基于轉錄組測序的寒地水稻孕穗期低溫響應分析

摘要：水稻作為世界重要的糧食作物，極易受到低溫侵襲，并伴隨著水稻機體內一系列復雜的代謝變化及分子水平調控，以適應低溫逆境。為了明確寒地水稻孕穗期低溫脅迫應答的關鍵調控通路及基因，采集龍粳11（LG11）在孕穗期低溫處理下0、2、4 d的幼穗，用于孕穗期低溫脅迫的轉錄組動態分析。結果共鑒定得到14 236個差異表達基因（DEG），其中，低溫處理前2 d共得到11 724個DEG，在低溫處理4 d后共識別了11 057個DEG。GO功能富集分析，LG11低溫處理共包含144個顯著富集的生物進程GO類別，其中富集DEGs數量最多的集中在光合作用、葉綠體重定位、紅外光應答等光合作用相關類別。KEGG富集分析共顯著富集到37個KEGG通路，其中與光合作用相關的光合作用-天線蛋白等KEGG通路顯著富集下降，進一步明確龍粳11光合作用在孕穗期低溫下顯著受抑制。這些結果為后續水稻孕穗期低溫脅迫應答中轉錄組水平上的分子調控提供了理論指導。

關鍵詞：水稻；孕穗期；低溫；轉錄組測序

中圖分類號：S511.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0193-07

收稿日期：2024-01-24

基金項目：黑龍江省農業科學院農業科技基礎創新項目杰出青年項目（編號：CX23JQ02）；黑龍江省省屬科研業務費項目（編號：CZKYF2021-2-C002、CZKYF2021-2-C007）；黑龍江省博士后面上資助項目（編號：LBH-Z21027）；國家水稻產業體系建設專項（編號：CARS-01）。

作者簡介：郭震華（1985—），男，內蒙古集寧人，博士，副研究員，主要從事水稻分子育種研究，E-mail：hljsdsgzh@163.com；共同第一作者：蔡麗君（1988—），女，云南昆明人，博士，助理研究員，主要從事作物高產研究，E-mail：lijun_cai@yeah.net。

通信作者：馬文東，碩士，研究員，主要從事水稻育種研究。E-mail：wendongma@163.com。

作為世界上重要的糧食作物之一，水稻養活了全球近半數人口［1］。水稻源自亞熱帶或熱帶地區，易受低溫冷害侵襲。目前每年約 1 500萬hm2 水稻受低溫威脅［2］。而伴隨著長時間的自然進化和人為馴化，水稻逐漸形成了對低溫逆境適應和抵御的復雜調控機制［3］。當遭遇低溫冷害時，水稻體內通過改變細胞膜結構、調整物質轉運代謝、加速保護性物質及活性氧（ROS）的清除等一系列復雜的代謝變化，適應低溫逆境［4-6］。伴隨著各種生理變化的同時，水稻體內相關耐冷調節基因的表達也會相應改變，其中涉及到眾多復雜的信號傳遞轉導途徑，最終形成了水稻體內耐冷分子調控機制的重要組成部分。

眾多研究表明，水稻耐冷性是一個復雜的數量性狀，受多基因調控［7-8］，目前與水稻耐冷相關基因已有超過70個被報道（www.ricedata.cn），且多為轉錄因子（TF）。OsWRKY71在遭受低溫脅迫時顯著上調，過表達該基因可顯著提高幼苗的存活率及光合能力等，表明該基因在水稻低溫脅迫應答中發揮了積極的作用［9］。OsWRKY76作為另一個WRKY家族轉錄因子，其過表達會顯著降低水稻對稻瘟病的抗性，但提高了低溫抗性［10］。有報道稱，作為OsWRKY63的直接靶基因，OsWRKY76通過與OsbHLH148間產生互作，共同誘導OsDREB1B的表達，進而增強了水稻的低溫抗性［11］。

