基于引物交換反應的非標記熒光探針用于脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1 的高靈敏檢測

摘要 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1， APE 1）是一種多功能蛋白質，在DNA 修復和基因表達調控中發揮重要作用。由于APE 1 在多種癌癥中過表達，因此可作為癌癥生物標志物，用于輔助臨床診斷、指導用藥及預后監測。本研究采用引物交換反應（Primer exchange reaction， PER）策略，設計了一種非標記型熒光探針，用于APE 1 活性的高靈敏檢測。當體系中不存在APE 1 時，催化發夾（Catalytic hairpin， HP）的結構穩定，無G-四鏈體（G-quadruplex）生成。此時，游離的硫磺素T（Thioflavin T，ThT）不發射熒光，體系的背景熒光很低。加入APE 1 后，催化發夾上的無嘌呤/嘧啶（Apurinic/apyrimidinic，AP）位點被特異性識別并切割，斷裂生成的短核酸序列可直接作為引物引發PER 擴增，生成大量G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結構并發出熒光，導致傳感體系的熒光信號顯著增強。PER 擴增反應策略和催化發夾的低背景設計使此探針展現出很高的靈敏度，線性檢測范圍為0.001～0.07 U/mL，檢出限（3σ）為0.0008 U/mL。此外，引物序列可由APE 1 切割直接生成而不需要額外添加，這不僅提高了反應的特異性，還簡化了操作步驟。非標記型熒光信號的使用大大降低了實驗成本，實現了APE 1 的快速檢測。利用此熒光探針檢測人血清樣品中APE 1 的含量，回收率在91%～104%之間，表明其在生物酶研究方面擁有巨大的應用潛力。

關鍵詞 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1；引物交換反應；G-四鏈體；硫磺素T；非標記熒光探針

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1， APE 1）是一種人體組織中廣泛存在的多功能蛋白質，在堿基切除修復和基因表達調控中不可或缺[1-2]。作為細胞中重要的DNA 修復酶，APE 1 識別并催化切割雙鏈DNA 上的無嘌呤/嘧啶（Apurinic/apyrimidinic， AP）位點并產生缺口，然后通過聚合和連接反應完成修復，從而確保基因家族完整[3]。此外， APE 1 還可激活氧化應激反應中幾種重要的轉錄因子，如p53、AP-1、NF-κB、HIF-α和PAX-5 等，進而調控基因表達[4]。然而，這種在正常生理過程中發揮關鍵作用的酶，在腫瘤細胞中卻呈現出異常的高表達。這種異常表達不僅通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡和增強細胞侵襲能力來促進多種腫瘤的生長和擴散，還通過調控轉錄因子活性，影響腫瘤細胞對放化療的敏感性，進而降低治療效果[5-8]。因此， APE 1 可作為重要的癌癥標志物輔助臨床診斷、指導用藥及預后監測。

傳統的APE 1 活性測定方法包括酶聯免疫吸附分析法、電化學分析方法和化學發光免疫分析方法。這些方法具有靈敏度高、特異性好且結果可靠等優勢，但存在操作復雜、耗時長和成本高等缺點[9-11]。熒光分析法具有快速、高時空分辨率以及儀器操作相對簡單等優點，引起了廣泛關注[12-14]。Liu 等[13]將滾環擴增反應（RCA）與G-四鏈體（G-quadruplex）相結合設計了一種熒光探針，用于APE 1 的靈敏檢測；Huang 等[14]利用聚合酶和內切酶共同作用的等溫擴增技術與G-四鏈體相結合開發了一種可檢測APE 1的高靈敏傳感器。上述傳感器雖然具有較高的靈敏度，但在設計過程中需要T4 DNA 連接酶、核酸外切酶Ⅰ（ExonucleaseⅠ， ExoⅠ）和核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ， Exo Ⅲ）的共同作用形成環狀模板，或需要內切酶的輔助進行下一輪擴增。多種酶的聯合使用不僅會引起非特異性識別和假性信號的風險，還會增加檢測的成本和操作的復雜性。因此，發展靈敏度高、特異性好且操作簡單的APE 1 檢測技術具有非常重要的意義。

引物交換反應（Primer exchange reaction， PER）策略是一種新穎而強大的等溫核酸擴增技術，在新一代熒光放大生物傳感器的構建方面展現出巨大的應用前景。該技術以催化發夾（Catalytic hairpin， HP）DNA 為模板，在聚合酶的作用下啟動可逆且重復的鏈置換反應，最終以自主、可編程和等溫的方式合成多條特定的單鏈DNA[15]。與滾環擴增等其它擴增技術相比， PER 發夾設計簡單，只需一種聚合酶即可實現特異且快速的信號擴增[16-17]。Xie 等[18]將CRISPR/Cas 體系與PER 技術相結合構建了一種高靈敏的生物探針用于核糖核酸酶H 檢測。Li 等[19]利用PER 技術開發了自主DNA 合成器，用于痕量的鼠傷寒沙門菌檢測。這些傳感器顯著提高了檢測的靈敏度和穩定性，但需要復雜的核酸修飾或標記過程。非標記熒光探針無需對信號分子進行標記，具有操作簡便、成本低以及可實時監測生物體系動態變化等優勢。

