花魔芋GRAS家族基因全基因組鑒定與脅迫下表達分析

摘要：GRAS家族是一類植物特有的轉錄因子，在植物生長發育和逆境響應等多個生物過程中發揮重要作用。花魔芋（Amorphophallus konjac）是我國重要的經濟作物，目前尚無關于花魔芋GRAS家族基因的相關報道。采用生物信息學手段對花魔芋GRAS家族基因進行全基因組鑒定與功能分析，通過RNA-Seq解析了花魔芋GRAS家族基因響應非生物和生物脅迫脅迫的表達情況。結果顯示，花魔芋有51個GRAS家族成員，劃分為8個亞家族。該家族編碼的蛋白由144～850個氨基酸組成，分子量介于15 789.78～90 823.32 u之間，等電點在4.94～11.19之間，大部分AkGRAS編碼蛋白為酸性不穩定蛋白。順式作用元件分析顯示AkGRAS基因的啟動子區富含激素、干旱和低溫等逆境響應元件。RNA-seq結果表明，多個亞家族基因成員響應干旱、鹽脅迫和軟腐病原菌侵染表達。且PAT1亞家族基因AkGRAS35、AkGRAS19、AkGRAS40在鹽脅迫下顯著上調表達，AkGRAS41顯著下調表達；AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS35、AkGRAS51在軟腐病原菌侵染下上調表達，AkGRAS8和AkGRAS46下調表達。推測PAT1亞家族基因在花魔芋高鹽脅迫和軟腐病原菌侵染應答中發揮重要作用。

關鍵詞：花魔芋；GRAS家族基因；逆境響應；生物信息學分析

中圖分類號：Q943.2；S632.301" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0040-14

收稿日期：2024-11-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：31860057）；云南省基礎研究專項面上項目（編號：202401AT070002）；安康市科技計劃（編號：AK2022-NY-04）；安康學院專項計劃（編號：2023AYKCYZ05）；曲靖師范學院博士創新團隊支持計劃。

作者簡介：李竹梅（1988—），女，云南騰沖人，博士，講師，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：lizhume@163.com。

通信作者：褚洪龍，博士，副教授，從事植物抗逆生理、植物與微生物互作研究。E-mail：chuhonglo@163.com。

GRAS是一類在植物中起著重要調節作用的轉錄因子家族，其名稱來源于3個典型家族成員赤霉素不敏感（GAI）、赤霉素不敏感抑制因子（RGA）和稻草人（SCR）。GRAS家族蛋白一般含有400～770個氨基酸殘基，這些蛋白的編碼通常由非保守的N末端基序和高度保守的C末端基序組成［1］。GRAS蛋白的N末端包含固有無序區（IDR），即非折疊區，使得GRAS蛋白被歸類為固有無序化蛋白（IDPs）［2］。IDRs序列在溶液狀態下不形成穩定的二級或三級結構，但在遇到合適的配體時會折疊成有序結構，參與信號轉導和功能調節。其中C末端基序中包含了一系列高度保守的結構域，如亮氨酸七肽重復序列Ⅰ（LHRⅠ）、VHIID、亮氨酸七肽重復序列Ⅱ（LHRⅡ）、PFYRE和SAW。VHIID（其中V為纈氨酸，H組氨酸，I為異亮氨酸，D為天冬氨酸）結構域位于LRⅠ和LRⅡ結構域之間，是這些保守結構域中的核心結構域，在蛋白質之間以及蛋白質與DNA的相互作用中起著重要作用［3］。Hirsch等根據GRAS蛋白結構域的特點，將其分類為8個亞家族，分別為LISCL、DELLA、PAT1、HAM、LS、SCR、SHR和SCL3［4］。

目前GRAS家族己經在水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹（Populus przewalskii Maxim.）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、甜瓜（Cucumis melo）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、蘋果（Malus pumila）等多個物種中被鑒定研究［1，5-11］。不同物種之間由于GRAS蛋白序列N末端的長度和序列不同，GRAS家族成員數量和亞族存在著較大的差異。在水稻、玉米、花生、獼猴桃、蘋果、楊樹、擬南芥中分別有60、49、64、173、88、78、106、34個GRAS基因。在獼猴桃、玉米以及花生中，GRAS基因家族分類為8個不同的亞家族；在蘋果中，GRAS基因家族劃分為11個亞家族，其中LISCL亞家族成員數量最多。在擬南芥、楊樹、水稻中GRAS基因蛋白至少分為13個亞家族。