近年來，伴隨著第二代高通量測序技術的不斷更新進步，轉錄組測序技術已在各類植物的低溫脅迫應答研究中得到了成功的應用，尤其是在水稻、大豆、玉米等多種作物中，在低溫抗性機制及基因表達調控中起到了重要的作用［12-16］。白李唯丹等通過對東鄉野生稻苗期低溫下的轉錄組測序分析，共檢測到10 200個差異表達基因，其中37個基因是耐冷調控相關的家族基因［17］。高紅秀等以水稻中花11為研究材料，經低溫處理后，通過RNA-Seq技術分析植物激素調控水稻幼苗對低溫脅迫的應答模式，其中植物激素信號轉導中低溫應答的差異表達基因有31個，分別有25個上調表達基因和6個下調表達基因；主要參與了茉莉酸和脫落酸信號途徑［18］。

黑龍江省作為我國粳稻種植面積最大的省份，地處我國最北部，低溫冷害頻發，冷害是黑龍江省水稻安全生產的重要限制因子之一。為了深入了解當地水稻品種的孕穗期低溫應答機制，并進一步發掘孕穗期低溫應答關鍵代謝調控通路及相關基因，本研究以黑龍江省水稻品種龍粳11（LG11）為研究材料，借助美國Illumina公司的HiSeq 2500平臺，對孕穗期低溫處理后的水稻幼穗開展轉錄組差異分析，在DEG分析的基礎上，繼續進行GO和KEGG富集分析，進一步揭示水稻對孕穗期低溫應答響應機制，并結合熒光定量PCR篩選驗證耐冷候選基因，以期為后續水稻孕穗期耐冷分子育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選取由黑龍江省農業科學院水稻研究所育成的水稻品種龍粳11（LG11）作為研究材料。該品種曾為黑龍江省第三積溫帶的主栽品種，具有高產優質等眾多優良性狀，但對溫度十分敏感，低溫造成嚴重的空殼。

1.2 材料種植及低溫處理

本研究采用盆栽試驗，試驗在黑龍江省農業科學院水稻研究所田間試驗場（130°52′E，46°87′N）進行。挑選健康飽滿的LG11稻粒，置于1% NaClO溶液15 min，蒸餾水連續沖洗2～3次。將消毒過的稻粒移入培養箱催芽，溫度為30 ℃。試驗材料于2018年4月20日播種。待幼苗長至3葉1心期移栽至盆栽桶中，盆栽桶直徑34 cm，高35 cm。盆栽土壤pH值為6.56，有機質含量為36.56 g/kg，速效氮、速效磷及速效鉀含量分別為106.65、85.58、93.8 mg/kg。每盆栽桶環形均勻種植LG11幼苗15株，為保證供試材料處于同一生長時期，盆栽桶中所有材料去除分蘗，只留主莖，共種植36盆。當LG11的劍葉葉枕距離倒二葉的葉枕在-4～0 cm時，即認為其進入孕穗期［19］，并對該單株進行掛牌標記。對進入到孕穗期的LG11，取18盆轉移到光照培養箱（HPG-280，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）培養，生長條件設置為溫度12 ℃，光照—黑暗周期為8 h—16 h，相對濕度為80%；其余生長條件與處理組一致。當處理4 d后，返回到正常環境生長直到成熟。孕穗期低溫抗性通過幼穗結實率判定。水肥管理同黑龍江省農業科學院水稻研究所田間常規管理。

1.3 樣品采集

在12 ℃下處理0、2、4 d后，分別從LG11幼穗的上1/3 部分取下和收集長度在3.5～4.5 mm的新鮮穎花約0.5 g，立即用液氮冷凍，并儲存在 -80 ℃ 的超低溫冰箱中，每個處理重復3次。

1.4 RNA測序

將低溫保存樣品通過干冰包裹送至北京百邁客生物科技有限公司，委托其進行RNA抽提、質控及建庫。利用 Nanodrop 8000 分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）測定RNA的純度和濃度，并用RNA 6000 Nano LabChip（美國安捷倫科技公司）檢測RNA的完整性和濃度。通過Illumina HiSeq 2500平臺進行轉錄組測序（RNA-Seq），產生雙末端（2×150 bp）reads。

