不同貯藏溫度下調理牛排菌群動態變化和相互作用

摘 要：為了解不同貯藏溫度下調理牛排微生物多樣性和細菌之間的相互作用關系，比較分析冷藏（4 ℃）和脫冷貯藏（15 ℃）牛排菌群結構。將新鮮調理牛排進行冷藏（4 ℃）和脫冷貯藏（15 ℃），基于傳統的微生物培養計數和高通量測序技術分析不同貯藏溫度下過保質期牛排菌群動態變化和相互作用。結果表明，牛排4 ℃貯藏下的菌落總數（7.4×108 CFU/g）極顯著低于15 ℃（5.2×109 CFU/g）（P＜0.001）。菌群動態變化結果表明，冷藏或脫冷貯藏不影響牛排菌群組成，但優勢菌屬發生更替。肉桿菌屬（Carnobacterium）、彎曲乳桿菌屬（Latilactobacillus）及假單胞菌屬（Pseudomonas）是2 種貯藏溫度下的優勢腐敗菌屬。索絲菌屬（Brochothrix）僅為4 ℃貯藏下的優勢菌屬，沙雷氏菌屬（Serratia）僅為15 ℃貯藏下的優勢菌屬。菌屬豐度相關性網絡中PageRank＞0.4且出現頻率最高的菌屬分別為不動桿菌屬（Acinetobacter）和索絲菌屬。不動桿菌屬與沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、索絲菌屬，沙雷氏菌屬與索絲菌屬，索絲菌屬與假單胞菌屬相對豐度在特定貯藏溫度和時間下存在相關性，這表明牛排腐敗菌之間存在潛在種間相互作用。索絲菌屬、彎曲乳桿菌屬及假單胞菌屬可能是牛排優勢腐敗菌。

關鍵詞：貯藏溫度；高通量測序技術；微生物多樣性；種間相互作用

Dynamic Changes and Interactions of Bacterial Communities in Processed Beef Steak at Different Storage Temperatures

SHI Na1， XING Chao1， SONG Liping1， MAO Ting2， DU Jianping1， LI Long3， GENG Jianqiang1，*， SUN Xiaodong1， YANG Limei1， LI Li1

（1. Beijing Institute of Food Inspection and Research （Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment）， Laboratory of Key Technologies of Major Comprehensive Guarantee of Food Safety for State Administration for Market Regulation， Beijing 100094， China; 2. Beijing Inspection and Testing Certification Center， Beijing 101300， China;

3. Beijing Institute of Metrology and Testing Science， Beijing 100029， China）

Abstract： In this study， we aimed to understand the bacterial diversity and interactions in processed beef steak at different storage temperatures. Comparative analysis of the bacterial community structure in chilled （4 ℃） and non-chilled （15 ℃） steak was performed， and the dynamic changes and interactions of bacterial communities in spoiled meat during storage at different temperatures after shelf life were analyzed using traditional microbial culture method and high throughput sequencing technology. The results showed that the total number of colonies was significantly lower at 4 ℃ than that at 15 ℃ （7.4 × 108 CFU/g versus 5.2 × 109 CFU/g） （P lt; 0.001）. The microbiota in steak was unaffected by storage temperature， but the dominant bacterial genera varied. Carnobacterium， Latilactobacillus and Pseudomonas were the dominant spoilage genera at both storage temperatures， Brochothrix being the only dominant genus at 4 ℃ and Serratia at 15 ℃. The results of microbial community abundance correlation network analysis showed that the genera with the highest frequency of occurrence at

PageRank gt; 0.4 were Acinetobacter and Brochothrix. There was a correlation between the relative abundance of Acinetobacter and that of Serratia， Pseudomonas， and Brochothrix， between the relative abundance of Serratia and that of Brochothrix， and between the relative abundance of Brochothrix and that of Pseudomonas at a certain storage temperature and time， indicating a potential interaction between steak spoilage bacteria. Brochothrix， Latilactobacillus and Pseudomonas may be dominant spoilage bacteria in steak.

