天津市濱海新區不同程度鹽漬土及其主要耐鹽植物根際叢枝茵根真菌的群落組成及多樣性

摘要：叢枝菌根真菌（Arbuscu lar Mycorrhiza 7 Fungi，AMF）在植物生長發育的各個環節均發揮了重要作用。本研究選取天津市濱海新區重度、中度、輕度鹽漬化土壤中的蘆葦、狗尾草、黃蒿、苦苣、堿蓬5種耐鹽植物根圍樣本作為研究對象，采用高通量測序技術探討宿主植物與不同程度鹽漬化土壤對AMF群落多樣性與組成差異的影響。研究結果表明，這5種耐鹽植物根系AMF群落中總共檢測到1 21 355條序列，可歸為9個屬。其中，中度鹽堿土中AMF群落多樣性最高，而重度與中度鹽堿土AMF群落組成最為相似。由LEfSe判別分析可知，球囊霉屬（Glomus）是土壤微生物群落中的關鍵屬，侵染到植物根系皮層細胞的3個共有種在重度鹽堿土中的相對豐度高于中度與輕度鹽堿土。然而，球囊霉屬（Glomus）在蘆葦和堿蓬根際土中的相對豐度顯著低于其他植物。在所有調查樣本中，中度鹽樣地黃蒿根圍的AMF菌種豐富度最高且相對豐度較大。研究結果表明，AMF更適合在土壤中度鹽漬化條件下侵染植物根系，并且更易與黃蒿建立互利共生關系。

關鍵詞：高通量測序；叢枝菌根真菌；多樣性；鹽漬化

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A

土壤鹽漬化導致土壤質量惡化是一個全球性問題[1]。全球受到鹽漬化影響的土壤大約為10億hm2【2】。過高的土壤鹽含量常引起植物滲透脅迫、離子毒害、次生二級脅迫以及養分失衡等問題，破壞植物正常生理代謝功能，降低植物品質和產量，甚至造成植物死亡【3】。土壤微生物能夠通過影響植物生長發育、增強植物抗逆性、促進養分循環和提高土壤肥力等途徑來調節植物一土壤生態系統功能的穩定性[4]。因此，不斷探究不同鹽分條件下土壤中微生物多樣性的規律性變化，探索植物對鹽脅迫的適應機制，對合理開發和修復鹽漬化土地具有積極意義。

AMF是自然生態系統中廣泛分布的一類菌根真菌。它們在侵染宿主植物根系后，可在根表皮層細胞內形成菌絲、泡囊、叢枝等結構，與植物根部形成共生體系。研究[5]表明，AMF能夠與80%左右的陸生植物根系形成共生關系。這種共生關系不僅可以改善土壤質量、提高宿主植物對土壤中礦物質營養元素的吸收效率，還能增強宿主植物應對各種外界刺激和脅迫環境時的抗逆能力[6]。研究[7]顯示，在鹽漬化根際土壤中存在豐富的AMF，說明AMF在鹽漬化生境中具有良好的適應性。

天津市濱海新區擁有大面積且不同程度的鹽漬化土壤，這些土壤中的AMF群落組成特殊，并且擁有多種功能不同的種類，尤其是那些具有較高耐鹽堿能力的AMF品種。因此，對該地區樣地進行AMF資源多樣性研究，探究AMF群落組成與宿主植物和土壤鹽分之間的響應機制，不僅能豐富中國鹽堿土壤中AMF資源的多樣性，還為高效生態修復鹽堿農業用地提供了參考依據和新思路。

1材料和方法

本研究應用Illumina NovaSeq-PE250高通量測序技術，調查天津市濱海新區不同程度鹽漬化土壤中AMF群落組成。研究選取5種優勢植物：蘆葦（ Phragmites australis Trin. ex Steud）、狗昆草I、Setaria viridis Beauv.）、黃蒿（Artemisia annua）、苦苣（Sonchus oleraceus）和堿蓬（Suaeda glauca（Bunge） Bunge），對這些植物根圍土壤中的AMF進行分析，研究不同鹽分土壤中AMF多樣性的變化規律，測定同一生境中耐鹽植物根圍AMF豐富度及侵染狀況的差異，以此探究鹽分梯度對AMF群落的影響以及宿主差異與AMF共生的關系。

