濕氣處理對絲素蛋白甲酸溶液鹽析法制備支架材料的影響

摘要：絲素蛋白支架材料在組織工程領域中極具應用前景，其力學性能對組織再生修復中細胞的增殖、分化及生長過程具有至關重要的影響。文章以CaCl2-甲酸為溶劑溶解脫膠蠶絲后，采用鹽析法制備絲素蛋白支架是一種有效且簡便的方法，所制備的支架材料具有較高的壓縮模量和強度，但由于高質量分數甲酸對絲素蛋白具有顯著的促結晶作用，反向的低壓縮模量和強度調控并不易實現。對此，文章通過對絲素蛋白甲酸溶解液進行加濕處理，稀釋溶解液中甲酸的質量分數，實現了對絲素蛋白支架材料力學性能的反向調控。研究結果表明，引入加濕處理環節后，所制備的絲素蛋白支架材料具有良好穩定的成形性，孔隙率約90%，孔壁由絲素蛋白微球組成，壓縮模量和強度隨著加濕處理時間的增加而逐漸降低，有效實現了其力學性能可調控性，期望能夠促進適用于不同組織再生絲素蛋白支架材料的設計制備。

關鍵詞：絲素蛋白；支架材料；甲酸；鹽析法；濕氣處理；力學性能調控

中圖分類號：TS102.33；R318.08

文獻標志碼：A

文章編號：1001-7003（2025）04-0054-11

DOI：10.3969j.issn.1001-7003.2025.04.007

收稿日期：2024-09-21;

修回日期：2025-02-26

基金項目：國家自然科學基金項目（51763001）；廣西自然科學基金項目（2024GXNSFAA010390）；廣西研究生教育創新計劃項目（YCSW2023476）

作者簡介：翁敏儀（1999），女，碩士研究生，研究方向為蠶絲工程及絲蛋白基新材料。通信作者：黃繼偉，教授，huangjiwei@gxust.edu.cn。

作為組織工程的三大核心組件之一，支架材料在支持接種細胞的增殖、分化及黏附生長方面發揮著至關重要的作用。理想的支架材料應當具備優異的生物相容性、可調控的生物降解速率、相互連通的三維網絡結構、適當的可塑性和力學性能［1］。滿足組織工程支架材料要求的原材料，包括膠原、殼聚糖、透明質酸、明膠和絲素蛋白等，均已被廣泛研究［2-5］。其中，絲素蛋白作為一種來源于天然蠶絲的可再生資源，具有生物相容性好、無毒、低免疫原性、易于功能化修飾和良好的結構可調控性等優點，已廣泛應用于皮膚、血管、韌帶、軟骨、骨骼和神經等多種組織再生及臨床研究領域［6-7］。

鹽析法是一種高效制備組織工程支架材料的方法［8］，該方法首先需要將脫膠蠶絲溶解，制備特定質量分數的絲素蛋白溶液；隨后，在絲素蛋白溶液中加入特定尺寸的鹽顆粒（如NaCl），在此過程中，絲素蛋白大分子發生凝聚和結晶化轉變，在攪拌的作用下，絲素蛋白可逐粒包裹鹽顆粒形成固態復合體；最后，通過將含有鹽顆粒的絲素蛋白固態復合體浸泡于水中，易溶于水的鹽分被析出，而包裹于鹽顆粒表面的絲素蛋白則保持其原有形態，形成相互連通的三維多孔結構。相較于冷凍干燥法制備的絲素蛋白支架材料，鹽析法所制備的絲素蛋白支架材料具有更大更均勻的孔隙尺寸和更為豐富的孔壁微結構，更有利于細胞的遷移和組織的再生［9-10］。