GRAS轉錄因子在植物生長發育、形態結構、逆境適應等方面都具有重要的影響。研究表明，擬南芥GRAS轉錄因子中的DELLA蛋白是赤霉素（GA）信號途徑的負調控因子，例如在莖伸長、開花誘導、種子萌發和花發育等過程中抑制植物對GA的應答反應 ［12-13］。GRAS蛋白家族的PAT1和SCL21在光信號傳導過程中起著積極的調控作用。例如，Bolle等在擬南芥pat1-1突變體中發現，phyA（Phytochrome A）信號轉導的早期階段受到干擾，導致在遠紅光照射下下胚軸的伸長不再受光抑制［14］。此外，SCL21在不同的光線處理下表達量有所降低，而PAT1則未受影響，這表明它們在遠紅光調控路徑中發揮著不同的作用。徐紅云和張明意通過比較野生型擬南芥和AtSCL4突變體在滲透脅迫下的生理指標和基因表達，發現AtSCL4在滲透脅迫下顯著上調表達，且突變體具有更強的抗滲能力［15］。張群等通過對白樺（Betula platyphylla）的研究發現，在鹽脅迫下，BpGRAS1的表達量上升，過表達植株的電解質滲透率、失水率和MDA含量降低，同時POD和SOD活性增強，從而出現過表達植株的耐鹽性增強，而抑制表達植株的耐鹽性降低［16］。王同歡等發現在低溫脅迫下，菊花腦（Chrysanthemum nankingense）GRAS家族中有14個基因表現出顯著的上調或下調表達［17］。楊杰等通過qRT-PCR分析發現，枳（Poncirus trifoliata）中12個PtrGRAS基因在低溫脅迫下表現出顯著的表達變化，其中PtrGRAS11、PtrGRAS26和PtrGRAS30受到強烈誘導，推測它們可能在抵御低溫脅迫中發揮關鍵作用［18］。

花魔芋（Amorphophallus konjac）隸屬于天南星科魔芋屬，是一種多年生草本植物，主要分布于中國、日本、東南亞地區。魔芋地下球莖主要成分為葡甘聚糖，含量在44%～64%之間［19］。葡甘聚糖具有多種優良的特性，使得其在食品工業、生物醫藥、工農業等各個領域都有著廣泛的應用 ［20-21］。隨著花魔芋全基因組測序工作的完成，為基因家族的全基因組分析提供了便利，也為花魔芋功能基因組學研究提供了可靠的基因組數據信息。基于GRAS基因家族在植物生長發育和逆境脅迫響應中的重要作用，本研究利用生物信息學手段，以花魔芋全基因組為基礎，鑒定花魔芋AkGRAS基因家族成員，并對這些基因的理化特性、染色體定位、系統進化、共線性關系、基因結構域以及啟動子順式元件等進行分析，利用RNA-Seq技術分析GRAS基因在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的表達模式。以期為后續花魔芋GRAS轉錄因子基因功能研究提供重要參考，為魔芋分子育種提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1 花魔芋GRAS基因的鑒定及定位分析

在線數據庫Figshare（https：//doi.org/10.6084/m9.figshare.15169578）下載花魔芋gff3基因組注釋數據文件和蛋白序列文件，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_022559845.1/）數據庫下花魔芋的基因組文件［20］。從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）網站上下載GRAS基因保守結構域（Pfam檢索號為PF03514）的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）。利用Tbtools-Ⅱ（v2.083）軟件，使用Simple HMM Search命令對花魔芋全基因組蛋白數據進行搜索。篩選出E值小于1.0×10-5的基因ID，并提取相應蛋白序列。通過NCBI Batch CD-Search工具（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART在線網站（https：//smart.embl.de/）驗證候選蛋白是否包含GRAS保守結構域。將缺失GRAS結構域的候選基因移除，最終確定花魔芋GRAS基因。使用Tbtools的Graphics功能對基因位置進行可視化。