Keywords： storage temperature; high throughput sequencing technology; bacterial diversity; inter-species interactions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241016-264

中圖分類號：TS251.52 " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2025）04-0030-10

引文格式：

史娜， 邢超， 宋麗萍， 等. 不同貯藏溫度下調理牛排菌群動態變化和相互作用[J]. 肉類研究， 2025， 39（4）： 30-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241016-264. " "http：//www.rlyj.net.cn

SHI Na， XING Chao， SONG Liping， et al. Dynamic changes and interactions of bacterial communities in processed beef steak at different storage temperatures[J]. Meat Research， 2025， 39（4）： 30-39. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241016-264. " "http：//www.rlyj.net.cn

2022年，中國牛肉市場消費量為9 86.1萬 t，位居全球第二。在牛排、生冷鮮牛肉、牛肉卷、牛肉丸等眾多牛肉產品中，國民對牛排的消費熱情持續升高。據《2022年牛排消費趨勢洞察》報告顯示，2021年線上牛排消費增速持續上漲，同比增長7 倍。牛肉中的水分和營養物質能夠為微生物提供生長條件，如假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動桿菌屬（Acinetobacter）等，這些微生物可導致牛肉腐敗[1-4]。因此，腐敗微生物的生長和代謝活動引起的牛肉腐敗成為肉類工業的關注熱點。

貯藏溫度是影響鮮肉貨架期的主要因素[5]。目前，冷藏與冷凍是最常用的2 種肉類貯藏方式，其對應溫度范圍分別為0～10、－18～－20 ℃[6]。盡管大多數國家已經規定了食品最高貯藏溫度限值，但據報道，由于配送系統、運輸距離和時間的不穩定性，運輸過程中的溫度可能達到10 ℃甚至更高。這種不受控制的溫度條件可能會顯著縮短肉類貨架期[7-8]。而且，一些鄉村市場的肉類仍然在室溫下露天保存，這無疑會增加肉類變質風險[9]。因此，有必要更深入地了解不同貯藏溫度下肉品中的微生物組成動態變化及其相互作用。

高通量測序技術和生物信息學分析技術為食品中可培養和不可培養細菌的研究提供了高效的分析工具，使全面描述菌群的動態變化、分析微生物代謝活動與肉類腐敗之間的相關性成為可能[10-11]。目前，已有關于采用高通量測序技術表征肉類腐敗中微生物組成的報道[12]，然而肉類菌群組成在不同貯藏溫度下的差異較大。目前，大多數研究集中在不同冷藏或過冷溫度（包括4、－1、－2、－3 ℃）或不同包裝方式（如氣調包裝）對菌群的影響[6，13-14]，比較脫冷貯藏下肉類菌群組成和種間相互作用的研究較為少見。

本研究將新鮮調理牛排分別進行冷藏（4 ℃）和脫冷貯藏（15 ℃），評估不同貯藏溫度與時間對牛排菌群組成的影響，旨在深入了解貯藏溫度對牛排菌群及菌種之間潛在相互作用的影響，確定牛排的關鍵致腐微生物。

1 材料與方法

1.1 材料

在北京大型商超采買3 個品牌的調理牛排（F1、F2、F3），共63 個樣品（每種品牌各21 個），樣品出廠日期均為當天，保質期2 d。

1.2 儀器與設備

BagMixer 400稀釋用電子秤、DiluFow基本型均質器 " 法國Interscience公司；HPX-25085-III恒溫恒濕箱 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

因從保質期內牛排中鑒定的高豐度細菌無法與腐敗建立有效聯系，因此本研究以不同溫度下長時間貯藏至過保質期的調理牛排為樣品，分別在冷藏（4 ℃）、脫冷（15 ℃）條件下貯藏，在保質期結束當天、過保質期3 d及過保質期6 d取樣，進行菌落總數測定和16S rRNA基因高通量測序。

1.3.2 菌落總數測定

參考GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》測定菌落總數。

1.3.3 16S rRNA基因高通量測序

1.3.3.1 PacBio文庫制備和測序

提取樣品總DNA后，根據全長引物序列合成帶有Barcode的特異性引物，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增并對其產物進行純化、定量和均一化，形成的測序文庫（SMRT Bell）質檢合格后，采用PacBio Sequel II進行測序。

1.3.3.2 數據預處理

將PacBio下機數據導出為CCS文件后，使用Lima v1.7.0軟件，通過Barcode對CCS進行識別，得到Raw-CCS序列數據。使用Cutadapt 1.9.1軟件對引物序列進行識別與去除，并進行長度過濾，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列。使用UCHME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective-CCS序列。

1.3.3.3 α-多樣性、主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）及屬水平網絡分析α-多樣性、PCoA及屬水平分布分析在BMKCloud中完成。其中，α-多樣性分類水平選擇屬，組間差異檢驗方法選擇Student’s t-test；PCoA分類水平選擇屬；屬水平分布分析選擇相對豐度前10。屬水平豐度相關性網絡圖基于R包igraph實現[15]，物種數量選擇前30，相關性類型選擇Spearman，相關系數閾值選擇|0.6|，顯著性水平選擇0.05。采用Gephi v.0.9.2對構建網絡圖的圖密度和PageRank值進行計算，圖密度反映菌屬之間相互作用程度，圖密度越大，表示菌屬之間相互作用越頻繁[16]。