作為制備絲素蛋白支架材料的首要步驟，絲素蛋白的溶解及其溶液性狀對絲素蛋白支架材料的成形及性能起著至關重要的作用。已有研究證實，細胞能夠感知支架材料的力學信號，并對感知到的信號做出反應，即支架材料的力學特性對細胞的生物學行為有影響［11-13］。故此，對支架材料力學性能的調控是支架材料制備與應用研究的重要內容。呂強團隊［14］以9.3 M LiBr為溶劑制備絲素蛋白水溶液，并將所制備的絲素蛋白水溶液經歷“濃縮-稀釋”過程，形成質量分數約為5%的絲素蛋白水溶液，再以NaCl為致孔劑制備了絲素蛋白支架材料；結果顯示，通過濃縮和稀釋過程所形成的絲素蛋白支架材料具有良好的柔韌性和親水性，且可實現對絲素蛋白支架材料的力學性能調控。左保齊團隊［15］則以CaCl2-甲酸為溶劑，分別得到質量分數為10%～40%的絲素蛋白甲酸溶液，最后以此為原液加入NaCl，制備得到鹽析法的絲素蛋白支架材料；結果顯示，所制備的絲素蛋白支架材料具有較高的結晶度，抗壓縮性能極為優異，這與甲酸具有顯著的促絲素蛋白結晶的作用有關［16］，正因如此，對以甲酸為溶劑所制備絲素蛋白支架材料的反向低壓縮模量和強度調控并不易實現。

本文以CaCl2-甲酸為溶劑制備絲素蛋白甲酸溶解液，通過引入加濕處理環節，降低溶液中甲酸的質量分數，稀釋絲素蛋白的質量分數，并以此為原液制備鹽析法（以NaCl為致孔劑）絲素蛋白支架材料，以期降低絲素蛋白結晶度，提高絲素蛋白支架材料的柔韌性和親水性，實現對絲素蛋白支架材料力學性能的調控。

1 實 驗

1.1 材 料

22.2224.44 dtex桑蠶生絲（柳州市昌海繭絲有限責任公司）。99%無水碳酸鈉（西隴科學股份有限公司），96%無水氯化鈣、98%甲酸、顆粒粒徑為280～500 μm氯化鈉、99.7%無水乙醇，蛋白酶XIV（上海麥克林生化科技股份有限公司），所用化學試劑與藥品均為分析純。10×PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀 器

AR224CN型電子天平（奧豪斯儀器有限公司），XMA-600電熱鼓風干燥箱（余姚市正泰儀表有限公司），FJS- 6型磁力攪拌水浴鍋（金壇市城西富威實驗儀器廠），PT-1198 型電子萬能試驗機（東莞市寶大儀器有限公司），RS-201型磁力攪拌器（廣東窯聲電器股份有限公司），TF-FD- 1型冷凍干燥機（上海田楓實業有限公司），Sigma 300型場發射掃描電鏡（德國蔡司公司），X’Pert Pro型全自動X射線衍射儀（荷蘭PANalytical公司）， STA 449F5 Jupiter同步熱分析儀（德國耐馳儀器制造有限公司），傅里葉變換紅外光譜儀（熒颯光學科技有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 桑蠶生絲的脫膠

采用堿法對桑蠶生絲進行脫膠，具體流程為：取指定質量的桑蠶生絲，置于含有質量分數為0.5%的碳酸鈉水溶液中，沸煮30 min，浴比為1∶200，沸煮結束后，用清水清洗3次。以上步驟重復3次，之后將經過脫膠后的蠶絲晾干，備用。

1.3.2 脫膠蠶絲的溶解

1）分別稱取指定質量的無水CaCl2和甲酸置于燒杯中，待無水氯化鈣完全溶解后，得到CaCl2-甲酸溶劑，其中無水CaCl2的質量分數為3%。

2）稱取指定質量脫膠蠶絲置于步驟1所制備的質量分數為3%的CaCl2-甲酸溶劑中，再利用磁力攪拌器對其持續攪拌約2 h，至脫膠蠶絲完全溶解，得到絲素蛋白-CaCl2-甲酸混合溶解液，其中絲素蛋白的質量分數為10%。