1.2 花魔芋GRAS家族的理化性質分析及亞細胞定位

使用Tbtools軟件中的Protein Paramter Calc工具，對花魔芋GRAS家族編碼的蛋白質進行多項理化性質的預測和分析，包括脂肪系數、親水性、不穩定系數、分子量、等電點、氨基酸數目等。同時，通過在線網站WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）對該家族的蛋白序列進行亞細胞定位分析。

1.3 花魔芋GRAS家族順式作用元件分析及保守結構域、保守基序和基因結構分析分析

使用TBtools軟件提取花魔芋GRAS基因上游的2 000 bp啟動子序列，通過Plant CARE網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行分析。使用TBtools軟件對數據進行可視化處理。

將花魔芋GRAS蛋白序列上傳至NCBI網站的Batch CD-Search（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具中，獲取hitdata結果文件。hitdata文件包含了蛋白序列與Conserved Domain Database（CDD）中保守結構域的匹配信息。隨后，利用TBtools軟件對得到的數據進行可視化操作。利用MEME（http：//meme-suite.org）在線網站對花魔芋GRAS基因進行motif預測。利用TBtools軟件展示出各個motif在GRAS基因家族中的分布情況和特征。根據基因組注釋文件（gff）通過TBtools軟件進行基因結構可視化。

1.4 花魔芋GRAS家族系統進化分析

從Plant TFDB數據庫（https：//planttfdb.gao-lab.org）上下載了擬南芥的34個GRAS蛋白序列和水稻的60個GRAS蛋白序列（附表 1）。利用MEGA 11.0對花魔芋、擬南芥和水稻這3種物種的GRAS蛋白進行了多序列比對，最大似然法（ML）構建了系統發育樹，將Bootstrap method設置為1 000。利用iTOL在線工具（https：//itol.embl.de/login.cgi）美化進化樹。

1.5 花魔芋GRAS家族共線性分析

利用TBtools軟件的Fasta Stats和GFF3/GTF Gene Position（Info.） Parse功能來獲取染色體長度和基因位置信息。通過Table Row Extract or Filter模塊提取目標基因的信息。使用McscanX工具進行共線性分析，并結合Advanced Circos工具繪制出花魔芋GRAS家族的共線性關系圖譜。使用TBtools軟件中McscanX功能分析花魔芋與擬南芥以及水稻之間的同源關系。通過TBtools軟件中Dual Systeny Plot for MCscanX工具進行共線性可視化。

1.6 花魔芋GRAS基因非生物脅迫和生物脅迫下的表達分析

2022年10月對曲靖師范學院云南高原生物資源開發與利用研究中心組培間的花魔芋組培苗進行干旱脅迫和鹽脅迫處理：用濃度為20%的PEG-6000對花魔芋組培苗進行干旱脅迫處理，脅迫誘導4 h；用濃度為80 mmol/L的NaCl溶液對花魔芋組培苗進行鹽脅迫處理，脅迫誘導4 h。脅迫處理后分別對花魔芋組培苗的地上部分和地下部分進行收樣，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存備用。每個處理設4次重復，不做處理的為對照組（CK）。生物脅迫處理為接種花魔芋軟腐病病原菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum），采用針刺法接種，于接種24、48 h后收樣液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存備用，以無菌水處理為對照［21］。

干旱脅迫和鹽脅迫處理樣品送諾禾致源測序公司進行轉錄組測序，獲得測序結果。生物脅迫處理的轉錄組數據下載自BioProject數據庫，索引號為PRJNA1017648。根據花魔芋GRAS基因家族的ID提取該家族基因的FPKM數值，以Actin值（HIC_ASM_3.3714）作為參照，得到其相對表達量。通過Student’s t-test（t檢驗）檢測基因表達量與CK是否存在顯著差異，若有顯著差異，則用*號標記。最后，利用TBtools軟件繪制熱圖進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 花魔芋GRAS基因家族成員的鑒定及定位分析