1.1試驗地概況與樣品采集

研究區域位于天津市濱海新區吹填淤泥填海造陸區以及海河沿岸。根據楊曉瀟等[8]運用統計學與地統計學方法并結合GIS技術得到的“濱海新區土壤水鹽空間分布圖”確定采樣地。重度鹽分土壤（鹽分含量0.5% ～ 0.6%）取樣地為東經117.67。、北緯38.89。；中度鹽分土壤（鹽分含量0.30% - 0.40%）取樣地為東經117.69°、北緯38.98°；輕度鹽分土壤（鹽分含量0.1% -0.20%）取樣地為東經117.620、北緯39.01°。土母質為濱海黏質鹽土，土壤pH高達8.5。在自然狀態下，鹽生植被群落是該地區的主要植被類型，包括80多種植物，排名前3位的科為菊科、禾本科和藜科。依據出現頻度高、重要值大的物種，本研究選取蘆葦、狗尾草、黃蒿、苦苣、堿蓬進行深入分析。

試驗于2023年10月14日進行，在每處采樣地分別采集5種耐鹽植物的根際土和根系。選擇長勢一致的同種植物，獲得其根圍樣品9份，每3份混合在一起作為1次重復，共3次重復。采樣前，先除去地表枯落物、石塊等雜物，隨后從植株周邊向下挖，深度為10 - 20 cm，收集挖出的植株根系及土壤，每個樣點保留約1 kg土壤及根系樣本。將樣本裝入密封袋，并標明采樣信息及樣地經緯度。樣品用冰盒運回實驗室后，通過20目篩去除石塊和草屑等雜物，處理后裝入密封袋。根系用無菌水沖洗數次后晾干，用乙醇消毒根系表面，放在冰箱內-20℃保存，用于AMF的DNA提取及高通量測序。

1.2功能基因擴增子測序及分析

從采集的樣品中依次隨機選取土壤約3 9、根系5 9，分別裝入50 mL無菌離心管。隨后將樣品送至元莘生物公司，采用Illumina NovaSeq-PE250平臺對群落DNA片段進行Illumina PE250測序。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA，具體步驟為：將DNA片段與引物進行互補，并固定在芯片上，通過PCR擴增產生DNA簇，將DNA擴增子進行線性化處理，加入改造后的DNA聚合酶以及4種熒光標記的dNTP，每次循環合成一個堿基，通過激光掃描讀取序列，在化學切割恢復3’端粘性后，統計每輪的熒光信號以獲取DNA序列。對PE reads進行拼接、質控、過濾、OTU聚類以及物種分類學分析，以進一步探討AMF群落多樣性。

1.3數據分析

利用SPSS 24.0軟件進行多重比較和單因素方差分析，使用Origin 2024軟件繪制百分比堆積圖，使用R語言軟件（R 4.2.1）繪制聚類熱圖分析和微生物相對豐度圖，利用凌波微課（ http：//www.cloud. biomicroclass.com/CloudPlatform/home）計算α多樣性以及進行LEfSe分析。

2結果與分析

2.1不同鹽分梯度對AMF群落多樣性的影響

本研究在天津市濱海新區3個研究地分別進行取樣，土壤鹽漬化程度分為重度、中度和輕度。對不同鹽濃度土壤微生物分別進行Shannon、Simpson、Richness、Pielou計算，Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性。這4個指數被用來評價不同鹽分條件下土壤AMF群落的多樣性。結果顯示，重度鹽、中度鹽、輕度鹽植物根際土中的AMF群落在Shannon、Simpson、Pielou這三個指數上沒有顯著性差異（表1），中度與輕度鹽漬化土壤的AMF群落在Richness指數上顯著高于重度鹽漬化土壤（Plt;0.05）。其中，在3個研究樣地指數中，中度鹽漬化研究地的Shannon、Simpson、Pielou均最大，說明在中度鹽漬化生境中，植物根際土的AMF群落多樣性大于重度和輕度鹽漬化土壤。

2.2不同鹽分梯度對AMF群落相似性及組成的影響

通過歐幾里得距離對不同鹽分梯度的土壤AMF群落進行聚類分析，不同鹽分梯度的植物根際土AMF呈現一定的聚類性特征（圖1）。其中，重度鹽漬化土壤AMF群落與中度鹽漬化土壤中AMF群落可以聚為一類，說明鹽分對AMF群落產生了一定的綜合影響；重度與中度鹽漬化土壤AMF群落組成最為相似，說明AMF更適宜在一定鹽脅迫的生境中生存。