1.3.3 絲素蛋白支架材料的制備

1）將完全溶解的絲素蛋白-CaCl2-甲酸混合溶解液置于敞口容器中，并將其放置于自制的裝置進行加濕處理，處理時間分別為1、2、3、4、5 h和6 h。通過改變絲素蛋白甲酸溶解液的加濕處理時長，實現對溶解液內甲酸質量分數的控制，基于此探究其對絲素蛋白支架材料力學性能的調控作用。

2）將指定質量指定粒徑的NaCl顆粒分別加入至經過濕氣處理的混合溶解液中，加入NaCl顆粒的質量濃度分別為2 gmL和3 gmL。

3）用玻璃棒將加入了NaCl顆粒的混合溶液充分攪拌均勻，使絲素蛋白均勻包裹鹽顆粒，之后分別填充于24孔板中，放入通風櫥中2 d，使其形成塊狀固態復合體。

4）將所制備的塊狀固態復合體放入去離子水以去除NaCl和 CaCl2及殘留的甲酸，每6 h換水一次，時間為3 d，得到柱狀支架材料。

1.3.4 掃描電鏡觀察（SEM）

用刀片從所制備的絲素蛋白支架材料圓柱的中部截取厚度約3 mm的扁平層，用導電膠將其粘貼于樣品臺，并進行噴金處理，噴金時間為60 s；之后置于Sigma 300型場發射掃描電鏡進行觀察，其中測試電壓為10 kV。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測試（FTIR）

取一小塊絲素蛋白支架材料，使用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行測試，范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數16次。

1.3.6 X射線衍射測試（XRD）

用剪刀將待測絲素蛋白支架材料樣品剪成粉末狀，采用X’Pert-Pro型全自動X射線衍射儀進行測試，X射線光源為Cu-Kα射線，電壓40 kV，電流40 mA，掃描速度10 °min，掃描范圍5 °～50 °。

1.3.7 熱學性能測試（TGADSC）

用剪刀將待測絲素蛋白支架材料剪成粉末狀，使用STA 449F5 Jupiter同步熱分析儀對所得粉末進行熱力學測試，升溫速率為10 ℃min，溫度從室溫到800℃，測試環境為氮氣環境，氮氣流速為20 mLmin。

1.3.8 孔隙率

用液體置換法［17］對所制備的絲素蛋白支架材料的孔隙率進行測量。步驟為：將冷凍干燥后的支架放入體積為V0的無水乙醇溶液中，當樣品被溶液完全浸沒時測得總體積為V1，然后取出樣品記錄此時剩余的無水乙醇溶液體積為V2。每組樣品測量3次并取平均值，根據下式計算孔隙率e（%）。

e%=V0-V2V1-V2×100

（1）

1.3.9 力學性能測試

在進行力學性能測試前，先用游標卡尺對待測的絲素蛋白支架材料的尺寸進行測量，本文所述方法制備的絲素蛋白支架材料為直徑約15 mm、高7～12 mm的圓柱體；然后，將待測的絲素蛋白支架材料置于去離子水中浸泡10 min；之后置于PT-1198 型電子萬能試驗機上進行濕態壓縮測試，其中水平頭下壓速度設定為3 mmmin，當壓縮變形達到絲素蛋白支架材料高度的60%時停止下壓。

1.3.10 體外降解測試

稱量一定量的絲素蛋白支架材料樣品，記為M0；將樣品放入0.01 molL PBS 溶液（含1.0 UmL蛋白酶 XIV），浴比 1∶99。之后將裝有樣品的離心管密封后置于37℃的恒溫水浴振蕩箱中，降解期間每 3 d更換一次降解液，降解液現配現用。設定的降解時間節點是 3、7、14 d，在預定的時間點將剩余樣品取出，去離子水浸潤洗滌去除降解液中殘留物，干燥后稱重M1，根據下計算降解率W（%）。

W%=M0-M1M0×100

（2）

2 結果與分析

2.1 形貌分析

圖1為不同加濕處理時間（1、2、3、4、5 h和6 h）及不同致孔劑添加量（2 gmL和3 gmL）工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的微觀形貌。

