基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法快速篩查食品中10 種非法壯陽抗疲勞類藥物

摘要 建立了基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）分析食品中西地那非、紅地那非、那紅地那非、豪莫西地那非、羅地那非碳酸酯、西地那非二聚體雜質、伐地那非二聚、羥基紅地那非、N-去甲基西地那非和烏地那非10 種非法添加壯陽抗疲勞藥物的方法。考察了基質種類、基質溶劑和用量、激光強度和點樣方式對各目標物的質譜信號強度和信噪比（S/N）的影響，并進行了方法學驗證和實際樣品檢測。結果表明，選擇以介子酸（SA）為基質，將其均勻分散在甲醇-水（50∶50， V/V）中，采用先點基質再點樣品的點樣方式，在反射線性正離子模式下選擇激光強度為60%進行MALDI-TOF MS 篩查時，質譜信號穩定、強度高、響應重復性好。方法學驗證結果表明， 10 種非法壯陽抗疲勞藥物濃度在10～100 ng/mL 范圍內與質譜疊加峰面積呈良好的線性關系，相關系數（r）gt;0.985，檢出限（LOD）為0.1～1.0 ng/mL。保健酒、軟膠囊和速溶咖啡3 種食品基質中的加標回收率為72.9%～109.9%，相對標準偏差（RSDs）為0.7%～11.3%（n=3）。本方法分析速度快、準確性高、靈敏度好、抗干擾能力強、無樣品基質效應，基于已有質譜信息可無需使用標準品，僅通過點靶上機測定即可實現對食品基質中10 種非法壯陽抗疲勞藥物的非靶向篩查。

關鍵詞 基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜；壯陽抗疲勞類藥物；非法添加；α-氰基-4-羥基肉桂酸；介子酸

抗疲勞是指能夠緩解和（或）抵抗機體腦力和（或）體力消耗至一定程度的過程[1-3]。近年來，天然產物的活性成分在抗疲勞[4-5]保健方面的應用研究很多，這些研究成果常轉化于壯陽抗疲勞類保健食品的應用與推廣，深受男性消費者青睞。但是，隨著市場擴大，利益驅使導致誠信缺失，不法商家常在保健食品中添加非法壯陽抗疲勞類藥物[6]，以達到用量少、見效快的目的。據統計，市場上保健食品中常檢出非法添加的抗疲勞類藥物包括磷酸二酯酶5（Phosphodiesterase-5， PDE5）抑制劑、α-腎上腺素受體阻滯劑、蛋白同化制劑、天然前列腺素類和多巴胺受體[7-8]。其中，非法添加的PDE5 抑制劑包括西地那非、紅地那非、那紅地那非、豪莫西地那非、羅地那非碳酸酯、西地那非二聚體雜質、伐地那非二聚體、羥基紅地那非、N-去甲基西地那非和烏地那非等，并且較為常見[9]。但是，長期和（或）超劑量攝入PDE5抑制劑抗疲勞類藥物會對神經、心腦血管和消化系統有一定程度的副作用，與硝酸酯類藥物同服還可能使血壓突然下降，甚至危及生命[10]。近年來，國家市場監管總局將保健食品和特殊膳食食品中非法添加非食用藥物列為重點專項治理目標[11]，并針對固體飲料、壓片糖果和代用茶等食品中非法添加藥物開展專項整治[12]。因此，建立一種快速定性篩查和定量檢測食品中非法添加壯陽抗疲勞類藥物的分析方法具有重要的現實意義。