利用PER 技術簡潔的設計和良好的放大能力，本研究構建了一種非標記型的熒光探針，用于APE 1活性的快速、高靈敏檢測。由于催化發夾中的富G 序列被全部固定于發夾結構的頸部，且結構穩定，硫磺素T（Thioflavin T， ThT）游離于溶液中，體系的背景熒光很低。加入APE 1 后，催化發夾上的AP 位點被切割，生成的短核酸序列可作為引物引發PER 擴增，生成大量的G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結構并發出熒光，導致體系的熒光信號顯著增強。PER 擴增反應策略以及催化發夾的低背景設計使此傳感體系展現出較高的靈敏度。此外， PER 擴增不需要額外添加引物，簡化了操作步驟，而且非標記型熒光信號的使用降低了實驗成本。將本方法用于人血清樣本中APE 1 活性分析，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500 熒光分光光度計（日本Hitachi 公司）；FE-28 pH 計（美國Mettler-Toledo 公司）。

APE 1、ExoⅠ、Exo Ⅲ、Bst DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DnaseⅠ）和辣根過氧化物酶（HRP）購自美國New England Biolabs 公司；ThT、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和催化發夾（5′-AAGGGTT/idSp/GGGTTAGGGTTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTT-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；NaCl、MgCl2、Tris-HCl 緩沖液和牛血清白蛋白（BSA）均購自北京索萊寶科技有限公司。1×NEB 2.1 緩沖液（50 mmol/L NaCl， 10 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L MgCl2，100 μg/mL BSA， pH 7.9， 25 ℃）購自美國New England Biolabs 公司。以上試劑均為分析純，無需其它處理。實驗用水為MILI-Q 超純水系統（美國Millipore 公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 APE 1 活性的檢測

將2 μL 不同濃度的APE 1、2 μL 催化發夾（10 μmol/L）、2 μL 10×NEB 緩沖液4 和4 μL DEPC 水混合均勻。在37 ℃反應60 min 后，在65 ℃加熱20 min 使APE 1 失活。然后移取10 μL 上述反應體系、2 μL Bst DNA 聚合酶（1 U/mL）、4 μL 10×ThermoPol 反應緩沖液、4 μL 10×MgSO4溶液、1 mmol/L dNTP（dATP， dTTP， dGTP， dCTP）各4 μL和2 μL ThT（40 μmol/L）至EP 管中，補加DEPC 水至總體積為40 μL，混勻，于37 ℃孵育120 min。反應結束后，繼續補加1×NEB 2.1 緩沖液至總體積為100 μL；在激發波長為425 nm、發射波長為480 nm 條件下測定體系的熒光強度。

1.2.2 實際樣品中APE 1 的測定

本研究中的血液樣本由山西醫科大學第一醫院提供，并獲得了審查委員會的批準和參與者的知情同意。血液樣本首先在4 ℃以10000 r/min 離心10 min，獲得上層血清，稀釋3 倍，于65 ℃加熱15 min，使血清中的蛋白酶失活。將不同濃度的APE 1 加入到上述血清中，并按1.2.1 節的方法測量熒光強度，計算血清樣品中APE 1 的回收率。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

基于PER 策略的非標記熒光探針設計原理如圖1 所示，靠近催化發夾的5′端含有AP 位點，便于目標物APE 1 的識別；3′端修飾Inverted dT 以避免非特異性擴增[20]；靠近環狀部位含有一段終止序列（3 對G-C 堿基），用于終止擴增反應。未加入APE 1 時，催化發夾的結構穩定，處于游離狀態的ThT 不發射熒光，傳感體系的背景熒光很低。加入APE 1 后， APE 1 特異性識別并切割催化發夾上的AP 位點，斷裂生成的短核酸序列（綠色）可作為PER 擴增的引物。隨后，在Bst DNA 聚合酶的催化作用下，引物利用加入的dNTP 進行延伸，直至到達終止序列時擴增結束。由于分子內競爭雜交的影響，延長的DNA 序列移位并折疊成G-四鏈體，游離的ThT 嵌入G-四鏈體結構且發出熒光，傳感體系的熒光信號顯著增強。基于PER 策略的非標記熒光探針為快速、靈敏測定APE 1 活性提供了一種新方法。