1.4 數據處理

數據表示為平均值±標準差，多組間數據比較使用SPSS 24.0中方差分析的鄧肯多重范圍檢驗。使用R v.4.0.2軟件的Hmisc包對屬水平相對豐度的Pearson相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 調理牛排菌落總數

由圖1a可知，4 ℃貯藏下，菌落總數為7.4×108 CFU/g，顯著低于15 ℃貯藏下菌落總數（5.2×109 CFU/g），脫冷貯藏下調理牛排的菌落總數極顯著升高（P＜0.001），加速了其腐敗變質進程。

由圖1b～d可知，F1在出廠當天菌落總數為4.3×106 CFU/g。4 ℃和15 ℃貯藏下，在保質期當天，F1菌落總數分別為4.3×108 CFU/g和1.1×109 CFU/g；在過保質期3 d，F1菌落總數分別為1.5×109 CFU/g和1.0×109 CFU/g；在過保質期6 d，F1菌落總數分別為6.1×108 CFU/g和1.3×109 CFU/g。F2在出廠當天菌落總數為1.0×106 CFU/g。4 ℃和15 ℃貯藏下，在保質期當天，F2菌落總數分別為5.0×106 CFU/g和2.5×108 CFU/g；

在過保質期3 d，F2菌落總數分別為7.8×106 CFU/g和4.9×109 CFU/g；在過保質期6 d，F2菌落總數分別為8.5×108 CFU/g和7.9×109 CFU/g。F3在出廠當天菌落總數為2.3×107 CFU/g。4 ℃和15 ℃貯藏下，在保質期當天，F3菌落總數分別為2.3×108 CFU/g和1.2×1010 CFU/g；

在過保質期3 d，F3菌落總數分別為1.0×109 CFU/g和9.1×109 CFU/g；在過保質期6 d，F3菌落總數分別為1.7×109 CFU/g和5.9×109 CFU/g。目前，我國尚未針對生肉制定統一的菌落總數限量指標。歐盟、美國及日本規定每克牛肉需氧平板計數約在5.0×106 CFU/g以下，視為合格。由上述結果可知，本研究所取調理牛排F1和F2菌落總數在出廠當天均小于該限值，F3菌落總數則大于該限值。在保質期當天，僅4 ℃貯藏的F2菌落總數符合該限值標準，F1和F3菌落總數均大于該限值。15 ℃貯藏下的牛排細菌生長更快，可加速牛排腐敗變質。

2.2 調理牛排菌群α-多樣性

α-多樣性反映牛排菌群物種豐富度和多樣性[11]。Shannon指數用以描述菌群多樣性。Chao1指數用以描述菌群物種豐富度，其值越高，菌群物種豐富度越高。由表1、2可知，不同貯藏溫度和時間下，F1、F2、F3菌群多樣性均未發生顯著改變，這表明初始菌群中的部分細菌參與了牛排的腐敗變質過程，多種適應性強的細菌在牛排腐敗過程依然保持生長與繁殖。值得注意的是，F2菌群豐富度在一定程度上受到貯藏時間和溫度的影響，但與對照組相比差異不顯著。

2.3 調理牛排菌群屬水平相對豐度

本研究選擇相對豐度排名前10的菌屬（占總菌屬豐度的90%以上，為優勢菌屬）進行相對豐度分析。由圖2a可知，在出廠當天，F1中相對豐度排名前3的優勢菌屬分別為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）（52.4%）、肉桿菌屬（Carnobacterium）（15.3%）、索絲菌屬（Brochothrix）（13.5%）；F2中相對豐度排名前3的優勢菌屬分別為彎曲乳桿菌屬（Latilactobacillus）（34.8%）、肉桿菌屬（29.0%）、索絲菌屬（10.0%）；F3中相對豐度排名前3的優勢菌屬分別為肉桿菌屬（46.2%）、彎曲乳桿菌屬（20.1%）、索絲菌屬（12.6%）。其中，嗜冷桿菌屬、彎曲乳桿菌屬及肉桿菌屬分別為3 種牛排出廠時相對豐度最高的優勢菌屬。肉桿菌屬和索絲菌屬在3 種牛排中均為優勢菌屬。Liang Ce等[6]對不同貯藏溫度下新鮮羊肉菌群變化的研究顯示，冷藏（4 ℃）和過冷（－1.5 ℃）貯藏下索絲菌屬為優勢腐敗菌屬，嗜冷桿菌屬則為超冷（－4 ℃）和超冷凍