目前，非法添加壯陽抗疲勞類藥物的檢測方法有色譜法、光譜法和免疫法等。色譜法包括薄層色譜法[13]、液相色譜法[14]、液相色譜-串聯質譜法[15-17]、液相色譜-核磁共振法[18]和離子遷移淌度法[19]，這些方法準確度高，但前處理和檢測時間長，適用于實驗室小批量樣品的檢測。光譜法包括拉曼光譜法[20]和熒光光譜法[21]，此類方法靈敏度高、熒光背景低，但僅適用于定性檢測。免疫法具有靈敏度高、費時少和操作簡便等特點[22-23]，但每次僅能測定一種或一類結構相似的藥物。因此，開發一種兼有儀器分析法的高準確度和免疫分析法的快速高效篩查性能的方法可以彌補現有方法的不足。基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）是一種軟電離質譜技術，具有靈敏度高、對分子量判斷精確、制樣簡單、樣品和溶劑量消耗少、測定時間短和可大批量檢測等優勢[24-25]，已廣泛應用于小分子藥物[26]、寡糖[27]、脂質[28]、多肽和蛋白質[29-30]以及聚合物[31]等物質的分析測定。雖然MALDI-TOF MS 的傳統基質在低分子量區（lt;500 Da）會產生大量基質碎片，但部分無干擾的低分子量區域仍可實現對部分小分子化合物的定量檢測。張培等[32]利用傳統基質實現了對孔雀石綠的快速定量檢測，僅需5 s 即可獲得定量分析結果，表明MALDI-TOF MS 在小分子化合物的分析檢測領域還有很大的開發利用空間。目前，利用MALDI-TOF MS 進行食品中非法添加壯陽抗疲勞類藥物快速定量篩查的研究尚未見報道。

本研究通過對基質和壯陽抗疲勞類藥物分子量進行篩選，排除了特定低分子量區域基質碎片的干擾，并通過優化方法條件，實現了食品中10 種非法添加壯陽抗疲勞類藥物的快速篩查，為加強市場監管和保護消費者健康提供了技術保障。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultraflextreme MALDI-TOF MS 儀（德國Bruker 公司），配有flexAnalysis 3.4 數據分析系統；LC-30 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Q-TRAP 4000 質譜儀（美國SCIEX 公司），配有電噴霧離子源；2600TH超聲清洗儀（上海安譜科學儀器有限公司）；384孔Ground steel靶板（德國Bruker公司）；M3 7610-33CN 渦旋混合儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Allegra X-30R 高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）；MS205DU 電子天平（上海梅特勒-托利多國際貿易有限公司）。

甲醇（HPLC 級，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid， HCCA）、介子酸（Sinapic acid， SA）（HPLC 級，德國Bruker 公司）；西地那非（Sildenafil）、紅地那非（Acetildenafil）、那紅地那非（Nor-acetildenafil）和豪莫西地那非（Homosildenafil）標準品（純度gt;99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；羅地那非碳酸酯（Lodenafil carbonate）、西地那非二聚體雜質（Sildlenafil dimer impurity）和伐地那非二聚體（Vardenafil dimer）標準品（純度gt;99.9%，北京振翔科技有限公司）；羥基紅地那非（Hydroxyacetildenafil）、N-去甲基西地那非（N-Desmethylsildenafil）和烏地那非（Udenafil）（純度gt;99.9%，上海阿拉丁試劑有限公司）；實驗用水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q 超純水制備系統（美國Millipore 公司）制得。27 批不同品牌食品樣品均購自廣州市某商場。

1.2 標準溶液及基質溶液的配制

標準溶液的配制 分別準確稱取各標準品10.00 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，得到1 mg/mL 的標準儲備液，于–18 ℃避光貯存。分別精密量取上述儲備液0.1 mL，以甲醇定容至10 mL，得到10 μg/mL 的單標中間液。使用時，將上述標準中間液用甲醇-水（50∶50， V/V）稀釋至100 ng/mL，或分別移取所需單標中間液配制成10、20、40、60、80 和100 ng/mL 的混合標準溶液。

基質溶液的配制稱 取4.0 mg 傳統基質HCCA（或SA）至離心管中，加入甲醇-水（50∶50， V/V），超聲溶解10 min，得到4.0 mg/mL 的HCCA（或SA）基質溶液。

1.3 樣品前處理

在前期研究方法[15]的基礎上稍做修改進行樣品前處理。取適量樣品，固體或半固體樣品研細混均、液體樣品混合均勻后，準確稱取0.2000 g 樣品于10 mL 比色管中，加入甲醇-水（50∶50， V/V）定容，超聲提取10 min，固體和半固體樣品經8000 r/min 離心3 min 后，取上清液，備用。液體樣品可直接上機測定。