由圖1可以看出，所制備絲素蛋白支架材料呈現多孔網絡結構，孔徑約150～400 μm，孔壁上也存在許多不規則小孔，這是絲素蛋白溶液不完整或不均勻包裹致孔劑顆粒所形成。這些孔洞為氧氣、營養物質、代謝物質、信號分子及細胞廢物等的運輸提供了微環境，有利于細胞的增殖、分化和生長。

進一步地觀察所制備絲素蛋白支架材料的孔壁發現，孔壁由絲素蛋白微球組成，微球直徑約10～40 nm，如圖2所示。圖2（a）為孔壁表面的微觀形貌，圖2（b）為制備時自然形成的孔壁邊緣處的微觀形貌，圖2（c）為孔壁剪斷面的微觀形貌。通過大量觀察可知，這些絲素微球是普遍存在，并不僅限于某一特定部位。這些微球間存在間隙，顯著增加了絲素蛋白支架材料的比表面積，構建出層級多孔結構，增強了孔洞間聯系，更有利于細胞的增殖、生長和遷移。

2.2 結構分析

2.2.1 FTIR分析

圖3為不同加濕處理時間及不同致孔劑添加量工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的FTIR圖譜。其中，曲線a～f依次對應加濕處理時間1～6 h。

對于絲素蛋白材料的FTIR圖譜，1 700 cm-1～1 600 cm-1對應絲素蛋白的酰胺I區，1 600 ～1 500 cm-1對應絲素蛋白的酰胺Ⅱ區，1 350～1 200 cm-1對應絲素蛋白的酰胺III區，這些FTIR區域被廣泛應用于絲素蛋白材料的結構分析。由圖3可知，當致孔劑添加量為2 gmL時，酰胺I區的1 623 cm-1處存在尖峰，主要由于存在CO和C—N的伸縮振動，N—H平面中彎曲也有部分影響；酰胺Ⅱ區的1 511 cm-1處存在尖峰，主要歸因于N—H平面中彎曲并具有C—N伸縮振動；酰胺Ⅲ區的1 230 cm-1處存在尖峰，主要由于存在C—N伸縮振

動且具有N—H平面中彎曲。相對而言，當致孔劑添加量為3 gmL時，酰胺I區的尖峰偏至1 620 cm-1處，酰胺Ⅱ區的尖峰偏至1 514 cm-1處，這說明致孔劑添加量對絲素蛋白支架材料的二級結構存在影響。

為了進一步明確不同加濕處理時間及不同致孔劑添加量對所制備絲素蛋白支架材料二級結構的影響，基于塔夫斯大學的Hu等［18］所總結的方法，本文對絲素蛋白支架材料FTIR圖譜的酰胺I區進行分峰擬合處理，分峰擬合如圖4所示，二級結構含量分析如表1所示。

由表1可知，隨著加濕處理時間的增加，所制備絲素蛋白支架材料的β折疊含量存在下降趨勢，而β轉角含量存在增加趨勢，但變化幅度較小。分析認為，隨著加濕處理時間的增加，絲素蛋白-甲酸溶液中的甲酸質量分數下降，而甲酸對絲素蛋白具有促β折疊化的作用，其質量分數的下降，減弱了絲素蛋白的β折疊化。另一方面，致孔劑添加質量濃度為3 gmL時絲素蛋白支架材料的β折疊含量和β轉角含量均略高于致孔劑添加質量濃度為2 gmL時制備的材料，這說明致孔劑添加的增加有利于促進絲素蛋白向β折疊構象轉變。

2.2.2 XRD分析

圖5為不同加濕處理時間及不同致孔劑添加量工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的XRD圖譜。其中，曲線a～f與圖3相同。