（－9 ℃）貯藏下的優勢腐敗菌屬。Fang Jinyu等[17]研究表明，Brochothrix thermosphata BT27為4 ℃好氧貯藏條件下牛肉的優勢腐敗菌。由此可見，本研究中出廠當天牛排已存在報道的腐敗菌屬。

a.出廠當天；b、c.分別為4 ℃和15 ℃貯藏下保質期當天；d、e.分別為4 ℃和15 ℃貯藏下過保質期3 d；f、g.分別為4 ℃和15 ℃下過保質期6 d。圖3、4、6、7同。

圖 2 不同貯藏溫度和時間下調理牛排優勢菌屬分布

Fig. 2 Distribution of dominant bacterial genera in processed beef steak at different temperatures and times

由圖2b、c可知，在保質期當天，與4 ℃貯藏相比，脫冷貯藏并不影響F1、F2與F3的菌群組成，但不同貯藏溫度下牛排優勢菌屬存在差異。具體地，4 ℃貯藏F1中相對豐度最高的優勢菌屬為索絲菌屬（34.1%），F2、F3中相對豐度最高的優勢菌屬均為彎曲乳桿菌屬（F2：56.5%，F3：61.1%）；15 ℃貯藏下F1、F3中相對豐度最高的優勢菌屬均為彎曲乳桿菌屬（F1：41.8%，F3：74.9%），F2中相對豐度最高的優勢菌屬為肉桿菌屬（63.2%）。

由圖2d、e可知，在過保質期3 d時，4 ℃和15 ℃貯藏下牛排均已徹底腐敗。4 ℃貯藏F1、F2、F3中相對豐度最高的優勢菌屬分別為索絲菌屬（51.5%）、肉桿菌屬（67.0%）、彎曲乳桿菌屬（43.8%），這與出廠當天、保質期當天牛排的優勢菌屬類似。15 ℃貯藏F1、F2、F3中相對豐度最高的優勢菌屬分別為彎曲乳桿菌屬（40.2%）、假單胞菌屬（78.3%）、沙雷氏菌屬（Serratia）（30.2%），表明過保質期后15 ℃貯藏牛排的優勢腐敗菌發生改變。

由圖2f、g可知，過保質期6 d時，隨著腐敗程度的增加，4 ℃貯藏F1、F3中相對豐度最高的優勢菌屬均為索絲菌屬（F1：54.8%，F3：32.1%），F2中相對豐度最高的優勢菌屬為假單胞菌屬（86.8%）；15 ℃貯藏F1、F3中相對豐度最高的則為彎曲乳桿菌屬（F1：41.3%，F3：33.9%），F2中相對豐度最高的優勢菌屬仍為假單胞菌屬（45.9%）。

對比可知，4 ℃貯藏時，F1中的索絲菌屬豐度逐漸升高，而15 ℃貯藏時，F1中的彎曲乳桿菌屬則始終為相對豐度最高的優勢菌屬；F2中相對豐度最高的優勢菌屬的出現受冷藏影響呈現滯后性，即假單胞菌屬在過保質期6 d時成為相對豐度最高的優勢菌屬，而在15 ℃貯藏時這一現象過保質期3 d便已出現。F3中優勢菌屬在2 種貯藏條件下呈現類似的動態演替，即在保質期當天出現相對豐度最高的優勢菌屬，隨著貯藏時間的延長，更多細菌出現相對豐度增高的現象。肉類涉及分切、運輸、銷售等諸多環節，可能導致樣品中不同細菌豐度存在差異[18-20]。然而，本研究所抽取的F1和F3中的菌群結構在4 ℃和15 ℃貯藏下比較穩定，優勢菌屬的相對豐度變化明顯，未引入新的優勢菌屬。這可能是由于從生產到銷售過程中F1和F3處于較為穩定的環境，而F2在貯藏過程中，優勢菌屬發生改變，可能是由細菌種間的相互作用引起的生態位競爭所導致。

2.4 調理牛排菌群PCoA

由圖3可知，在出廠當天，3 個品牌牛排樣品的置信區間相交，表明此時各樣品菌群組成相似。隨著貯藏時間的延長，4 ℃和15 ℃下，F1、F2、F3牛排樣品各自聚類，表明3 個品牌的牛排菌群組成出現差異。