在3類鹽漬化生境中，耐鹽植物根際土均有球囊霉屬（Glomus），且其在3個研究樣地的AMF中相對豐度均為最大（圖2）。其中，在重度鹽漬化生境中最大，達到63.130-/0，表明球囊霉屬（Glomus）對于AMF群落組成的重要性尤為顯著。Archaeospora在3種鹽漬土中的相對豐度均最小，約為10%。

Paraglomeraceae_ Paraglomus_Alguaci112a_Para_1在3個研究樣地5種耐鹽植物的根系中均有侵染，且在苦苣中均占比最高，分別為重度鹽土占49.05%、中度鹽土占7.61%、輕度鹽土占2.670-/0（圖3）。還可以看出，AMF菌種豐富度在3個研究樣地中呈現中度鹽土gt;輕度鹽土gt;重度鹽土的規律，即在中度鹽漬化生境中植物對AMF菌根依賴性最大（圖3）。由于黃蒿根系中能鑒定出的AMF菌種數目最多，且各AMF菌種的相對豐度較其他植物更高，證明在土壤中度鹽漬化生境中，黃蒿對AMF菌種的轉移性較小，容易被AMF侵染，并能與之形成良好且穩定的共生關系。

由表2可知，在重度鹽土研究樣地中，Glomeraceae_ Glomus_ Goomara113b_ G10_2豐度顯著高于其他研究樣地（Plt;0.05），說明該種AMF對根系的侵染能力隨鹽分梯度降低而減弱，且在狗尾草中占比最高，分別為重度鹽土占26.9%、中度鹽土占11.57%、輕度鹽土占2.840%。同樣，Paraglomeraceae_Paraglomus_Alguaci112a_Para-1在3個研究樣地的植物根系中也均有分布，依然呈現相對豐度隨鹽脅迫降低而下降的趨勢。結合圖3和表2，說明Parag1易與苦苣根系建立共生關系，而Glomeraceae_ Glomus_ Goomara113b_ G10_2更易與狗尾草根系建立共生關系，且上述這2種菌在3種鹽分脅迫生境的5種植物根系中抗鹽能力較強。

2.3不同耐鹽植物對AMF群落相似性及組成的影響

通過歐幾里得距離對5種耐鹽植物的根際土壤AMF群落進行聚類分析（圖4），其中，狗尾草和黃蒿可以聚為同一類，蘆葦和堿蓬可以聚為同一類。結果表明，不同種類植物根際土壤對AMF群落產生了一定的綜合影響。狗尾草和黃蒿根際土壤AMF群落最為相似，而耐鹽性較強的蘆葦和堿蓬根際土壤AMF群落也最為相似。

由圖5可知，球囊霉屬（Glomus）在狗尾草和黃蒿的根際土壤中相對豐度最大，分別為61.12%和50.720-/0，說明狗尾草與黃蒿較其他植物更需要AMF的協助才能適應鹽漬化土壤。球囊霉屬（Glomus）在蘆葦和堿蓬中的相對豐度最小，分別為17.13%和8.620-/0，說明蘆葦和堿蓬耐鹽能力較強，與AMF的共生關系較小。

2.4不同耐鹽植物對AMF群落中關鍵物種的響應

對5種耐鹽植物根際土中AMF采用線性判別分析（ IDA）。LDA值用于評估其對觀測組間差異的效應大小，該值越高代表該微生物類群越重要。由圖6可知，在鑒定得到的35個AMF屬中，狗尾草根際土中的關鍵屬為g—Glomus、g—Claroideoglomus、g_Paraglomus，這些屬的LDA值均超過4.0，其中，在狗尾草中，球囊霉屬（Glomus）對AMF群落結構起關鍵性作用。堿蓬和蘆葦根際土中雖然顯示各有一個關鍵屬，但由于高通量分析的局限性，這些屬仍然未能得到鑒定，后續需要其他鑒定手段進行輔佐分析。