1.5 數據質控

將LG11原始的下機數據以FASTQ文件格式進行儲存。進一步過濾含有接頭序列和低質量數據，在此基礎上通過對高質量LG11文庫序列的GC含量、Q20和Q30等進行計算，進一步獲得高質量序列（clean data）用于后續分析。本研究參考基因組為Oryza sativa L. ssp. Japonica （Oryza_sativa_IRGSP-1.0），利用HISAT2 v2.1.0軟件將clean data比對到參考基因組上，通過FPKM值判定轉錄本數或基因表達水平。

1.6 差異表達基因篩選

利用DEGseq2軟件進行差異基因分析，顯著差異的閾值為|log2 Fold Change |≥1，Plt;0.05［20］。其中Fold Change（FC）代表基因表達量變化倍數，|FC|≥2 表示該基因在2個比較組之間存在顯著差異，P是基因差異表達概率，Plt;0.05，即表示該基因是差異表達基因。

1.7 差異表達基因功能富集分析

基因本體 （GO，http：//www.geneontology. org/page/download-go-annotatios）和KEGG（京都基因與基因組百科全書，http：//www.genome.jp/kegg）分別用于GO和KEGG功能注釋。用Goseq進行GO富集分析，閾值為校正P值＜0.01。用KOBAS（v2.0）進行KEGG富集分析，富集因子越大，Q值＜0.01，對應通路的富集程度越高。

1.8 qRT-PCR驗證分析

為了驗證RNA-Seq結果的準確性，選取測序結果中差異表達倍數較高的6個基因，開展qRT-PCR驗證分析。使用Trizol試劑提取LG11的12 ℃低溫處理0、2、4 d后的幼穗穎花的總RNA。進一步根據TaKaRa反轉錄試劑盒說明書將樣品ＲNA反轉錄成cDNA。通過Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR引物，并通過英濰捷基（上海）貿易有限公司引物合成，內參為Actin1。qRT-PCR反應在SYBR Select Master Mix儀器上運行，供試樣本中每個基因均分別設3次生物學和3次技術重復，通過2-ΔΔCT法計算基因相對表達量變化。

1.9 數據處理

WPS office用于數據分析；SPSS 22.0軟件用于顯著性檢驗（α=0.05）；GraphPad Prism 9.0用于作圖。

2 結果與分析

2.1 孕穗期低溫處理不同時間段LG11的結實率

孕穗期低溫對水稻最直接的影響體現在結實率的變化上。本研究對LG11在12 ℃低溫處理下0、2、4 d后的結實率進行了調查分析，結果如圖1所示。在正常生長條件下（處理0 d），LG11的結實率為92.36%，該結果與之前報道結果［21］較為一致，表明LG11在正常溫度環境中可正常結實。當低溫處理2 d后，LG11的結實率迅速降低至39.26%，極顯著低于對照。而當低溫繼續，至處理4 d后，LG11的結實率較對照仍呈現極顯著下降趨勢，僅為8.14%，幾乎不結實。因此，孕穗期低溫導致LG11的結實率極顯著降低，表明LG11的孕穗期耐冷性弱。

2.2 轉錄組測序結果質控分析

由表1可知，本研究通過對LG11在低溫處理0、2、4 d后的穎花進行RNA-Seq分析，構建了9個文庫，通過篩選掉低質量數據，共得到540.27 Mb的clean reads，其中GC含量在53.40%～56.58%之間，Q30均≥91.10%，比對到參考基因組的片段在34 915 829～60 514 688 bp之間，比對到參考基因組上的比例在79.55%～82.84%之間。以上結果表明，LG11的RNA-Seq的測序質量較高，可用于后續分析。

2.3 低溫脅迫下轉錄組差異表達基因分析

以|log2 FC|≥1、Plt;0.05為閾值，分別對12 ℃低溫處理2、4 d的LG11進行DEG的篩選。由圖 2-a 可知，低溫脅迫下，將LG11不同處理時間下的DEG通過維恩圖分析，共得到14 236個DEG，其中，低溫處理前2 d共得到11 724個DEG，包含了 6 017 個上調及5 707個下調表達基因；而在低溫處理4 d后，LG11中共識別了11 057個DEG，包含了6 090個上調及4 967個下調表達的DEG。進一步的維恩圖分析結果（圖2-b）表明，LG11中分別有4 287個下調和4 195上調的DEG是低溫處理2、4 d 后共有的，分別占全部DEG的30.1%和29.5%；分別有1 812個和1 842個DEG是在低溫處理2、4 d后特異上調表達；另有1 367個和670個DEG是在低溫處理2、4 d后特異下調表達。可見，LG11在12 ℃低溫脅迫2、4 d后，多數基因均呈現差異表達，表明LG11對低溫敏感，基因受低溫脅迫持續應答。