2.2 傳感體系的可行性分析

為了驗證此傳感體系檢測APE 1 的可行性，考察了不同實驗條件下溶液的熒光變化。如圖2A 所示，染料ThT 游離于溶液中，熒光信號很弱（曲線a）。加入催化發夾后，溶液的熒光信號幾乎與背景信號持平（曲線b），這表明催化發夾的結構穩定， ThT 不能與之結合。加入dNTP 和Bst DNA 聚合酶，此傳感體系的熒光信號仍較低（曲線c）。加入APE 1 后，此傳感體系的熒光信號顯著增強（曲線d），這是由于APE 1 特異性地識別并切割催化發夾上的AP 位點，斷裂生成的短核酸序列直接作為引物引發PER 擴增，生成大量G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結構并發出熒光。如圖2B 所示，加入APE 1 之前，在紫外光照射下未觀察到熒光（管1）；加入APE 1 后，觀測到明顯的熒光（管2），此結果與傳感體系熒光光譜的變化一致。上述結果表明，本傳感體系可用于APE 1 活性檢測。

2.3 實驗條件的優化

為了使傳感體系的檢測性能達到最佳，對dNTP、Bst DNA 聚合酶和ThT 的濃度以及PER 擴增反應時間等實驗條件進行優化。利用傳感體系的熒光強度比值（F/F0）評價傳感體系的性能，其中， F 為存在APE 1 時的熒光強度， F0 為不存在APE 1 時的熒光強度。如圖3A 所示，隨著dNTP 濃度增大， F/F0 逐漸增大，當dNTP 濃度增至100 nmol/L 時， F/F0 達到平臺期。Bst DNA 聚合酶濃度對此傳感體系性能的影響如圖3B 所示，當Bst DNA 聚合酶濃度為1.6 U/mL 時， F/F0 達到最大值。ThT 濃度對此傳感體系性能的影響如圖3C 所示，在ThT 濃度為2 μmol/L 時， F/F0 達到峰值。PER 擴增反應時間對此傳感體系性能的影響如圖3D 所示，隨著反應時間延長， F/F0 逐漸增大，并在120 min 時達到峰值。此外，由于K+對G-四鏈體結構的形成和穩定有一定影響[21]，考察了KCl 濃度對此傳感體系性能的影響。如圖3E 所示，當KCl 濃度從0 增至10 mmol/L 時， F/F0 未發生顯著變化，說明K+的加入對傳感體系的檢測性能基本無影響，這可能由于溶液中的Na+濃度足以使G-四鏈體形成穩定的折疊結構。

將此探針在4 ℃環境下保存不同時間后，測定其對APE 1 的熒光響應，以評估探針的穩定性。結果如圖3F 所示，探針在4 ℃環境中保存24 h 后， F/F0 只略微下降，表明其具有一定的穩定性。

綜上所述，本研究選擇在傳感體系中加入100 nmol/L dNTP、1.6 U/mL Bst DNA 聚合酶和2 μmol/LThT，反應120 min 后進行后續實驗。

2.4 傳感體系的分析性能

在最優實驗條件下，評估了此傳感體系對不同濃度APE 1 的響應性能，如圖4A 所示，不存在APE 1時，催化發夾的結構穩定，因此ThT 游離于溶液中，無熒光發射，傳感體系的背景熒光很低。隨著APE 1濃度增大，傳感體系的熒光強度隨之增強。這主要由于APE 1 切割催化發夾上的AP 位點，生成的引物經PER 擴增后折疊成G-四鏈體結構并與ThT 結合，顯著提升了熒光響應。此傳感體系的F/F0 與APE 1濃度的關系如圖4B 所示，當APE 1 濃度達到1 U/mL 時， F/F0 趨于穩定。圖4B 插圖為此傳感體系檢測APE 1 的校正曲線，線性檢測范圍為0.001～0.07 U/mL，線性方程為y = 52.06x + 0.91，相關系數（R2）為0.995，檢出限（3σ）為0.0008 U/mL，與文獻報道的標記性熒光傳感器（表1）靈敏度相當甚至更優，這主要歸因于發夾探針的低背景設計和PER 的高效擴增。

2.5 傳感體系的選擇性

為了考察此傳感體系對APE 1活性檢測的特異性，測定了其在ExoⅠ、ExoⅢ、DnaseⅠ、HRP以及BSA等干擾物存在時的熒光響應。如圖5 所示，加入目標物APE 1 時，傳感器顯示出較高的響應信號（F/F0）；加入其它干擾物時，傳感器的熒光響應與空白樣品相近，上述結果表明，此傳感體系對APE 1 具有良好的選擇性。

2.6 實際樣品中APE 1 的測定

采用本方法對人血清樣品中的APE 1 活性進行測定。向稀釋3 倍的人血清樣品中添加不同濃度的APE1，測定結果如表2 所示，血清樣品中APE 1 的加標回收率為91%～104%，相對標準偏差lt;5.2%，表明此傳感體系可用于實際樣品中APE 1 活性分析。

3 結論

基于PER 擴增策略構建了一種非標記型熒光探針，用于APE 1 活性的高靈敏測定。催化發夾的低背景設計以及PER 的高效擴增使此探針展現出很高的靈敏度，檢出限低至0.0008 U/mL。此外， PER 擴增不需額外添加引物，簡化了操作步驟，而且非標記型熒光信號的使用大大降低了實驗成本。將本方法用于人血清樣本中APE 1 活性分析，結果令人滿意。

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