1.4 點樣方法與MALDI-TOF MS 分析條件

1.4.1 點樣方式

采用文獻[33]的點樣方式，具體為雙鋪法a：先移取1 μL 樣品于384 孔Ground 靶板上，自然揮干后，再移取1 μL 基質覆蓋，自然揮干，待測；雙鋪法b：先移取1 μL 基質于384 孔Ground 靶板上，自然揮干后，再移取1 μL 樣品覆蓋，自然揮干，待測；混合法：取2 μL 樣品和2 μL 基質混合均勻后，取2 μL混合物直接于384 孔Ground 靶板上點樣，自然揮干，待測；三明治法：取0.5 μL 基質溶液于384 孔Ground 靶板上，自然揮干后，取1 μL 樣品覆蓋基質，自然揮干后，再取0.5 μL 基質溶液揮干，待測。

1.4.2 MALDI-TOF MS 條件

光源：氮氣激光；離子源：電噴霧電離（ESI）源；波長：337 nm；檢測模式：反射線性正離子模式；采集范圍：160～3580 Da；激光強度：60%；光譜響應強度疊加次數均為20 次。利用儀器配置的flex Control 軟件對質譜圖中質量軸的質荷比（m/z）進行標記和默認平滑處理，并用FlexAnalysis 3.4 軟件分析原始數據，將疊加所得目標物對應離子的峰面積換算成對應標準曲線中各標準物質的含量。

2 結果與討論

2.1 基質的比較和選擇

按1.2 節方法配制100 ng/mL 的單標準溶液和基質溶液，分別用于分析10 種壯陽抗疲勞藥物。基于HCCA 和SA 基質的MALDI-TOF MS 分析結果見圖1A。以HCCA 為基質時，未檢出紅地那非和羅地那非碳酸酯的質譜峰；以SA 為基質時， 10 種壯陽抗疲勞藥物的質譜峰均可檢出，并且目標峰響應強度高于HCCA 基質的峰強度。同時，比較了SA 和HCCA 溶劑空白基質背景噪聲（圖1B 和圖1C）。結果表明，以SA 為基質的背景峰強度較低，并且400 Da 以上的背景干擾少。因此，選用SA 作為基質用于10 種壯陽抗疲勞藥物的質譜檢測。

2.2 質譜裂解規律的探究

以SA 為基質，采用100 ng/mL 的各單標溶液，研究10 種壯陽抗疲勞藥物的MALDI-TOF MS裂解規律（電子版文后支持信息圖S1）。10 種壯陽抗疲勞藥物質譜峰的離子化形式均為[M+H]+，西地那非、紅地那非、那紅地那非、豪莫西地那非、羅地那非碳酸酯、西地那非二聚體雜質、伐地那非二聚體、羥基紅地那非、N-去甲基西地那非和烏地那非分別在m/z 475.217、467.270、453.257、489.255、1035.418、835.303、835.303、483.294、461.202 和517.301 處檢測到質譜信號，對疊加的各目標物的質譜峰信號（m/z）進行相對誤差（RE）的統計分析，計算得RElt;3.7×10–5，說明MALDI-TOF MS 對以上10 種壯陽抗疲勞藥物的質譜離子峰分析精準。質譜離子峰分析結果同時表明，西地那非二聚體雜質和伐地那非二聚體是一對同分異構體，在混合標準溶液中無法通過MALDI-TOF MS 區分二者，后續研究需將西地那非二聚體雜質單標溶液和其余9 種標準品混合標準溶液分開，單獨進行分析。