利用Pfam數據庫中GRAS基因保守結構域隱馬爾可夫模型（PF03514），對花魔芋全基因組序列進行了詳細的分析和篩選，初步篩選得到56個AkGRAS候選基因。進一步運用NCBI Batch CD-Search和SMART工具，對這56個候選基因的保守結構域進行了逐一檢索和驗證，以確保每個候選基因均包含完整的GRAS基因保守結構域。結果（圖1）顯示，有5個GRAS候選基因不具備完整的結構域，分別是HIC_ASM_9.10171、CTG_ASM_14911.2、HIC_ASM_5.9023、HIC_ASM_11.6731、HIC_ASM_5.8807。因此，手動剔除不具備完整GRAS結構域的候選基因后，最終確定51個花魔芋GRAS基因家族成員。依照AkGRAS基因在染色體上的排列次序，51個基因被命名為AkGRAS1～AkGRAS51。經過對AkGRAS基因家族的染色體定位分析，發現有7個基因（AkGRAS45～AkGRAS51）在染色體骨架上，而其余的44個基因則分布在13條染色體上。其中，第6號染色體上存在9個AkGRAS基因，是所有染色體中基因數量最多的一條染色體。而第5號染色體上則有7個AkGRAS基因，僅次于第6號染色體。而第1、4、13號染色體上各僅有1個AkGRAS基因。此外，有8組基因（AkGRAS5/AkGRAS6/AkGRAS7、AkGRAS10/AkGRAS11/AkGRAS12、AkGRAS13/AkGRAS14、AkGRAS21/AkGRAS22、AkGRAS27/AkGRAS28、AkGRAS37/AkGRAS38、AkGRAS40/AkGRAS41、AkGRAS42/AkGRAS43）在染色體上緊密連鎖在一起，推測每組基因可能具有某種結構或功能上的聯系。

2.2 花魔芋GRAS家族的理化性質分析及亞細胞定位

由表1可知，該家族成員所編碼的氨基酸數量在144～850個，分子量在15 789.78～90 823.32 u之間。51個AkGRAS基因家族成員親水性總平均值介于-0.653～0.334之間，僅有4個（AkGRAS4、AkGRAS15、AkGRAS22和AkGRAS50）是疏水性蛋白，表明大多數AkGRAS基因家族成員具有一定的親水性特征。不穩定系數在34.23（AkGRAS15）～68.44（AkGRAS11）之間，AkGRAS4、AkGRAS15和AkGRAS50是穩定蛋白。等電點分布在4.94～11.19之間，42個蛋白呈酸性，9個蛋白呈堿性。這9個蛋白分別是AkGRAS2、AkGRAS4、AkGRAS8、AkGRAS16、AkGRAS17、AkGRAS31、AkGRAS33、AkGRAS34、AkGRAS46。利用WoLF PSORT預測花魔芋GRAS蛋白的亞細胞定位，結果（表 1）表明，花魔芋GRAS蛋白在細胞質、細胞核、葉綠體、線粒體這4個位置上的分布最為常見。

2.3 花魔芋GRAS家族順式作用元件分析

通過PlantCARE在線網站，分析了花魔芋GRAS基因家族的順式作用元件種類和元件潛在功能。結果（圖2）表明，花魔芋GRAS基因家族2 000 bp的啟動子區域存在大量的順式調控元件，包括光響應元件、赤霉素響應元件、脫落酸響應元件（ABRE）、低溫響應元件（LTR）等順式作用元件。由表2可知，51個AkGARS基因全部含有光響應元件，其中有26個AkGARS含有赤霉素響應元件、25個AkGARS含有水楊酸響應元件、49個AkGARS含有脫落酸響應元件、23個AkGARS含有生長素響應元件和22個AkGARS含有低溫響應元件。除以上提到的順式作

2.4 花魔芋GRAS家族的保守基序和基因結構分析

研究結果顯示，在這些AkGRAS基因中，不同的motif種類和數量存在一定的差異，而且這些motif的排列順序也呈現一定的規律。大部分AkGRAS基因按照motif10、motif6、motif1、motif8、motif7、motif9、motif5、motif3、motif2、motif4的排列順序來呈現其保守基序motif骨架。其中有14個基因，即AkGRAS5、AkGRAS6、AkGRAS9、AkGRAS12、AkGRAS13、AkGRAS14、AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS21、AkGRAS35、AkGRAS43、AkGRAS44、AkGRAS47、AkGRAS51，它們都包含了10個motif，顯示出較為豐富的保守基序種類。相反，AkGRAS8和AkGRAS17基因包含的保守基序種類最少，只有1個motif。值得注意的是，在每個GRAS蛋白里，motif4通常出現在C端的末尾位置，而motif8則容易出現缺失。此外，通過基因結構分析發現，所有的花魔芋GRAS基因包含了1～3個編碼序列（CDS），有38個AkGRAS成員不含內含子（圖3）。