由圖5可見，不同加濕處理時間所制備的絲素蛋白支架材料的XRD圖譜并無顯著差異，均為Silk II結晶結構；而對比不同致孔劑添加量所制備的絲素蛋白支架材料時可以看出，當致孔劑添加量由2 gmL增加至3 gmL時，絲素蛋白支架材料的3個主要衍射峰存在微弱的偏移，9.4°偏至9.2°，20.4°偏至20.6°，24.5°偏至24.6°，且3 gmL時9.2°衍射峰較2 gmL時9.4°衍射峰的峰形更加尖銳，這說明致孔劑添加量增加，絲素蛋白支架材料的結晶性略有提高，這與FTIR的分析結果一致。根據塔夫斯大學的Kim等［19］的分析，鹽析法制備絲素蛋白支架材料時，作為致孔劑的NaCl可促進絲素蛋白中占主導地位的疏水區域的水分流失，導致絲素蛋白大分子鏈之間的相互作用增強，促進了β折疊的形成。

2.3 熱學性能分析

圖6為不同加濕處理時間及不同致孔劑添加量工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的熱分析圖譜。其中，曲線a～f與圖3相同。

由圖6（a）（b）可以看出，絲素蛋白支架材料的熱失重率差異不大，呈現相似的變化趨勢，其中110℃之前主要表現為材料中水分的散失，265℃開始材料出現熱分解。由圖6（c）（d）可知，絲素蛋白支架材料的最速熱分解出現在290～294℃附近。通過對比發現，加濕處理時間為1 h時所制備的絲素蛋白支架材料較其他加濕處理時間時的最速熱分解溫度略高，而致孔劑添加質量濃度為3 gmL時所制備的絲素蛋白支架材料的最速熱分解溫度亦略高于致孔劑添加質量濃度為2 gmL時所制備的材料。材料的熱分解與其結晶結構有關，通常認為結晶區分子排列緊密，分子間作用力強，使得其具有比非結晶區更好的熱穩定性。由圖6（e）（f）可知，致孔劑添加質量濃度為2 gmL時所制備的絲素蛋白支架材料在289℃附近出現吸熱峰，而致孔劑添加質量濃度為3 gmL時所制備的絲素蛋白支架材料的吸熱峰則出現在291℃附近。上述現象進一步佐證，隨著加濕處理時間的增加，絲素蛋白的β折疊化程度存在減弱，而致孔劑添加量增加，則有利于提高絲素蛋白支架材料的結晶化。這與FTIR和XRD的結論基本一致。

2.4 力學性能分析

圖7為不同加濕處理時間及不同致孔劑添加量工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的濕態壓縮應力應變曲線。

支架的力學性能與其二級結構有關。由表2可以看出，隨著加濕處理時間的增加，絲素蛋白支架材料的壓縮強度和

壓縮模量存在逐漸減少的趨勢。在相同加濕處理時間條件下，致孔劑添加質量濃度為3 gmL時所制備絲素蛋白支架材料的壓縮模量略高于致孔劑添加質量濃度為2 gmL時所制備的材料。這與FTIR、XRD和熱學分析的結論基本一致。實驗結果證明，引入加濕處理環節，制備的絲素蛋白支架材料，

具備廣泛的力學調控范圍，壓縮強度從5.75～15.23 kPa，壓縮模量從12.58～34.29 kPa，此范圍對骨組織細胞的生長和分化具有重要意義［20-21］。

2.5 孔隙率分析

圖8為不同加濕處理時間及不同致孔劑添加量工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的孔隙率測試結果。

由圖8可以看出，隨著加濕處理時間的增加，絲素蛋白支架材料的孔隙率并不存在顯著性差異。當加濕處理時間為1 h時，材料的孔隙率約83%；當加濕處理時間超過1 h后，材料孔隙率均超過90%，最大可達93%。在相同加濕處理時間條件下，致孔劑添加質量濃度為3 gmL時所制備絲素蛋白支架材料的孔隙率與致孔劑添加質量濃度為2 gmL時所制備的材料之間亦無顯著性差異。高度孔隙率可為細胞黏附、遷移和生長提供高比表面積，是組織工程支架材料的重要特征之一，本文所制備的支架材料孔隙率均在80%以上，可滿足細胞黏附、遷移和生長的需要。