2.3 基質溶解條件和用量的優化

將SA 分別分散在水、乙腈、甲醇和甲醇-水（50∶50， V/V）溶劑中，觀察其與100 ng/mL 各標準溶液點樣成膜過程，并分析其響應強度，結果見圖2A。4 種溶劑均可用于SA 的溶解和MALDI-TOF MS 分析，并且紅地那非的質譜響應信號最強，羅地那非碳酸酯的響應信號最弱。具體而言，甲醇-水作為溶劑時， SA在Ground 靶板上可均勻鋪展，分散性好，成膜性佳，各目標物的質譜信號強度高、重復性好；乙腈和甲醇作為溶劑時，雖然各目標物信號強度較高，但因有機溶劑的表面張力大， SA 在Ground 靶板上鋪展較分散，甚至擴散污染相鄰樣品點；水作為溶劑時， SA 在Ground 靶板上可均勻鋪展，分散性好，成膜性佳，但干燥時間過長，各目標物質譜信號強度較高、重復性差。故選用甲醇-水（50∶50， V/V）為SA溶劑。

在1 mL 甲醇-水（50∶50， V/V）中加入不同質量（1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 mg）的SA，考察100 ng/mL各標準溶液的MALDI-TOF MS 分析效果（表1 和圖2B）。結果表明，隨著SA 濃度增大，各標準物質的質譜信號強度（圖2B）均呈現先增大后減小的趨勢，在4.0 mg/mL 時質譜信號強度最大；隨著SA 濃度增加，各標準物質的質譜信號信噪比（表1）也呈現先增大后減小的趨勢，在4.0 mg/mL 時質譜信號的信噪比最大。因此，后續研究均采用含4.0 mg/mL SA 的甲醇-水（50∶50， V/V）基質溶液。

2.4 點樣方式的考察

基質結晶質譜信號不穩定、響應重復性差和“甜點”效應是影響MALDI-TOF MS 定量分析測定的關鍵問題。以SA 作為基質，考察不同點樣方式對質譜信號的影響，即分別采用雙鋪法a、雙鋪法b、混合法和三明治法這4 種點樣方式，將100 ng/mL 混合標準溶液作為樣品在384 孔Ground 靶板上點樣，上機測定。結果表明，質譜峰信號的信噪比由大到小依次為雙鋪法b、混合法、三明治法和雙鋪法a；采用雙鋪法a、雙鋪法b、混合法和三明治法的質譜峰信號強度重復性相對偏差（RSD）依次為3.5%～30.8%、0.7%～6.4%、0.5%～7.5%和4.7%～51.8%。因此，選擇雙鋪法b 作為點樣方式。

2.5 激光強度的優化

以SA 為基質、100 ng/mL 混合標準溶液為樣品，將MALDI-TOF MS 激光能量強度從10% 增至80%，以10% 的能量間隔依次考察激光強度對10 種壯陽抗疲勞藥物質譜峰響應強度的影響，結果（電子版文后支持信息圖S2）表明，隨著激光能量增加，各目標物的響應強度增大，其中，羅地那非碳酸酯、西地那非二聚體雜質和伐地那非二聚在激光能量達20%以上時才有信號，當激光能量增加到60%時，各目標物響應強度達到最大；當激光能量超過60%時，西地那非、紅地那非、那紅地那非、N-去甲基西地那非和烏地那非的響應強度增加不明顯，其它目標物的響應強度呈現下降趨勢。故選擇60% 的激光能量作為MALDI-TOF MS 分析10 種壯陽抗疲勞藥物的激光能量條件。