2.5 花魔芋GRAS家族的保守結構域分析

AkGRAS家族基因編碼的蛋白都含有GRAS結構域（圖4）。值得注意的是，AkGRAS9、AkGRAS3和AkGRAS15這3個蛋白質中各有2個不同的保守結構域。AkGRAS9蛋白包含1個能夠參與植物各種生理過程調節的DELLA結構域。因此，可以推測AkGRAS9蛋白在植物生長發育和應激反應調控中發揮重要作用。AkGRAS3蛋白含有Atrophin1 superfamily結構域。Atrophin1 superfamily結構域在不同生物體中都具有重要的功能，可能與調控基因表達、細胞信號傳導等相關。AkGRAS15蛋白含有RNA1 superfamily結構域，可能在基因調控或信號傳導中發揮著特定的功能。

2.6 花魔芋GRAS家族共線性分析

通過對花魔芋GRAS基因的共線性分析發現，在51個GRAS基因中共有7對共線性關系（圖5）。具體來說，第8號與第9號和第10號染色體之間有1對同源基因；第6號和第2號染色體之間有1對同源基因；第5號和第3號染色體之間存在1對同源基因；第11號和第12號染色體上各自存在同源基因。這些結果為深入研究花魔芋基因的演化和功能提供了重要的基礎。此外，還進行了花魔芋、擬南芥和水稻之間的GRAS基因家族的共線性分析。其中，擬南芥為雙子葉植物，花魔芋和水稻屬于

子葉植物。 從共線性圖譜中（圖6）可以觀察到， 花

魔芋與擬南芥、水稻之間的同源基因對數量的差異，即花魔芋與擬南芥存在12對同源基因，與水稻存在18對同源基因。花魔芋與水稻之間的同源基因對數量多于花魔芋與擬南芥之間的同源基因對數量。這種現象表明花魔芋與其他物種之間的GRAS基因在演化過程中存在一定的差異，可能反映了它們在基因組結構和功能上的特異性。

2.7 花魔芋GRAS家族系統進化分析

利用MEGA 11.0將篩選得到的花魔芋（51個）與擬南芥（34個）、水稻（60個）的GRAS蛋白序列構建系統發育樹（圖7）。根據Hirsch等［4］和Dutta等［22］的分類方式，51個AkGRAS家族基因被劃分為8個亞家族，分別是SHR、PAT1、LS、LISCL、SCL3、DELLA、SCR和HAM亞家族，但是各亞家族成員數量的分布并不均勻。其中，LISCL、DELLA和SCL3亞家族的成員數量較少，分別有4、5、8個；而SHR和PAT1亞家族的成員數量最多，都有10個。相比之下，LS亞族的成員數量最少，僅有2個。

2.8 花魔芋GRAS基因在非生物脅迫下的表達分析

干旱和高鹽等非生物因素對作物產量造成的負面影響已經成為全球糧食生產上的一大挑戰。植物對干旱、高鹽等逆境壓力做出響應時，植物根系充當直接響應外部環境的器官，發揮著重要作用。如圖 8所示，花魔芋地下部分SCL、DELLA和PAT1亞家族的成員在干旱脅迫和鹽脅迫時，其表達量顯著上調。這些成員包括1個SCL的基因（AkGRAS24）、1個DELLA的基因（AkGRAS29）和3個PAT1的基因（AkGRAS35、AkGRAS19和AkGRAS40），推測它們可能是花魔芋地下部分抗旱、耐鹽的候選基因。然而，部分亞家族基因在花魔芋地下部分呈現顯著下調表達，例如SCR（AkGRAS12）、HAM（AkGRAS3和AkGRAS23）、DELLA（AkGRAS9）。花魔芋地上部分（如莖、葉）鹽脅迫誘導下PAT1亞族基因AkGRAS8表達顯著上調，而LISCL亞族基因AkGRAS36表達顯著下調；而在干旱脅迫下地上部分沒有任何基因顯著差異表達。在干旱和鹽脅迫條