2.6 體外降解分析

圖9為加濕處理時間6 h及不同致孔劑添加量工藝條件下制備絲素蛋白支架材料的酶降解測試結果。

通過對比圖9發現，致孔劑添加質量濃度為3 gmL所制備絲素蛋白支架材料的降解速度略快于致孔劑添加質量濃度為2 gmL時所制備的材料。當致孔劑添加質量濃度為2 gmL和致孔劑添加質量濃度為3 gmL制備的絲素蛋白支架材料在37℃的蛋白酶XIV中降解，降解3 d后質量損失分別為8.7%和1.7%，降解7 d后其質量損失約12%和18.7%，降解14 d后質量分別損失了34.4%和40.2%。通過對比發現，致孔劑添加質量濃度為3 gmL所制備絲素蛋白支架材料的降解速度略快于致孔劑添加質量濃度為2 gmL時所制備的材料。致孔劑添加質量濃度為3 gmL所制備絲素蛋白支架材料β折疊含量和β轉角含量均略高于致孔劑添加質量濃度為2 gmL時制備的材料。降解初期，非晶體和不穩定晶體結構首先在蛋白酶 XIV 溶液中降解，所以降解初期致孔劑添加質量濃度為2 gmL時制備的材料的降解率略高。另一方面，絲素蛋白的降解并不總是與β含量成正比［22］。降解的速度取決于許多因素，包括絲素蛋白的分子量分布及二級結構相關的化學、物理和生物因素等［23-25］。

圖10為加濕處理6 h、致孔劑添加質量濃度為3 gmL制備的絲素蛋白支架材料在37 ℃的蛋白酶XIV中降解14 d后的形貌。由圖10可知，絲素蛋白支架材料存在明顯的降解狀態，其孔壁表面出現了大量空洞，孔壁截面亦出現了降解導致的孔洞。

3 結 論

以CaCl2-甲酸為溶劑溶解脫膠蠶絲后，采用鹽析法制備絲素蛋白支架具有較高的壓縮模量和強度，但由于高質量分數甲酸對絲素蛋白具有顯著的促結晶作用，反向的低壓縮模量和強度調控并不易實現。對此，本文在制備過程中引入了加濕處理環節，通過對絲素蛋白甲酸溶解液進行加濕處理，稀釋溶解液中甲酸的質量分數，實現了對絲素蛋白支架材料力學性能的反向調控。主要結論如下：

1）加入加濕處理后，所制備的絲素蛋白支架材料具有良好且穩定的成形性，孔隙率約90%，孔壁由絲素蛋白微球組成，具有可控的生物降解性能。

2）絲素蛋白支架材料的壓縮模量和強度隨著加濕處理時間的增加而逐漸降低，通過調控加濕處理時間，所得具備廣泛的力學調控范圍壓縮強度從5.75～15.23 kPa，壓縮模量從12.58～ 34.29 kPa。

此方法巧妙運用了加濕處理稀釋絲素蛋白甲酸溶解液中甲酸的質量分數，制備出具有大量絲素蛋白微球組成的絲素蛋白支架材料，有效地增強了其力學性能的可調控性，增大了壓縮模量的調控范圍，為設計適合不同組織再生的絲素蛋白支架材料提供了一種有前途的新方法。

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參考文獻：

［1］NAZAROV R， JIN H J， KAPLAN D L. Porous 3-D scaffolds from regenerated silk fibroin［J］. Biomacromolecules， 2004， 5（3）： 718-726.

［2］ZHAO W G， CAO S Y， CAI H X， et al. Chitosansilk fibroin biomimic scaffolds reinforced by cellulose acetate nanofibers for smooth muscle tissue engineering［J］. Carbohydrate Polymers， 2022， 298： 120056.

［3］SUN K， LI H， LI R X， et al. Silk fibroincollagen and silk fibroinchitosan blended three-dimensional scaffolds for tissue engineering［J］. European Journal of Orthopaedic Surgery amp; Traumatology， 2015， 25（2）： 243-249.

