技術。相比于蛋白質，DNA是大多數生物體的遺傳物質，具有更高的穩定性和特異性。因此，基于DNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術通常作為肉類鑒定的首選方法[5-6]，其中包括傳統PCR[7]、分子信標實時PCR（molecular beacon-based real-time PCR，MB-real-time PCR）[8]、實時熒光PCR[9]、限制性片段長度多態性PCR（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[10]及數字PCR[11]等。近年來，DNA擴增技術的推進使得物種鑒定的方法得到了快速發展。基于傳統PCR檢測通量低的缺點[12-13]，已構建了多種多重傳統PCR檢測方法用于狗與其他物種的區分檢測，但仍需依賴凝膠電泳的步驟[14-15]。隨著實時熒光PCR的產生，免去了此步驟的操作[16-17]，同時能對整個擴增過程進行實時監測，并在此基礎上又衍生了多重實時熒光PCR和新型通用引物多重實時PCR等檢測技術[18-20]，從而解決了MB-real-time PCR和PCR-RFLP背景信號低、設計復雜、特異性酶要求較高及易出現假陽性等問題，但仍需昂貴的變溫分析儀器。環介導等溫擴增技術的開發擺脫了對變溫儀器的依賴，但檢測時間仍然較長，且操作復雜[21]。基于此，構建一種恒溫、快速且操作簡單的檢測方法非常必要。

實時重組酶輔助擴增（real-time recombinase aided amplification，Rt-RAA）是近年來新興的一種PCR衍生檢測方法，廣泛應用于分子診斷、微生物檢測、病原體鑒定和食品安全檢測等領域[22-24]。該方法在37～42 ℃恒溫條件下，主要通過UvsX重組酶、單鏈DNA結合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）和Bsu DNA聚合酶3 種酶20 min內即可實現擴增產物的快速積累[25]，無需熱循環儀。擴增過程的實時監測取決于DNA聚合酶外切酶的活性，可以識別和剪切無堿基位點四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）。此外，Rt-RAA試劑存在凍干粉形式，便于運輸到服務點，無需冷鏈貯藏。并且，可以使用各種檢測儀器查看擴增產生的產物或將其集成在不同平臺上，從而為資源匱乏環境中的廣泛運用提供了靈活性[26]。

本研究針對細胞色素B（cytochrome B，cytb）基因序列的保守區域建立用于狗源性成分的Rt-RAA檢測方法，對該方法的實驗條件進行優化，并評估其特異性和靈敏度。此外，利用Rt-RAA檢測方法對實際樣品和模擬樣品進行檢測，并將結果與國標方法進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠活體購自廣東省醫學實驗動物中心；狗肉、貓肉、狐貍肉和貂肉的鮮肉質控樣品由東莞元佳實驗科技有限公司提供；牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、馬肉、鵝肉、驢肉、駱駝肉為本實驗室日常肉品質檢測所用的質控樣品；兔肉、馬鹿肉、梅花鹿肉為線上購買，并通過GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》進行真實性鑒定，結果均符合要求；核酸擴增試劑盒（內含水化緩沖液、MgAc緩沖溶液）由眾測（杭州）生物科技有限公司提供；核酸提取試劑盒由成都TaKaRa公司提供。

1.2 儀器與設備

CFX96 Touch熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad

公司；GR85DA高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；

ME403千分之一電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Nanodrop ONEc超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

由于狐貍和貂與狗同屬于犬類動物，檢測通常易受干擾，本研究為了保證所建立Rt-RAA方法在檢測中的可實用性，將狐貍肉和貂肉粉碎，并等質量混合后作為本次實驗所用的基底肉。將狗肉與基底肉混合，其中狗肉質量分數分別為100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0%，以確定狗源性成分檢出限。

1.3.2 樣本DNA提取

按照提取DNA試劑盒說明書，取約50 mg新鮮狗肉樣本，與裂解液充分研磨混合，為提高所提取的DNA質量，加入20 μL蛋白酶（20 mg/mL）和10 μL RNA酶（10 mg/mL）反應2 h，后續通過吸附柱進行吸附和過濾，即可得到目的DNA。通過超微量分光光度計對其進行評價，將吸光度A260 nm和A280 nm比值在1.7～1.9的目的DNA稀釋至10 ng/μL，于－20 ℃保存，以備后續實驗使用。

1.3.3 Rt-RAA引物、探針設計與合成

基于GenBank數據庫公布的狗基因序列，通過BLAST進行對應序列同源性分析，確定cytb基因（基因ID：804486）中的保守序列。根據該序列，通過Rt-RAA工作原理和探針引物設計規則，使用Snap Gene軟件設計3 對狗特異性引物和1 條核酸外切酶（exonuclease，exo）探針，相關序列如表1所示。設計的引物和探針序列均送至生工生物工程（武漢）股份有限公司進行合成。