2.4 DEG的GO功能富集分析

本研究以KS（Kolmogorov-Smirnov）lt;0.001為篩選閾值，對維恩圖中（圖2-b）各部分DEG進行GO功能富集分析，重點對生物功能類別（BP）展開分析。首先對上調基因展開分析（圖3-a、圖3-b），LG11低溫處理2、4 d后共得到54個生物進程GO類別。 其中， 37個生物進程GO類別是在低溫

處理2、4 d時在LG11中共同富集到的（2-4共同上調），分別有18個和7個生物進程GO類別是在低溫處理2 d（LG11-0-2-特異上調）和4 d（LG11-0-4-特異上調）時特異富集得到的，而僅有1個生物進程GO類別細胞對饑餓應答在低溫處理2 d時上調而在處理4 d后下調。54個上調的生

物進程GO類別中，低溫處理2、4 d時在LG11中共同富集到（2-4共同上調）的細胞過程的調節GO類別包含的基因最多（545個DEG），之后依次是DNA模板轉錄的調控（300個DEG；2-4共同上調）、蛋白磷酸化（272個DEG；2-4共同上調）。在下調基因中，維恩圖各部分DEG同樣以KSlt;0.001為閾值共顯著富集到90個生物進程GO類別（圖3-c、圖3-d）。同樣的，低溫處理2、4 d時LG11中共同富集（2-4共同下調）到的生物進程GO類別最多，為74個。其中單一有機體過程包含基因數最多（1 738個DEG），然后依次是光合作用、質體組織、ncRNA代謝進程等，分別含有233、220、178個DEG。

2.5 DEG的KEGG功能富集分析

在對DEG進行GO功能富集分析的同時，進一步對其進行KEGG的富集分析，用于發掘DEG參與的主要代謝調控及基因轉導途徑，并對關鍵基因功能及遺傳調控進行深入分析。以q值lt;0.001為篩選閾值，維恩圖各部分DEG分別進行KEGG富集分析，共得到37個顯著富集的KEGG通路（圖4）。維恩圖各部分DEG顯著富集最多的KEGG通路是在低溫處理2、4 d后LG11中共同下調的DEG部分（2-4 共同下調），共富集到19個KEGG通路中。在低溫處理2、4 d后LG11中共同下調的DEG（2-4共同下調）中顯著富集的碳代謝KEGG通路，含有的差異基因最多，為71個，之后依次是低溫處理2、4 d后LG11中共同下調的DEG（2-4共同下調）顯著富集的氨基酸生物合成KEGG通路（52個DEG），在低溫處理2、4 d后LG11中共同上調的DEG中（2-4共同上調）顯著富集到的植物激素信號轉導通路（42個DEG），低溫處理2、4 d后共同下調的DEG（2-4共同下調）中顯著富集到的光合有機物的碳固定通路（40個DEG）及光合作用（36個DEG）。而在低溫處理2 d后特異上調的DEG中，酮體的合成和降解通路含有的DEG最少，僅為3個，之后依次是在低溫處理4 d后特異上調的DEG中，黃酮和黃酮醇生物合成（4個DEG）及角質、木質及蠟質生物合成（5個DEG）KEGG通路。

2.6 DEG的qRT-PCR驗證分析

基于LG11在低溫脅迫下基因的表達模式變化，從測序結果中隨機選擇6個DEG進行qRT-PCR分析，用于驗證轉錄組測序結果的準確性，引物序列見表2。由圖5可以看出，6個基因的表達模式變化均與轉錄組測序中各基因的結果一致，表明轉錄組測序結果的準確性及可靠性。