3結論與討論

3.1不同鹽分梯度對AMF群落組成及多樣性的影響

AMF可以促進植株體內的滲透調節，提高可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸（ Pro）含量，增加某些氧化酶活性【9】，以此提高植物的抗逆能力。鹽度過高往往會對真菌生長產生不利影響，如部分AMF真菌在植物根系的定殖能力隨鹽濃度的增加而降低；向土壤中添加鹽會抑制真菌菌絲生長，甚至減少菌根菌絲網絡的形成【10】。然而王軍曉【11】研究表明，在設施栽培條件下，相較輕度鹽化土壤，土壤中度鹽化顯著提高了棗根中AMF的物種豐富度和系統多樣性，而輕度鹽化土壤在很大程度上限制了AMF的發育和其與冬棗根系的共生。Sharifi等【12】通過盆栽試驗表明，經鹽預處理的AMF對宿主的促進作用，相對不經鹽預處理有一定程度增加，且不同AMF菌株對鹽脅迫的響應以及對植物的促進程度不同。本研究中重度鹽土與中度鹽土的AMF群落組成最為相似，中度鹽生境中植物根際土的AMF群落多樣性大于重度鹽生境和輕度鹽生境，表明一定鹽濃度有利于AMF在不同生境中生存，這與王軍曉、Sharifi等研究結果相類似。

土壤類型、土壤pH等都會影響AMF群落分布，Oehl等【13】通過調查發現，AMF群落受土壤類型的影響強烈；劉增亮等【14】發現3種不同土壤類型中的AMF群落存在顯著差異。AMF可以改良土壤pH，使土壤pH更接近部分植物適宜生長的需求。李佳齊等【15】研究表明，AMF可以降低或提高土壤pH，使其變得更適宜植物生長。本研究樣地土母質為濱海黏質鹽土，土壤含鹽量較高，通過對3個鹽分梯度中植物根系AMF菌種的相對豐度進行分析，發現在能鑒定的AMF中，Paraglomeraceae_Paraglomus_Alguacill2a_Para_l、Glomeraceae_Glomus_ Goomara113b_ G10_2在3個研究樣地的植物根系中均有分布，相對豐度隨鹽脅迫降低均呈下降趨勢，說明這兩種菌抗鹽能力較強，改善土壤pH的能力也較強。此外，AMF菌種豐富度在3個研究樣地中呈現中度鹽土gt;輕度鹽土gt;重度鹽土的規律。黃蒿根系中能鑒定出的AMF菌種數目最多且各AMF菌種的相對豐度較其他植物更高，表明當鹽脅迫濃度在AMF耐受范圍內時，為保證共生結構物質傳輸的穩定性，其侵染能力有所提高[16]。

3.2不同耐鹽植物對AMF群落組成及多樣性的影響

植物受到鹽脅迫時會啟動一系列的響應機制，如積累滲透調節物質來緩解滲透脅迫[17]。孫健[18]發現，Na+外排能力強的植物耐鹽性也較高。而陳琳等[19]研究表明，蘆葦在鹽脅迫下呈現出較強的Na+外排現象。另外，王永東[20]將從堿蓬的根和根際土壤中分離到的菌接種到玉米中，發現在高鹽環境下菌仍可定植，并顯著改善玉米幼苗的生長和生理特性，減輕其受到的脅迫損傷。

本研究發現球囊霉屬（Glomus）在植物中的相對豐度有差異，AMF的不同相對豐度可能解釋了不同采樣點發現的AMF侵染率差異的原因，表明AMF對宿主有一定的偏好性。AMF對宿主植物的偏好性高，說明AMF對宿主的侵染率較高，反之亦然【21】。

另外，在鑒定得到的屬中，植物的關鍵屬不同，這可能是由于不同科屬植物根系構造具有差異。一般而言，影響AMF群落的主要因素是生境特征和傳播能力【22】，大部分AMF孢子是在土壤中甚至是在植物根中形成的，因此AMF的擴散主要是由侵蝕性風和動物運動介導[23]，這些方式會使AMF分布受到一定程度上的限制，導致AMF能夠選擇性地侵染宿主植物的根系【24]。也可能因為植物在生長過程中通過不同方式為微生物提供不同于非根際土壤的生活環境，從而改變AMF的群落差異【25]。

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收稿日期：2024-11-11

基金項目：天津市重點研發計劃科技支撐重點項目（ 23YFZCSNOOIOO、23YFZCSN00210、15ZCZDSF00410）；天津師范大學研究生科研創新項目（ 2024KYCX0432）

主要作者簡介：張婭（1999-），女，在湊碩士生，主要從事土壤生態學研究工作。E-mail：1915166344@qq.com

通信作者簡介：林靜（1970-），女，高級獸醫師，主要從事畜牧生產、動物疫情防控及科技推廣工作。E-mail： 724154419@ qq.com