2.6 方法學評價

2.6.1 線性范圍和檢出限

在優化的實驗條件下，對不同濃度的10 種壯陽抗疲勞藥物標準品溶液進行MALDI-TOF MS 測定，繪制各目標物[M+H]+疊加峰面積（y）與標準物質濃度（x， ng/mL）的線性曲線。各物質的線性范圍、線性方程和相關系數見表2。在10～100 ng/mL 的濃度范圍內， 10 種壯陽抗疲勞藥物的質譜疊加峰面積與濃度的線性相關系數（r）gt;0.985，說明線性關系良好。以3 倍信噪比（S/N）對應濃度作為檢出限（LOD），結果表明，以SA 為MALDI-TOF MS 基質對10 種壯陽抗疲勞藥物的LOD 介于0.1～1.0 ng/mL之間，其中，羅地那非碳酸酯的LOD 為1.0 ng/mL，豪莫西地那非、西地那非二聚體雜質、伐地那非二聚體和羥基紅地那非的LOD 為0.1 ng/mL，遠低于國家補充檢測方法BJS201805 的LOD[34]，說明本研究建立的MALDI-TOF MS測定10 種壯陽抗疲勞藥物具有靈敏度高和準確度好的特點。基于已經確定的10 種壯陽抗疲勞類藥物的MALDI-TOF 質譜信息，在日常檢測過程中，可以不需要使用標準物質，僅通過點靶上機測定，再匹配已有的質譜信息即可快速篩查判斷是否含有以上壯陽抗疲勞類藥物，進而實現非靶向篩查。

2.6.2 加標回收率及精密度

在經高效液相色譜-串聯質譜法[34]驗證為陰性的實際樣品中，選擇3 種經常檢出的非法添加壯陽類藥物的液態、半固態和固態樣品（即保健酒、軟膠囊和速溶咖啡）進行低、中、高3 個濃度水平（即0.75、2.0 和4.0 μg/g）的加標回收實驗，每個樣品重復測定3 次，同時用外標法定量并計算回收率。3 種樣品的檢測結果見表3， 60 ng/mL 混合標準溶液及加標樣品質譜圖見圖3。

如表3 結果所示， 10 種壯陽抗疲勞藥物的加標回收率介于72.9%～109.9%之間， RSD 為0.7%～11.3%，說明本研究建立的MALDI-TOF MS 方法對10 種壯陽抗疲勞藥物的定量分析準確可靠。

2.7 實際樣品檢測

將本方法用于廣州市售的27 批食品（包括保健酒、咖啡、功能飲料、蛋白粉、茶包和軟膠囊等）中非法添加壯陽抗疲勞藥物篩查。通過比較實際樣品的MALDI-TOF MS離子峰和信號強度進行篩查，結果表明， 1 批咖啡樣品為西地那非陽性， MALDI-TOF MS 定量分析結果為（11.6±0.8） mg/kg。將27 批樣品按國家補充檢驗方法[34]進行檢測，陽性樣品中西地那非的測定結果為（12.1±0.5） mg/kg，與MALDI-TOF MS法測定結果基本一致。與HPLC-MS 法相比，本方法抗干擾能力強、無需流動相和色譜柱、篩查速度快、篩查結果精準，在日常檢測中可不依賴于標準物質即可實現10 種壯陽抗疲勞藥物的非靶向分析篩查，非常適用于大批量樣品的監督抽查。

3 結論

本研究建立了一種以SA 為基質的MALDI-TOF MS 方法，在反向線性正離子模式下，可用于食品中10 種非法添加壯陽抗疲勞藥物的快速定量篩查。本方法不僅靈敏度高、篩查結果準確、精密度好，并且具有抗干擾能力強、節能環保、高效等特點。每個樣品經儀器分析僅需0.3 s 即可獲得篩查結果，特別是在確定了10 種壯陽抗疲勞類藥物的MALDI-TOF 質譜信息的前提下，本方法可以不需要使用標準物質，通過匹配已有的質譜信息即可快速篩查判斷是否含有以上壯陽抗疲勞類藥物，從而實現非靶向篩查。MALDI-TOF MS在小分子分析測定方面具有明顯優勢，可為食品中非法添加物的風險評估提供保障。但目前的基質難以實現對所有非法添加物的分析篩查，也無法實現同分異構體的非靶向分析篩查。因此，開發適用于更多小分子分析篩查的廣譜性基質，同時研究適用于同分異構體的非靶向篩查是未來研究的重點。

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國家自然科學基金項目（No. 32061160473）、廣東省自然科學基金項目（No. 2023A1515012605）、廣東省食品質量安全重點實驗室開放基金項目（No. 2024KF01）、廣東省市場監督管理局科技項目（No. 2023CS01）和貴州省科學院項目（No. 黔科院J字（2023）23號）資助。

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