2.5 調理牛排菌群屬水平豐度相關性網絡

為探究腐敗過程中低豐度菌屬與高豐度細菌屬之間的相關性，對F1、F2、F3菌屬相對豐度進行相關性分析，以相對豐度前30的菌屬構建豐度相關性網絡，見圖4。

由圖5可知，保質期當天、過保質期3 d與過保質期6 d牛排在4 ℃和15 ℃下的菌屬豐度相關性網絡圖的圖密度均高于出廠當天，表明隨著貯藏時間的延長，細菌之間豐度變化更為復雜。此外，4 ℃貯藏下，相關性網絡圖的圖密度明顯大于15 ℃，這表明4 ℃貯藏牛排中細菌之間的相互作用更加頻繁與復雜。

性[21-23]。由圖6可知，PageRank值排名前5的菌屬中，不動桿菌屬和索絲菌屬出現頻率最高，共在5 個網絡圖中出現。不動桿菌屬在4 ℃下的2 個網絡圖中出現。雖然不動桿菌屬并不是優勢菌屬，但相關性網絡分析結果提示其重要性，強調非優勢菌屬在牛排腐敗進程中也具有關鍵作用。已有研究[24-27]表明，不動桿菌屬能夠造成冷藏期間南美白對蝦、金槍魚、冰鮮雞肉及水煮小龍蝦等多種食品基質腐敗。

微生物群落并非由眾多微生物簡單拼湊而成，而是不同物種間通過資源競爭、代謝互補、信號交流和基因水平轉移等相互作用形成的高度復雜的生態系統。微生物群落在地球化學元素馴化、農業生產和人類健康等領域承擔著重要功能[28-29]。在食品領域，微生物平衡體系與食品腐敗密切相關。Andreevskaya等[30]探究3 種嗜冷乳酸菌（Leuconostoc gelidum、Lactococcus piscium和Lactobacillus oligofermentans）在肉類腐敗中的相互作用發現，3 種嗜冷乳酸菌的種間相互作用強烈影響碳水化合物分解代謝/運輸、發酵、能量產生和翻譯相關基因表達。Joishy等[31]通過構建生凝乳（由生乳制備的凝乳）、煮沸乳與凝乳的核心細菌共生網絡發現，凝乳中Lactobacillus豐度具有優勢，且與Enterococcus、Streptococcus及Leuconostoc豐度呈負相關，推測與其內部存在生態位競爭有關。對與相關性網絡圖中關鍵節點菌屬相對豐度呈現正/負相關的菌屬進行統計，由圖7可知，優勢腐敗菌屬相對豐度和關鍵節點菌屬相對豐度之間存在相關性。例如，出廠當天牛排菌群相關性網絡中，不動桿菌屬與沙雷氏菌屬相對豐度相關性為0.72，保質期當天（4 ℃）的不動桿菌屬與假單胞菌屬、索絲菌屬相對豐度相關性分別為0.75、0.78，沙雷氏菌屬和索絲菌屬相v對豐度相關性為0.75。4 ℃貯藏下，過保質期3 d時不動桿菌屬與索絲菌屬相對豐度相關性為0.83，過保質期6 d時不動桿菌屬與假單胞菌屬、索絲菌屬的相關性分別為－0.87、0.80；15 ℃貯藏下，過保質期3 d時索絲菌屬與假單胞菌屬相對豐度相關性為－0.83。這表明致腐細菌在牛排腐敗過程中可能存在相互作用。值得注意的是，4 ℃貯藏下，保質期當天不動桿菌和假單胞菌相對豐度呈現正相關性，而在過保質期后，不動桿菌和假單胞菌相對豐度呈現負相關，提示致腐菌之間可能也存在相互競爭。

3 結 論

索絲菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、肉桿菌屬及彎曲乳桿菌屬是牛排在不同貯藏溫度與時間下的優勢菌屬。其中，肉桿菌屬、彎曲乳桿菌屬及假單胞菌屬為4、15 ℃下的優勢菌屬。而索絲菌屬僅在4 ℃下成為優勢菌屬、沙雷氏菌屬僅在15 ℃下成為優勢菌屬，表明不同貯藏溫度下牛排腐敗菌群組成存在差異。不動桿菌屬與沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、索絲菌屬，沙雷氏菌屬與索絲菌屬，索絲菌屬與假單胞菌屬相對豐度在特定貯藏溫度和時間下存在相關性，表明牛排腐敗菌之間存在潛在相互作用，這一結果提供了肉類腐敗菌種間相互作用的高通量測序證據。本研究可為牛排質量控制中腐敗菌評估體系的完善提供理論基礎。

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