3 討論與結論

作為我國北方第一水稻大省，黑龍江也是我國重要的水稻商品糧基地（水稻產量的70%作為商品）。然而，由于黑龍江位于我國最北部地區，低溫尤其是在孕穗期低溫嚴重制約了水稻的安全生產。LG11處黑龍江省第三積溫帶，具有良好的農藝和產量性狀，但孕穗期耐冷性極差［22］。因此，本研究以LG11為研究對象，通過對其進行孕穗期低溫脅迫下的轉錄組測序研究，以進一步全面的研究寒地水稻孕穗期低溫脅迫下的代謝調節及應答機制。本研究中LG11低溫處理前2 d和前4 d分別得到 11 724 和11 057個DEG，表明LG11中眾多基因在不同低溫處理時間段都呈現出高度差異表達，說明LG11低溫敏感，持續受低溫脅迫，此項結果也同樣與本研究中的LG11的低溫結實率結果呈現出一定的正相關，再次印證了LG11的孕穗期低溫高度敏感性。

通過對DEG進行GO功能富集分析發現，在維恩圖各部分中共得到144個顯著富集的生物進程GO類別，其中下調GO類別為90個，明顯多于上調的GO類別（54個），再次表明LG11受低溫影響更加強烈。而這些下調GO類別中，富集基因數最多的多與光合作用相關，如光合作用（GO：0015979）、葉綠體重新定位（GO：0009902）、紅光應答（GO：0010114）及遠紅光應答（GO：0010218）等。此外，KEGG通路富集分析共得到37個顯著富集到的KEGG通路。其中下降KEGG通路為19條。而這其中與光合作用相關的光合作用（ko00195）及光合作用-天線蛋白（ko00196）同樣顯著富集下降。因此，結合GO功能富集及KEGG通路顯著富集分析，進一步明確LG11孕穗期低溫下光合作用受到明顯抑制。

光合作用是通過吸收光能轉化為植物體的化學能，是植物體內有機物合成的起點。眾多報道稱，植物光合作用顯著受到低溫抑制［23-24］。低溫脅迫下，葉綠體的亞顯微結構遭到破壞，阻礙其電子傳遞，導致光合作用受到抑制，進而降低光合速率［25］。低溫脅迫不僅影響了類囊體膜介導的光反

應，抑制類囊體膜上PSⅡ光能的傳遞及轉換效率，減弱了CO2的同化能力，還會降低葉綠體基質中光合作用暗反應的活性［26-27］。對相關GO類別和KEGG通路所包含基因研究發現，低溫對光合作用涉及到多個方面的調控，如Os10g0496900（OsPORB，原葉綠素酸酯氧化還原酶B）、Os09g0346500（OsCAB1R，捕光葉綠素a/b結合蛋白基因）、Os03g0563300（OsCHLI，鎂離子螯合酶I亞基編碼基因）［28-30］等。作為C3碳反應中重要的羧化酶，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶的亞基編碼基因OsRBCS2、OsRBCS3、OsRBCS4及OsRBCS5等均在LG11中下調表達。以上結果再一次表明，孕穗期低溫對LG11的光合作用相關功能形成嚴重的抑制。

進一步通過對GO功能富集分析發現，LG11的維恩圖中各部分DEG中顯著富集到的生物進程的GO類別中，低溫應答（GO：0009409）類別富集到的次數最多，表明孕穗期低溫脅迫嚴重影響了寒地水稻正常生長發育。對此GO類別中的DEG進一步研究發現， 孕穗期低溫脅迫下， OsMAP1、OsMPK2、OsMPK6等絲裂原活化蛋白激酶的編碼基因均在LG11中下調表達。而絲裂原活化蛋白激酶在平衡低溫等非生物脅迫產生過多積累的活性氧起到重要的調控作用，因此在寒地水稻孕穗期低溫應答中，絲裂原活化蛋白激酶的相關編碼基因起到正向調控的作用，需進一步研究。

通過qRT-PCR分析驗證了一些DEG的表達模式或水平，初步證實這些基因在水稻在低溫應答中發揮了積極作用，可以作為調控低溫抗性的候選基因。然而，為了解這些基因如何對低溫應答作出貢獻，并識別真正的低溫應答基因，須要對這些基因進行進一步的驗證和功能分析。

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