［4］ASADPOUR S， KARGOZAR S， MORADI L， et al. Natural biomacromolecule based composite scaffolds from silk fibroin， gelatin and chitosan toward tissue engineering applications［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 154： 1285-1294.

［5］PERNG C K， WANG Y J， TSI C H， et al. In vivo angiogenesis effect of porous collagen scaffold with hyaluronic acid oligosaccharides［J］. Journal of Surgical Research， 2011， 168（1）： 9-15.

［6］ZULUAGA-VéLEZ A， QUINTERO-MARTINEZ A， OROZCO L M， et al. Silk fibroin nanocomposites as tissue engineering scaffolds： A systematic review［J］. Biomedicine amp; Pharmacotherapy， 2021， 141： 111924.

［7］李艾元， 施心雨， 岳萬福. 絲素支架在肌肉骨骼組織工程的應用及研究進展［J］. 絲綢， 2021， 58（11）： 18-22.

LI A Y， SHI X Y， YUE W F. Application and research progress of silk fibroin scaffold in musculoskeletal tissue engineering［J］. Journal of Silk， 2021， 58（11）： 18-22.

［8］YAO D Y， DONG S， LU Q， et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties［J］. Biomacromolecules， 2012， 13（11）： 3723-3729.

［9］SOMMER M R， VETSCH J R， LEEMANN J， et al. Silk fibroin scaffolds with inverse opal structure for bone tissue engineering［J］. Journal of Biomedical Materials Research Part B： Applied Biomaterials， 2017， 105（7）： 2074-2084.

［10］LU Q， WANG X L， LU S Z， et al. Nanofibrous architecture of silk fibroin scaffolds prepared with a mild self-assembly process［J］. Biomaterials， 2011， 32（4）： 1059-1067.

［11］DISCHER D E， JANMEY P， WANG Y L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate［J］. Science， 2005， 310（5751）： 1139-1143.

［12］HU X， PARK S H， GIL E S， et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials［J］. Biomaterials， 2011， 32（34）： 8979-8989.

［13］PEK Y S， WAN A C A， YING J Y. The effect of matrix stiffness on mesenchymal stem cell differentiation in a 3D thixotropic gel［J］. Biomaterials， 2010， 31（3）： 385-391.

［14］姚丹語. 力學性能可調的絲蛋白支架的研究［D］. 蘇州： 蘇州大學， 2014.

YAO D Y. Silk Scaffolds With Controllable Mechanical and Secondary Structure［D］. Suzhou： Soochow University， 2014.

［15］楊日成. 絲素羥基磷灰石復合骨修復材料研究［D］. 蘇州： 蘇州大學， 2019.

YANG R C. Study on Silk FibroinHydroxyapatite Composite for Bone Repair Materials［D］. Suzhou： Soochow University， 2019.

［16］梁蘇平， 何秀萍， 牛翔宇， 等. 甲酸對絲素蛋白結晶結構轉變的影響［J］. 絲綢， 2024， 61（3）： 44-54.

LIANG S P， HE X P， NIU X Y， et al. Effect of formic acid on the crystalline structure transformation of silk protein［J］. Journal of Silk， 2024， 61（3）： 44-54.

［17］XIAO L Y， LIU S S， YAO D Y， et al. Fabrication of silk scaffolds with nanomicroscaled structures and tunable stiffness［J］. Biomacromolecules， 2017， 18（7）： 2073-2079.

［18］HU X， KAPLAN D， CEBE P. Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy［J］. Macromolecules， 2006， 39（18）： 6161-6170.

［19］KIM U J， PARK J， JOO KIM H， et al. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin［J］. Biomaterials， 2005， 26（15）： 2775-2785.

［20］GAHARWAR A K， SINGH I， KHADEMHOSSEINI A. Engineered biomaterials for in situ tissue regeneration［J］. Nature Reviews Materials， 2020， 5（9）： 686-705.

［21］HUEBSCH N， ARANY P R， MAO A S， et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cellmatrix interface to control stem-cell fate［J］. Nature Materials， 2010， 9（6）： 518-526.