件下，花魔芋GRAS家族基因中的DELLA、SHR、SCL3、SCR、PAT1、LISCL和HAM亞家族均顯示出明顯的表達變化。值得關注的是，在鹽脅迫條件下，PAT1（AkGRAS41）和SHR（AkGRAS13）在花魔芋地上部分和地下部分的表達均呈現顯著下調，PAT1（AkGRAS40）則呈現顯著上調。

2.9 花魔芋GRAS基因在生物脅迫下的表達分析

魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）引起的毀滅性病害［23］，因目前缺乏有效防控措施，嚴重影響著魔芋的產量和品質，制約了魔芋的生產和發展［21］。本研究探究了花魔芋接種軟腐病原菌24、48 h GRAS家族基因的表達情況。結果（圖9）表明，隨著接種時間的延長，更多的AkGRAS家族基因成員被誘導下調或上調表達。其中，接種軟腐病原菌24 h，PAT1亞家族中AkGRAS19、AkGRAS20、AkGRAS35、AkGRAS51顯著上調，AkGRAS8和AkGRAS46顯著下調；SCL3亞家族AkGRAS45和SISCL亞家族的AkGRAS30顯著上調；DELLA亞家族的AkGRAS32，HAM亞家族的AkGRAS3、AkGRAS7、AkGRAS22和SHR亞家族的AkGRAS5、AkGRAS6顯著下調。接種軟腐病原菌 48 h，PAT1亞家族中AkGRAS19、AkGRAS35、AkGRAS51顯著上調，AkGRAS8顯著下調；SCL3亞家族的AkGRAS24、AkGRA45和SISCL亞家族的AkGRAS30顯著上調；而HAM亞家族的AkGRAS3、AkGRAS7、AkGRAS22，SCL42亞家族的AkGRAS42，SCR亞家族的AkGRAS10、AkGRAS11、AkGRAS12和SHR亞家族的AkGRAS5、AkGRAS6、AkGRAS21、AkGRAS47顯著下調。

3 討論

GRAS基因家族參與植物的生長發育、激素信號傳導和逆境脅迫等生物學過程。近年來，隨著多種植物基因組測序數據的公布，對GRAS基因家族成員的鑒定工作已經在不同植物物種中開展，如水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹（Populus przewalskii）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）、甜瓜（Cucumis melo）、生姜（Zingiber officinale）、獼猴桃（Actinidia chinensis）、蘋果（Malus pumila）等［1，5-11，22］。花魔芋是一種多年生草本植物，其塊莖富含葡甘聚糖，是一種重要的經濟作物。目前未見有關花魔芋GRAS基因家族的研究。本研究采用生物信息學手段對花魔芋GRAS基因家族進行了鑒定與表達分析。結果顯示，花魔芋有51個GRAS家族成員，并發現有7個基因（AkGRAS45～ AkGRAS51）在染色體骨架上，而其余的44個基因則分布在13條染色體上（圖1）。花魔芋GRAS基因家族成員劃分為8個亞家族，分別是SHR、PAT1、LS、LISCL、SCL3、DELLA、SCR和HAM亞家族（圖7）。其蛋白理化性質預測結果表明，該家族成員所編碼的氨基酸數量在 144～850個之間，分子量在15 789.78～90 823.32 u之間。等電點在 4.94～11.19之間，大部分AkGRAS編碼蛋白為酸性不穩定蛋白，且具有一定的親水性（表1）。

花魔芋GRAS基因家族2 000 bp的啟動子區域存在大量的順式調控元件（圖2），這些元件的種類多樣，主要包括光響應元件、脅迫應答元件（例如低溫、厭氧和防御反應等）以及各種激素響應元件（例如生長素、脫落酸、赤霉素和水楊酸等）。這表明花魔芋GRAS基因幫助植物適應外界環境變化和抵御各種生物或非生物脅迫。對花魔芋的GRAS基因結構進行分析時發現，約75%的花魔芋GRAS基因家族成員不含內含子（圖3）。在其他植物中，如黃瓜（Cucumis sativus）、番茄（Solanum lycopersicum）中，無內含子的GRAS蛋白所占的比例分別為75.67%和77.40%［24-25］。這表明在不同植物中，無內含子的GRAS基因比例相對較高，且這種基因結構在各種物種中都表現出較高的保守性。