1.3.4 Rt-RAA檢測條件

為研究Rt-RAA最適反應條件，分別對不同的引物對進行篩選，并探究其探針濃度，最終將篩選確定的反應終濃度200 nmol/L的RAA-cytb-F2、R1引物和反應終濃度160 nmol/L的RAA-cytb-P作為后續實驗反應物。此外，反應體系還包括：25 μL水化緩沖液、2.5 μL 280 mmol/L

MgAc緩沖溶液和1 μL目標DNA，最終用ddH2O補齊至50 μL。在本體系下，探究在33～43 ℃梯度范圍內最佳反應溫度，每一反應溫度條件下進行的實驗均設置3 個平行。所有實驗運行程序均為30 s/循環，40 個循環。

1.3.5 Rt-RAA特異性實驗

按照上述確定的Rt-RAA檢測條件，對提取的鼠肉、貓肉、狐貍肉、貂肉、牛肉、鵝肉、羊肉、駱駝肉、豬肉、兔肉、雞肉、梅花鹿肉、馬肉、驢肉、馬鹿肉和鴨肉DNA進行擴增，并以狗肉的DNA和ddH2O分別作為陽性對照和空白對照作為參照，以確定檢測方法的特異性。

1.3.6 Rt-RAA靈敏度和穩定性實驗

將狗肉與基底肉充分混合，制成狗肉質量分數分別為100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0%的模擬樣品，并提取DNA進行恒溫擴增，以確定所建立的方法對狗肉的檢測靈敏度，并與GB/T 38164—2019中實時熒光PCR法檢測靈敏度進行對比。

選取狗肉質量分數分別為1%、0.5%、0.2%的模擬樣品DNA，進行重復性擴增反應，每組設置10 個平行樣，以確定Rt-RAA檢測方法的穩定性。每組平行樣均按照1.3.2節方法進行DNA提取，將A260 nm/A280 nm在1.7～1.9范圍內的DNA質量濃度均稀釋至10 ng/μL。

1.3.7 市售樣品和模擬樣品檢測

在狗肉店、燒烤店和小商店隨機購買15 份樣品，并制作市售模擬樣品（將狗肉與基底肉混合，制成狗肉質量分數分別為0.5%和1%的樣品，通過高壓滅菌鍋121 ℃、20 min蒸熟），利用所建立的Rt-RAA方法和GB/T 38164—2019中的實時熒光PCR法進行狗源性成分檢測，對實驗結果進行對比分析并評價。

1.4 數據處理

采用PowerPoint軟件作圖。采用Exce1軟件進行數據處理，實驗結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 Rt-RAA引物及相應探針濃度的篩選

根據NCBI公布的基因序列，按照Rt-RAA工作原理，合成用于目的片段擴增的引物和探針。為達到最優的擴增效果，本研究鑒定并篩選9 對引物-探針組合與狗源DNA反應性。如圖1A所示，所有組合均得到有效擴增，并且呈現典型的“S”型曲線。然而，只有5 對引物組合在相對較低的循環閾值（cycle threshold，Ct值）下快速達到擴增平臺期，其中引物組合F2R1（RAA-cytb-F2和RAA-cytb-R1）擴增起點早于其他組合。因此，將F2R1引物組合用于實驗的進一步優化和驗證。在固定200 nmol/L引物終濃度條件下，在40～280 nmol/L

濃度范圍探究不同濃度探針對Rt-RAA信號響應的影響。如圖1B所示，熒光強度和反應效率隨著探針濃度的增加而逐漸增加，160 nmol/L時反應起始點明顯早于其他探針濃度擴增曲線，且熒光強度最強。因此，選擇160 nmol/L作為所有后續實驗的探針濃度。

2.2 Rt-RAA反應溫度的優化

溫度是Rt-RAA擴增反應過程中的關鍵參數，

如圖2所示，在33～43 ℃溫度區間內均能有效擴增出目的序列。在33～39 ℃范圍內，隨著擴增溫度的升高，Ct值逐漸降低。在41 ℃時，擴增起始點開始出現延遲。盡管在43 ℃下進行Rt-RAA擴增反應效率有所提高，但Ct值仍高于39 ℃擴增Ct值。因此，將39 ℃作為實驗反應溫度，以實現Rt-RAA方法效果達到最佳。

2.3 Rt-RAA的檢測特異性驗證

特異性是Rt-RAA作為檢測方法使用之前需評估的重要指標。如圖3所示，只有狗肉樣品DNA呈現出典型的“S”型擴增曲線，其他肉類和空白對照均未檢測出熒光強度變化。表明Rt-RAA檢測方法具有較高的特異性，可以將目的基因與日常其他肉類基因進行區分，有效避免假陽性的出現。