［22］RAJKHOWA R， HU X， TSUZUKI T， et al. Structure and biodegradation mechanism of milled bombyx mori silk particles［J］. Biomacromolecules， 2012， 13（8）： 2503-2512.

［23］LUO Z W， ZHANG Q， SHI M J， et al. Effect of pore size on the biodegradation rate of silk fibroin scaffolds［J］. Advances in Materials Science and Engineering， 2015（1）： 1-7.

［24］CAO Y， WANG B C. Biodegradation of silk biomaterials［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2009， 10（4）： 1514-1524.

［25］LU Q， ZHANG B， LI M Z， et al. Degradation mechanism and control of silk fibroin［J］. Biomacromolecules， 2011， 12（4）： 1080-1086.

Effects of humidity treatment on scaffold materials prepared via salt-leaching from silk fibroin-formic acid solution

WENG Minyi， WANG Zhiwei， NING Wan’e， WANG Qian， HUANG Jiwei

（a.College of Biological and Chemical Engineering;

b.Rainbow Modern Textile Industry College， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract：Silk fibroin， which is derived from natural silk， is a renewable resource renowned for its excellent biocompatibility， non-toxicity， low immunogenicity， ease of functional modification， and good structural tunability. It is widely utilized in the regeneration of various tissues， including skin， blood vessels， ligaments， cartilage， bone， and nerves， as well as in clinical research. As a crucial material for biomedical tissue engineering， silk fibroin scaffolds feature an interconnected three-dimensional network structure， suitable plasticity， and favorable mechanical properties. These scaffolds play an essential role in supporting cell proliferation， differentiation， and adhesion. An effective and straightforward method for preparing silk fibroin scaffolds involves dissolving degummed silk in a solution of CaCl2-formic acid， followed by a salt-leaching process. The resulting scaffolds exhibit high compressive modulus and strength; however， achieving lower compressive modulus and strength can be challenging due to the significant crystallization-promoting effect of high-concentration formic acid on silk fibroin.

To achieve reverse modulation of the mechanical properties of silk fibroin scaffolds prepared using the salt-leaching method with a CaCl2-formic acid solvent system， this study designed and implemented a custom humidification treatment apparatus and protocol. By applying humidification to the silk fibroin formic acid solution， the concentration of formic acid in the solution was diluted， enabling the reverse regulation of the mechanical properties of the silk fibroin scaffold materials. During this process， the effects of varying humidification treatment times and different amounts of porogen （sodium chloride） on the structure and properties of the prepared silk fibroin scaffold materials were investigated. The characterization of the prepared silk fibroin scaffold materials was conducted using scanning electron microscopy （SEM）， Fourier-transform infrared spectroscopy （FTIR）， X-ray diffraction （XRD）， thermal analysis （TGA-DSC）， mechanical property testing， porosity， and biodegradability assessments. The results indicated that the introduction of the humidification treatment resulted in silk fibroin scaffold materials with good and stable formability， approximately 90% porosity， and pore walls composed of silk fibroin microspheres. As the humidification treatment time increased， the degree of β-sheet formation in the silk fibroin decreased. Conversely， an increase in the amount of porogen added facilitated the crystallization of the silk fibroin scaffold materials. These structural changes led to a gradual decrease in the compressive strength and compressive modulus of the silk fibroin scaffold materials， with the compressive strength ranging from 5.75 kPa to 15.23 kPa and the compressive modulus ranging from 12.58 kPa to 34.29 kPa.

This study successfully employed a humidification treatment to dilute the concentration of formic acid in the silk fibroin solution. As a result， a silk fibroin scaffold material was prepared， consisting of numerous silk fibroin microspheres. This method significantly improved the tunability of the mechanical properties and broadened the range of compressive modulus adjustments. Consequently， it offers a promising new approach for designing silk fibroin scaffold materials that are suitable for various tissue regeneration applications.

Key words：

silk fibroin; scaffolds materials; formic acid; salt-leaching; humidity treatment; modulation of mechanical properties