已有多種植物的GRAS基因家族被報道參與非生物脅迫應答［25-28］。例如，葡萄（Vitis vinifera）的GRAS基因VviRGA5（DELLA亞家族）和VviLISCL1（SCL亞家族）對鹽脅迫有響應；擬南芥（A. thaliana）的SCL亞家族基因AtSCL14對鹽脅迫的響應強烈［26-27］。番茄（Lycopersicon esculentum）的SlGRAS2（PAT4亞家族）和LeHAM3（HAM亞家族）對鹽脅迫表現出強烈響應 ［25］。水稻（Oryza sativa）的OsGRAS23（SCL亞家族）在鹽脅迫下也有顯著響應，而在鹽地堿蓬（Halostachys caspica）中，SCL亞家族的HcSCL13在干旱和鹽脅迫下被誘導表達，且增加了其過表達轉基因擬南芥植株生長量和鹽脅迫耐受性［28-29］。胡楊（Populus euphratica）中的PeSCL7也對鹽脅迫有響應［30］。本研究發現，在鹽和干旱脅迫下，花魔芋中1個SCL亞家族基因（AkGRAS24）、1個DELLA亞家族基因（AkGRAS29）和3個PAT1亞家族基因（AkGRAS35、AkGRAS19和AkGRAS40）顯著上調；同時，部分基因在脅迫下顯著下調，例如SCR亞家族（AkGRAS12）、HAM亞家族（AkGRAS3和AkGRAS23）和DELLA亞家族（AkGRAS9）。植物通過增強超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活性來清除細胞中過量的活性氧（ROS），從而提高干旱和鹽的耐受性［31-32］。例如，水稻中的OsGRAS2（SCL亞家族）參與干旱脅迫響應，而OsGRAS23在干旱脅迫下上調表達，且其過表達植株中SOD和POD活性增加［33］。PeSCL7

是胡楊中的應激響應轉錄因子，能提高其對干旱和鹽脅迫的耐受性［34］。在本研究中，花魔芋在干旱脅迫下，多數AkGRAS基因在地下部分差異表達，推測這些基因主要在根部發揮調控作用。值得注意的是，在鹽脅迫下顯著差異表達的AkGRAS19、AkGRAS35、AkGRAS40和AkGRAS41成員都屬于PAT1亞家族。同樣，干旱脅迫下葡萄中的PAT1亞家族基因VviPAT3、VviPAT4、VviPAT6和VviPAT7上調表達 ［35］。Zhang等發現棉花中的GRAS基因 Gh_D01G0564 和Gh_A04G01966（屬于PAT1亞家族）在鹽、低溫、高溫和PEG處理下的表達顯著上調［36］。Yuan等則發現葡萄（Vitis amurensis）的GRAS轉錄因子VaPAT1過表達可增強轉基因擬南芥對低溫、干旱和高鹽的耐受性［37］。因此，推測花魔芋的PAT1亞家族基因在提高鹽耐受性方面具有重要作用。然而，要全面了解GRAS基因在植物干旱和鹽脅迫中的功能，仍需進一步研究。

GRAS基因DELLA亞家族的成員在擬南芥感染致病細菌期間起到了信號轉導的作用，并增強了對病原菌的抗性［38］。本研究中，發現花魔芋在感染軟腐病原菌24 h后，AkGRAS42（DELLA亞家族）顯著下調。Bonshtien等首次證明了GRAS基因在番茄抗病起關鍵作用，S1GRAS4和S1GRAS6在響應真菌誘導劑時也被誘導表達，GRAS基因的超表達表明這些基因可能參與了激活植物防御反應［39-0］。本研究也發現，隨著接種病原細菌處理時間的延長，更多GRAS基因家族成員被誘導表達。盡管如此，大多數GRAS家族基因的具體作用仍不清楚，進一步研究有助于深入理解GRAS基因與植物防御系統的相互關系。

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