2.4 Rt-RAA的檢測靈敏度

如圖4所示，隨著狗肉質量分數降低，所檢測的Ct值逐漸減小。其中，Rt-RAA方法可檢測狗肉質量分數低至0.2%，且在Ct值20以內即可檢測到擴增熒光強度。

GB/T 38164—2019中實時熒光PCR法檢測狗肉最低質量分數則為0.5%，且擴增熒光在Ct值30以上才可被儀器所捕獲。表明本研究創建的Rt-RAA方法檢測狗源性成分靈敏度明顯優于傳統的實時熒光PCR檢測方法，并為檢測更低質量分數狗源性成分提供了更加靈敏、快捷的新方法。

2.5 Rt-RAA的檢測穩定性

如圖5所示，不同質量分數的狗源性成分在重復實驗中均能出現擴增曲線，但重復樣本之間稍有不同，其中質量分數為0.2%時的檢測結果差異最大。隨著質量分數降低，所測的平均Ct值逐漸升高。狗肉質量分數為1%、0.5%和0.2%時所測得的10 次重復性實驗的相對標準偏差分別為7.68%、8.26%和10.90%。表明本研究構建的Rt-RAA檢測方法具有可接受的穩定性。

2.6 市售樣品和模擬樣品檢測結果

為進一步驗證所構建的Rt-RAA方法的實用性，本研究增加了模擬樣品進行對比檢測。如表2所示，2 種方法對模擬樣品檢測結果符合率達100%。

3 結 論

本研究以狗的多拷貝線粒體基因組中cytb基因保守序列為靶標，設計了3 對RAA引物和1 條exo探針。通過引物的篩選、探針濃度和反應溫度的優化，構建了用于狗源性成分的Rt-RAA檢測方法。該方法的建立有效縮短和簡化了摻假鑒定過程，從而提高了檢測效率。此外，構建的Rt-RAA檢測方法具有較高的特異性和較低的檢出限，對于16 種非靶標物種無交叉反應，可檢測出質量分數低至0.2%的狗源性成分，并且結果穩定。針對市售樣品和模擬樣品的檢測，結果與實時熒光PCR法一致。為確保在日常中能夠檢出較低質量分數的狗肉樣品，本研究將循環數設定為40。在此循環數下，Rt-RAA檢測方法在30 min內即可完成擴增。綜上所述，本研究開發的

Rt-RAA反應體系是一種有效的檢測方法，可用于市場上狗源性成分鑒定，為打擊非法狗肉摻假提供了有力的技術支撐。

參考文獻：

[1] 范露， 張振環， 張莉. 花江狗肉營養成分分析及營養學評價[J]. 肉類工業， 2015（4）： 16-18. DOI：10.3969/j.issn.1008-5467.2015.04.005.

[2] 秦天， 阮向東， 段招軍， 等. 開展野生動物微生物研究應對未來新發傳染病[J]. 疾病監測， 2021， 36（3）： 209-213. DOI：10.3784/jbjc.202101260044.

[3] RONMAN A， WINDARSIH A. The application of molecular spectroscopy in combination with chemometrics for halal authentication analysis： a review[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2020， 21（14）： 5155. DOI：10.3390/ijms21145155.

[4] 米洛·博伊德. 深圳珠海全面禁食貓狗[J]. 養豬， 2020（3）： 72. DOI：10.3969/j.issn.1002-1957.2020.03.033.

[5] NURAENI U， MALAU J， ASTUTI R T， et al. Droplet digital PCR versus real-time PCR for in-house validation of porcine detection and quantification protocol： an artificial recombinant plasmid approach[J]. PLoS ONE， 2023， 18（7）： e0287712. DOI：10.1371/journal.pone.0287712.

[6] CAI Z D， ZHONG G W， LIU Q Q， et al. Molecular authentication of twelve meat species through a promising two-tube hexaplex polymerase chain reaction technique[J]. Frontiers in Nutrition， 2022， 9： 813962. DOI：10.3389/fnut.2022.813962.

[7] 陳勇勇， 黃世會， 牛熙， 等. 11 種肉及肉制品動物源性成分PCR檢測技術[J]. 中國動物檢疫， 2023， 40（5）： 107-114. DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2023.05.020.

[8] MOHAMAD N， MUSTAFA S， MOKHTAR N K， et al. Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of porcine DNA in gelatin and gelatin capsules[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2018， 98（12）： 4570-4577. DOI：10.1002/jsfa.8985.

[9] 朱天園， 焦新雅， 程書梅. 基于便攜式熒光定量PCR儀定量檢測驢肉中摻假鴨肉[J]. 食品工業科技， 2023， 44（9）： 340-345. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2022080139.

[10] VAITHIYANATHAN S， VISHNURAJ M R， NARENDER R G， et al. Authentication of camel meat using species-specific PCR and PCR-RFLP[J]. Journal of Food Science and Technology， 2021， 58（10）： 3882-3889. DOI：10.1007/s13197-020-04849-w.

[11] HU H Z， CHENG J M， WEI C Y， et al. Pre-degassed microfluidic chamber-based digital PCR device for meat authentication applications[J]. Micromachines， 2021， 12（6）： 694. DOI：10.3390/mi12060694.

[12] RAHMAN M M， ALI M E， HAMID S B， et al. Polymerase chain reaction assay targeting cytochrome b gene for the detection of dog meat adulteration in meatball formulation[J]. Meat Science， 2014， 97（4）： 404-409. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.03.011.

[13] 李麗娟， 王忻， 周建華， 等. 鑒別檢測狗源性成分的PCR檢測引物試劑盒及其檢測方法： CN201410101176.6[P]. 2015-03-18.

[14] 賈慧建， 王天添， 趙遠， 等. 肉制品中狗、狐、貂源性成分DNA檢測試劑盒的制備[J]. 肉類研究， 2021， 35（8）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210311-064.

[15] 王天添， 劉佳琳， 李亞晗， 等. 狗源性DNA檢測試劑盒的研制與評價[J]. 食品工業科技， 2020， 41（10）： 208-212. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2020.10.034.

[16] 高曉麗， 楊昕霆， 薛晨玉， 等. 實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中狗源性成分[J]. 食品工業科技， 2015， 36（2）： 61-64. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.004.

[17] EVANS J J， WICTUM E J， PENEDO M C， et al. Real-time polymerase chain reaction quantification of canine DNA[J]. Journal of Forensic Sciences， 2007， 52（1）： 93-96. DOI：10.1111/j.1556-4029.2006.00305.

[18] 劉艷艷， 李會榮， 胡悅， 等. 飼料中狐貍、水貂、貉子和狗源性的五重實時熒光PCR檢測方法的建立[J]. 中國生物工程雜志， 2017， 37（12）： 67-76. DOI：10.13523/j.cb.20171210.

[19] WU Q Q， XIANG S G， WANG W J， et al. Species identification of fox-， mink-， dog-， and rabbit-derived ingredients by multiplex PCR and real-time PCR assay[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2018， 185（1）： 1-12. DOI：10.1007/s12010-017-2621-2.

[20] WANG W J， WEI T A， SHI M N， et al. A novel universal primer multiplex real-time PCR （UP-M-rtPCR） approach for specific identification and quantitation of cat， dog， fox， and mink fractions using nuclear DNA sequences[J]. Foods， 2023， 12（3）： 594. DOI：10.3390/foods12030594.

[21] 韋濤， 黃繼錦， 黃惠琳， 等. 環介導等溫擴增與qPCR用于檢測肉制品中狗源性成分的比較[J]. 食品安全質量檢測學報， 2021， 12（8）： 3060-3070. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.08.014.

[22] CHEN Y， MEI Y， ZHAO X， et al. Reagents-loaded， automated assay that integrates recombinase-aided amplification and Cas12a nucleic acid detection for a point-of-care test[J]. Analytical Chemistry， 2020， 92（21）： 14846-14852. DOI：10.1021/acs.analchem.0c03883.

[23] WANG Z H， LI P， LIN X， et al. Application of portable real-time recombinase-aided amplification （rt-RAA） assay in the clinical diagnosis of ASFV and prospective DIVA diagnosis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2021， 105（8）： 3249-3264. DOI：10.1007/s00253-021-11196-z.

[24] 劉明明， 周朝旭， 顏海燕， 等. 利用雙重實時熒光重組酶輔助擴增技術快速檢測肉制品中鼠源性成分[J]. 肉類研究， 2024， 38（9）： 15-20. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240522-122.

[25] FAN X X， LI L， ZHAO Y G， et al. Clinical validation of two recombinase-based isothermal amplification assays （RPA/RAA） for the rapid detection of african swine fever virus[J]. Frontiers in Microbiology， 2020， 11： 1696. DOI：10.3389/fmicb.2020.01696.

[26] MOTA D S， GUIMARRAES J M， GANDARILLA A M D， et al. Recombinase polymerase amplification in the molecular diagnosis of microbiological targets and its applications[J]. Canadian Journal of Microbiology， 2022， 68（6）： 383-402. DOI：10.1139/cjm-2021-0329.